Caracterización de exón omitiendo la eficiencia en muestras de pacientes dmd en ensayos clínicos de oligonucleótidos antisales

Resumen

Aquí, presentamos la caracterización molecular de la expresión de la distrofina 38 usando la secuenciación de Sanger, RT-PCR, y la hinchazón occidental en el ensayo clínico.

Resumen

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular degenerativa que causa pérdida progresiva de la masa muscular, lo que conduce a la muerte prematura. Las mutaciones a menudo causan un marco de lectura distorsionado y codones de parada prematura, lo que resulta en una falta casi total de proteína distrofina. El marco de lectura se puede corregir utilizando oligonucleótidos antisrés (AON) que inducen la omisión de exón. Se ha demostrado que el morfolino AON viltolarsen (nombre en clave NS-065/NCNP-01) induce el exón 53 saltándose, restaurando el marco de lectura para pacientes con deleciones exón 52. Recientemente administramos NS-065/NCNP-01 por vía intravenosa a pacientes con DMD en un ensayo exploratorio iniciado por investigador, primero en humano de NS-065/NCNP-01. En este artículo de métodos, presentamos la caracterización molecular de la expresión de distrofina usando la secuenciación de Sanger, RT-PCR, y la hinchazón occidental en el ensayo clínico. La caracterización de la expresión de distrofina fue fundamental en el estudio para mostrar la eficacia ya que no se realizaron pruebas de resultados funcionales.

Introducción

La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una enfermedad muscular degenerativa que causa pérdida progresiva de masa muscular, insuficiencia respiratoria y miocardiopatía, y conduce a la muerte prematura¹. La enfermedad es causada por la falta de la gran distrofina de proteína muscular estructural². Las mutaciones en el gen DMD en el cromosoma X son recesivas, y la enfermedad afecta a 1 de cada 3500-5000 varones recién nacidos^3,,4,,5. Las mutaciones son a menudo grandes deleciones en una región de puntos críticos entre los exones 44 y 55 que conducen a un marco de lectura distorsionado y codones de parada prematura, causando descomposición mediada sin sentido y una falta casi total de proteína distrofina^6,,7,,8. El marco de lectura se puede corregir utilizando oligonucleótidos antisrés (AON) que inducen la omisión de exón y restauran el marco de lectura, restaurando parcialmente la expresión de la distrofina y retrasando la progresión de la enfermedad^9,,10,,11. El morpholino AON eteplirsenn, que fue aprobado recientemente por la Agencia Federal de Medicamentos (FDA), induce la falta del exón 51 y puede restaurar el marco de lectura en pacientes con exón 52 deleciones^12,,13. Sin embargo, exón 53 saltar restaura el marco de lectura para los pacientes con exón 52 deleciones, y potencialmente puede tratar aproximadamente 10% de los pacientes con DMD¹⁴. Se ha demostrado que el fármaco morpholino AON NS-065/NCNP-01 induce el exón 53 saltando en células humanas, y recientemente administramos NS-065/NCNP-01 a pacientes con DMD en un ensayo clínico de fase 1 de escalamiento de dosis de etiqueta abierta (en adelante, denominado "el estudio") (registrado como UMIN: 000010964 y ClinicalTrials.gov: NCT02081625)¹⁴. El estudio mostró un aumento dependiente de la dosis de exón 53 omitiendo basado en los niveles de RT-PCR y proteína distrofina basado en la hinchazón occidental, y no se observaron eventos adversos graves o deserciones¹⁴.

En todos los ensayos clínicos, el análisis de los resultados es de suma importancia. Para los ensayos clínicos de DMD, todavía está en curso un debate sobre el mejor método para mostrar un beneficio de tratamiento. Las pruebas clínicas, como la prueba de caminata de 6 minutos, tienen ciertos inconvenientes. La caracterización molecular de la expresión de distrofina se puede realizar utilizando varios métodos, tales como RT-PCR, qPCR, digital-PCR, hinchazón occidental, e inmunohistoquímica. Sin embargo, el grado de restauración de la expresión proteica que se requiere para impartir un beneficio clínico sigue sin estar claro. En este artículo de métodos, describimos en detalle los métodos RT-PCR e hinchazón occidental utilizados para determinar los niveles de saltos de exones y proteínas, respectivamente, en el ensayo de fase 1 del AON que omite el fármaco NS-065/NCNP-01¹⁴.

Protocolo

El procedimiento operativo para el ensayo iniciado por el investigador ha sido aprobado por el comité ético del NCNP (ID de aprobación: A2013-019).

1. Preparación de muestras musculares

NOTA: Los músculos braquios de biceps o cuádriceps a menudo se seleccionan como sitios de biopsia. Sin embargo, la tibialis anterior se utilizó en el ensayo clínico.

1. Biopsia muscular de pacientes
   1. Marque el lugar de la incisión antes de la preparación de la piel.
   2. Prepare gasa con aguantica para la muestra de biopsia. Apriete bien la gasa.
   3. Inyectar anestesia local en la piel y el tejido subcutáneo, pero no en el músculo. Asegúrese de la profundidad de la anestesia por la ausencia de dolor cutáneo.
      NOTA: La anestesia general se utiliza generalmente en pacientes pediátricos menores de 15 años.
   4. Haga una incisión desde la piel hasta el tejido subcutáneo. Utilice pequeños retractores para abrir la incisión y separar la grasa subcutánea.
      NOTA: En este paso, una parte de la piel se puede cortar para el cultivo de fibroblastos.
   5. Haga otra pequeña incisión en la fascia y corte aún más la fascia. Sujete los bordes usando fórceps de mosquitos para exponer el músculo.
   6. Usa una sutura para levantar la parte seleccionada del músculo. Haz un pequeño túnel usando tijeras Iris e inserta fórceps de mosquitos en el túnel.
   7. Separe el haz muscular usando fórceps y corte ambos extremos de la porción objetivo.
      NOTA: Las muestras de biopsia muscular deben ser del tamaño de un lápiz para pacientes adultos (longitud 1,0-1,5 cm, diámetro 0,8-1,0 cm). El espécimen debe tener alrededor de 1 cm de longitud y 5 mm de diámetro en pacientes pediátricos.
   8. Envuelva la muestra en una gasa con aguantica y transporte el músculo fresco a temperatura ambiente (RT) inmediatamente a una instalación donde la muestra pueda prepararse para su posterior análisis.
      NOTA: Los especímenes deben transportarse a 4oC si la duración del transporte supera la 1 hora.

2. Preparación de la muestra muscular

1. Mezclar volúmenes iguales de goma de mascar y agua hasta que la encía se vuelva suave y pegajosa. Cargue la mezcla en jeringas de 25 ml. Las jeringas se pueden guardar en nevera.
2. Coloque aproximadamente 0,5 a 1 cm de goma de mascar tragacante en los discos de corcho. Etiquete los discos en el lado opuesto.
3. Coloque un recipiente de isopentano en nitrógeno líquido hasta que parte del líquido se congele.
4. Coloque el espécimen en la goma de mascar. El eje longitudinal de cada músculo debe ser perpendicular al corcho. Coloque la encía alrededor de la parte inferior de cada músculo para ayudar a la colocación adecuada.
5. Usando pinzas, coloque la muestra de músculo/corcho en isopentano frío preparado en el paso 2.3 para congelar. Mueva el espécimen constantemente durante 1 min o hasta que esté completamente congelado, y colóquelo sobre hielo seco temporalmente.
6. Colocar la muestra en viales de vidrio y conservar a -80 oC.

3. Seccionamiento muscular

1. Configure el criostato para secisar con una temperatura de trabajo de -25 oC.
2. Monte el corcho/bloque muscular y recorte hasta que se logren secciones planas.
3. Utilice un espesor de sección de 10 m para RT-PCR e hinchazón occidental. Utilice un espesor de 6-8 m y 10-12 m para la inmunohistoquímica o la tinción de hematoxilina y eosina, respectivamente. Coloque las secciones cortadas en tubos de 2,0 ml y guárdelos a -80 oC para RT-PCR e hinchazón occidental.

4. Extracción de ARN y reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR)

1. Extraiga aproximadamente 10 rodajas con un espesor de 10 m del músculo congelado por un criostato. Recoger el ARN total purificado utilizando el kit de purificación del ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro.
3. Combine los reactivos necesarios para una reacción RT-PCR en tubos PCR según la Tabla 1. Consulte la Tabla 2 para las secuencias de imprimación.
   NOTA: La imprimación delantera fue 44F para el paciente NS-03 y 46F para el paciente NS-07. La imprimación inversa era 54/55R por defecto. Si los productos no específicos eran evidentes, 54R se utilizaba como alternativa.
4. Coloque los tubos pcR que contienen la mezcla en un termocicrador. Ejecute el termocicrador según la Tabla 3.
5. Almacene el producto PCR a 4 oC para almacenamiento a corto plazo o -20 oC para almacenamiento a largo plazo.

5. Electroforesis de microchip y cálculo de exón omitiendo

NOTA: A menudo se selecciona un sistema de electroforesis de microchip (MCE) para analizar la eficiencia de salto de exón. En este protocolo, describimos los pasos necesarios para analizar la eficiencia de salto de exón utilizando un sistema MCE por el fabricante A, así como por el fabricante B, en lo sucesivo llamado sistema A y B. Durante el ensayo clínico, se analizó la eficiencia de salto de exón en el sistema A. Sin embargo, el sistema A ya no está a la venta, y recomendamos el sistema B para analizar la eficiencia de saltos de exón. Hemos incluido protocolos para ambos sistemas (ver sección 5.1 para el sistema A y 5.2 para el sistema B). Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre los sistemas A y B. Además, este paso también se puede realizar con electroforesis de gel de agarosa normal, pero la sensibilidad disminuye notablemente.

1. Electroforesis de microchip utilizando el sistema A
   NOTA: El sistema A tiene dos tipos de chips. Aquí, describimos los pasos para el chip de ADN.
   1. Reactivos del kit de equilibrio (tampón de manchas, tampón de carga, escalera y tampón de gel) a RT, vórtice y giro hacia abajo.
   2. Para preparar el tampón de la mancha de gel (GS), añada 12,5 ml de tampón de manchas a 250 ml de tampón de gel y vórtice durante 10 s. Mueva la solución a un tubo de filtro de centrifugado y centrífuga a 2.400 x g durante 15 minutos. Deseche el filtro.
      NOTA: El GS filtrado se puede almacenar a 4 oC durante 1 mes.
   3. Si las muestras están altamente concentradas, diluya a aproximadamente 50 ng/L con tampón TE o agua libre de DNase.
      NOTA: Si las muestras se encuentran en una concentración de sal de 200 mM de KCl (o NaCl) y/o de 15 mM de MgCl_2,cambie el tampón.
   4. Añadir 12 l de solución GS al pozo de cebado de gel (resaltado y etiquetado GS) del chip de ADN y colocar el chip en la estación de cebado.
      NOTA: Para evitar burbujas de aire, inserte la punta de la pipeta verticalmente y en la parte inferior del pozo al dispensar. Dispensar lentamente hasta la primera parada de la pipeta y no expulsar el aire al final del paso de pipeteo.
   5. Seleccione el modo C3 y pulse el botón Inicio. Una vez completado el cebado, retire el chip.
   6. Inspeccione visualmente los microcanales en busca de burbujas de aire atrapadas o cebado incompleto.
   7. Cargue las muestras preparadas y la escalera en el chip como se muestra a continuación.
      1. Pipetear 9 l de solución de GS en los otros 3 pomos GS.
      2. Pipetear 5 l de tampón de carga en el pozo L y en cada pozo de muestra (1-11).
      3. Pipetear 1 l de escalera en el pozo L.
      4. Pipetear 1 l de muestra de ADN en cada uno de los 11 pozos de muestra.
      5. Pipetear 1 l de agua TE o DNase en cualquier pozo no utilizado. La guía rápida del kit muestra una figura del diseño de la viruta.
         NOTA: Inspeccione todos los pozos en busca de burbujas de aire sosteniendo el chip sobre un fondo de color ligero. Desaloje las burbujas de aire atrapadas en la parte inferior de un pozo con una punta de pipeta limpia o retirando y recargando la solución.
   8. Coloque el chip en la estación de vórtice y pulse Mezclar. La estación de vórtice se detiene automáticamente después de 1 min.
   9. Ejecute el chip en la estación de electroforesis dentro de los 5 minutos de carga.
   10. Seleccione Nueva ejecución en la barra de herramientas del software. En la pantalla Nueva ejecución, seleccione ADN y ADN 1K en la lista desplegable Ensayo.
   11. Seleccione una carpeta de proyecto para la ejecución en la lista desplegable Proyecto o cree una nueva carpeta de proyecto introduciendo un nombre en el campo Proyecto.
   12. Escriba un nombre para la ejecución en el campo Ejecutar prefijo y haga clic en Iniciar ejecución.
   13. El instrumento suena cuando se completa el análisis y se abre una ventana que indica el final de la ejecución. Seleccione Aceptar y retire el chip de la plataforma de chip.
   14. Seleccione Archivo ?? Exportar datos para exportar los datos. Seleccione las opciones deseadas en el diálogo Exportar.
   15. Para limpiar los electrodos, llene un chip de limpieza con 800 l de agua desionizada y colóquelo en la plataforma del chip, cierre la tapa y déjelo cerrado durante 1 min. Después de 1 min, abra la tapa, retire el chip de limpieza y deje que los electrodos se sequen durante 1 min.
2. Electroforesis de microchip utilizando el sistema B
   1. Abra el software operativo e introduzca la información de muestra. Después de introducir la información, el software calcula automáticamente la cantidad de soluciones de búfer y marcador de separación.
   2. Prepare la cantidad necesaria de búfer de separación calculado por el software. En primer lugar, preparar la solución de tinción de gel de ácido nucleico 100x diluyendo 10.000x solución con la cantidad adecuada de tampón TE. La solución 100x se puede almacenar a -20 oC.
   3. Mezclar una cantidad adecuada de 100x de mancha de gel de ácido nucleico con tampón de deseparación en el tubo específico proporcionado por la empresa para preparar una solución 1x. Vórtice la solución.
   4. Prepare la cantidad necesaria de solución de marcador en el tubo.
   5. Inicie el programa de lavado de sondas.
   6. Inicie el programa de lavado de microchip cuando haya terminado.
   7. Simultáneamente, pipetee las muestras a una multiplaca PCR (96-bien, transparente) y diluya 4 veces con agua desionizada. El volumen mínimo que puede manejar la máquina es de 6 l, y el máximo es de 30 l. Sugerimos un volumen total de 10 l (2,5 ml de muestra y 7,5 l de agua/Tampón TE).
   8. Cubra las placas con láminas adhesivas de papel de aluminio PCR y gire hacia abajo las muestras.
   9. Establezca la placa, la solución de marcador y el búfer de separación 1x en la máquina de acuerdo con la ubicación mostrada por la máquina. Pulse el botón Inicio.
   10. Una vez finalizada la ejecución, exporte los datos de resultados como un archivo .csv desde el software y calcule la eficiencia de salto de exón utilizando la concentración molar de la siguiente manera:
       Exón saltando eficiencia (%) á (Banda omitida / (Banda omitida + Banda no omitida) X 100

6. Secuenciación complementaria del ADN (ADNc)

1. Preparación de gel de agarosa
   1. Mida 1,5 g de agarosa en polvo y mezcle el polvo con 100 ml de tampón 1x TAE en un matraz microwavable (lo que resulta en un gel de agarosa del 1,5%).
   2. Microondas durante 1-3 min hasta que la agarosa se disuelva por completo.
      NOTA: No sobrevuelo la solución, ya que parte del tampón se evaporará y alterará el porcentaje final de agarosa del gel.
   3. Deje que la solución de agarosa se enfríe a unos 50 oC.
   4. Añadir 10 l 10,000x de colorante de ácido nucleico fluorescente a la solución de agarosa.
   5. Vierta la agarosa en una bandeja de gel con el peine de pozo en su lugar. Dejar en RT durante 20-30 min hasta que se haya solidificado por completo.
2. Secuenciación
   1. Mezcle 5 l del producto RT-PCR (del paso 4.4) y 1 l del búfer de carga 6x. Cárgalos en los pozos del 1,5% de gel de agarosa.
   2. Ejecute el gel a 135 V durante 5 min y 120 V durante 20 min.
   3. Visualice las bandas utilizando un transiluminador según el protocolo del fabricante.
   4. Bandas especiales de interés del gel y utilizar un kit de limpieza de gel y PCR para recuperar productos RT-PCR.
   5. Mida la concentración utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: La banda purificada se puede enviar para su secuenciación en una empresa o instalación de secuenciación si no hay equipo de secuenciación de Sanger disponible internamente.
   6. Prepare los reactivos necesarios para un kit de secuenciación de ciclo y pipeteo en una placa PCR multiplaca según la Tabla 4. Consulte la Tabla 2 para las secuencias de imprimación.
   7. Selle la placa con una película adhesiva transparente.
   8. Vórtice la placa para 2 a 3 s. Centrifugar brevemente en una centrífuga de cubo oscilante para que el contenido se asiente en el fondo de los pozos (5 a 10 s) a 1.000 x g.
      NOTA: Las burbujas de aire pueden estar presentes en los pozos, pero no afectan negativamente a la reacción.
   9. Coloque la mezcla en un termocicrador y corra de acuerdo con la Tabla 5.
   10. Purifique las reacciones de secuenciación con placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   11. Utilice un analizador de ADN para determinar las secuencias de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   12. Compare la secuencia obtenida con la secuencia esperada del paciente.

7. Hinchazón occidental

1. Preparación de muestras
   1. Preparar el tampón de muestra SDS (4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoetanol, 10% glicerol, 70 mM Tris-HCl pH 6.4, 0.001% azul bromofenol e inhibidor de la proteasa).
   2. Colocar alrededor de 100 rebanadas de las secciones musculares de 10 m recogidas de la crioseción en 150 l de tampón SDS.
   3. Homogeneizar brevemente las muestras de proteínas sobre hielo durante 30 s utilizando un práctico micro homogeneizador.
   4. Centrifugar a 16.500 g durante 15 min, y transfiera el sobrenadante a un tubo fresco. Continúe con el análisis o almacene a -80 oC.
2. SDS-PAGE para la medición de la concentración de proteínas
   NOTA: Se utilizó una mancha de gel fluorescente para determinar la concentración de proteínas.
   1. Determinar el peso normal de la muestra de control saludable y la concentración utilizando el kit de ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Prepare las muestras para la electroforesis de gel. Pipetear 10 g de proteína total del control saludable y 5 l de las muestras del paciente, 5 l de tampón de muestra 4x, 2 l de agente reductor de muestra 10x. Una vez mezclados, añadir agua desionizada a un volumen final de 20 ml en cada muestra.
   3. Caliente las muestras a 70oC durante 10 min.
   4. Prepare 2.000 ml de búfer de ejecución SDS 1x utilizando 50 ml de búfer de ejecución SDS de 40x. Diluir con 1.950 ml de agua desionizada.
      NOTA: En este punto, 1.000 ml de búfer en ejecución es suficiente. El búfer de 1.000 ml restante se utiliza en el paso 7.3.1.
   5. Mezclar a fondo y reservar 800 ml del tampón de funcionamiento 1x SDS para su uso en la cámara tampón inferior (externa) de la caja de gel.
   6. Inmediatamente antes de la electroforesis, agregue 500 ml de tampón antioxidante a 200 ml de tampón de funcionamiento 1x SDS para usar en la cámara tampón superior (interior) de la caja de gel.
   7. Prepárese para la electroforesis de gel mediante la configuración de un 3-8% de gel de acetato De Tris de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cargue 20 ml de cada muestra en el gel.
   8. Realizar electroforesis a 150 V durante 75 min.
   9. Después de la electroforesis, coloque el gel directamente en una bandeja limpia que contenga 50 ml de solución de manchas de gel fluorescente.
   10. Cubra la bandeja, colóquela en una coctelera y agite sin salpicaduras de líquido ni dañar el gel durante 90 minutos.
   11. Transfiera el gel al agua antes de tomar imágenes en un sistema de fluorescencia con una iluminación de 312 nm con filtro de emisión de bromuro de etidio para detectar la fluorescencia.
   12. Mida las concentraciones de las muestras del paciente en función de una curva analítica construida utilizando el lito de control normal con concentración conocida.
3. SDS-PAGE para la hinchazón occidental
   1. Prepare la caja de gel de acuerdo con los pasos 7.2.4-7.2.6.
   2. Sobre la base de la medición de la concentración obtenida en el paso 7.2.11, cargue 100 g por carril de un solote de control saludable y 300 g por carril de la muestra del paciente. Electroforoso utilizando los mismos ajustes que el paso 7.2.7.
4. Transferencia de proteínas
   1. Prepare el búfer de transferencia. Remoje una membrana PVDF durante 20 s en metanol. Muévalo al búfer B de hinchazón hasta su uso.
   2. Sumerja un papel extra grueso en el búfer A, B y C de hinchazón durante al menos 30 minutos por búfer.
   3. Después de la electroforesis, remoje el gel en el tampón B durante 5 min.
   4. Coloque los papeles hinchantes, la membrana PVDF y el gel en la máquina de transferencia semisequera de acuerdo con el dibujo de la Figura 1. Despliegue burbujas de aire entre el gel y la membrana con un rodillo.
   5. Transfiera a 2 mA/cm² membrana durante 1 h en RT.
      NOTA: Después de la transferencia, se recomienda realizar una mancha de proteína total similar a la tinción de Ponceau para confirmar la transferencia exitosa de las proteínas de gran peso molecular.
5. Bloqueo y tinción de anticuerpos
   1. Enjuague la membrana dos veces con PBST (1x PBS con 0,1% Tween 20).
   2. Coloque la membrana en un agente de bloqueo del 1% y mece suavemente durante 1 h en RT para bloquear.
   3. Incubar la membrana con anticuerpos antidestrofina en solución de bloqueo (1:125) y anticuerpos antiespectrina (1:25.000) durante 1 h a RT o durante la noche a 4oC.
   4. Lave la membrana tres veces durante 10 minutos cada una con PBST en RT.
   5. Incubar la membrana con anticuerpos antiratón/conejos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) en PBST (1:100) durante 40 min en RT.
   6. Lave la membrana de nuevo tres veces durante 10 minutos con PBST en RT.
6. Detección
   1. Mezclar las soluciones de detección A y B en una proporción de 1:1. El volumen final del reactivo de detección requerido es de 0,1 ml/cm² membrana.
   2. Retire el exceso de PBST de la membrana lavada y colóquelo con el lado proteico hacia arriba en una hoja de envoltura de plástico u otras superficies limpias adecuadas. Añadir el reactivo de detección mixta a la membrana e incubar durante 5 minutos en RT.
   3. Retire el reactivo de detección en exceso sosteniendo la membrana suavemente en fórceps y tocando el borde contra un tejido.
   4. Coloque el lado de la proteína de la mancha hacia arriba en una bandeja de muestra. Operar el sistema fluorescente de acuerdo con la documentación del usuario. Ajuste la máquina de la siguiente manera. Tipo de exposición: Incremento, Intervalo de tiempo: 10 s, Sensibilidad/Resolución: alta.
      NOTA: Las áreas medidas se encuadron con un rectángulo azul(Figura 4a-b): BG: fondo; D: distrofina 427 kDa, SL: isoforma larga spectrin beta (274 kDa); SS: isoforma corta (253 kDa). La relación de señal de distrofina/espectrina se calculó como (D-BG)/[(SL-BG) + (SS-BG)]. La relación de control normal se estableció en 100%.

Resultados

Para utilizar RT-PCR para detectar saltos de exón, los imprimadores a ambos lados del exón que se omitirán se diseñaron y evaluaron para producir solo bandas específicas (consulte la Figura 2 para obtener un diagrama esquemático de saltos de exón y posición de imprimación). Las imprimaciones deben generar productos que se puedan distinguir fácilmente por el tamaño en un sistema MCE o electroforesis de gel de agarosa normal si MCE no está disponible. Figura 3a muestrael sistema MCE Imágenes de gel de reacciones RT-PCR y los resultados de secuenciación de la banda omitida de los pacientes NS-03 y NS-07 antes y después del tratamiento con NS-065/NCNP-01 en el ensayo de fase 1 de escala de dosis. NS-03 y NS-07 harbor eliminaciones que abarcan exons 45-52 y 48-52, respectivamente. NS-03 recibió 5 mg/kg y NS-07 20 mg/kg de NS-065/NCNP-01 semanalmente durante 12 semanas. Como se esperaba antes del tratamiento, ambos pacientes no mostraban saltar, y sólo se podía visualizar una banda no omitida. Después de 12 semanas de tratamiento, se visualizó una banda inferior clara omitida para NS-07. Sin embargo, todavía era difícil detectar cualquier producto omitido para el paciente NS-03. Los resultados de la secuenciación mostraron una concatenación de exones 47 y 54 para NS-07, así como exones 44 y 54 para NS-03. Según la secuencia, estos teóricamente podrían producir una isoforma de distrofina funcional pero acortada. Para calcular el porcentaje de omisión que se muestra en la Figura 3b, la concentración molar de la banda omitida se dividió por la banda omitida y no omitida. Para el paciente NS-07, el porcentaje después del tratamiento fue del 72%, y fue del 3,4% para NS-03. Los datos de western blot (en triplicado) de los pacientes NS-03, NS-07, y un control saludable se muestran en la Figura 4a. Se esperaba que no se detectara ninguna banda de distrofina antes del tratamiento. Después del tratamiento se detectó una banda del paciente NS-07 con un menor peso molecular en comparación con un control saludable (la distrofina de tipo salvaje tiene un peso molecular de 427 kDa, y la distrofina NS-07 tiene un peso molecular de 389 kDa). Debido a la deleción y saltos de exones, la isoforma de la distrofina del paciente NS-07 carecía de varios exones, y se esperaba que tuviera un menor peso molecular. El paciente NS-03 no mostró niveles detectables de distrofina después del tratamiento. En la Figura 4b, se muestra la cantidad de distrofina en comparación con un control saludable para el paciente NS-07. La ubicación donde se midieron las intensidades de la señal para el cálculo de la restauración de la distrofina se indican con cuadrados azules. La relación de espectrina de distrofina se utilizó para calcular la cantidad de distrofina en comparación con la del control saludable. Con este fin, la señal del fondo distrofina menos se dividió por la suma de las dos isoformas de spectrin (largo y corto) menos el fondo (véase el paso 8.6.5). La relación de control saludable se estableció en 100%. La cantidad de distrofina en comparación con el control saludable en el paciente NS-07 después del tratamiento fue del 9,1%. Sin embargo, el porcentaje no se pudo calcular para el paciente NS-03 debido a una banda de distrofina débil, que similar a las obtenidas para muestras de tratamiento previas para ambos pacientes.

Figura 1: Diagrama esquemático de la pila de transferencia para el análisis de manchas occidentales. Montaje de la pila de transferencia de manchas occidentales con papel hinchado empapado en el tampón A en la parte inferior seguido de papel hinchado empapado en el tampón B, membrana PVDF, el 3-8% Tris-Acetate Gel y en la parte superior 2 papeles de hinchazón empapados en el tampón C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Dibujo esquemático de exón omitiendo el exón 53 en un paciente con deleción de exón 45-52 en el gen DMD. Por ejemplo, el paciente NS-03 en el ensayo clínico de aumento de dosis tuvo esta deleción. Si se conserva el exón 53, el ARNm estará fuera de la trama ya que la unión exón-exón entre el exón 44 y el 53 interrumpe el marco de lectura, causando un codón de parada en el exón 53. El marco de lectura se restaura cuando se omite el exón 53, y se produce una isoforma más corta de distrofina. Para detectar exón 53-skipping por RT-PCR, se utilizan imprimaciones en exón 44 y 54 para que el producto PCR entre el ARNm omitido y no saltado pueda detectarse fácilmente. FWD: imprimación delantera, REV: imprimación inversa, PMO: fósforodamidate morpholino oligómero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Saltar la eficiencia para los pacientes NS-03 y NS-07 de las muestras de biopsia muscular anterior tibialis. a) Imagen de gel generada por el sistema de electroforesis A de muestras RT-PCR de muestras no tratadas y tratadas de pacientes NS-03 y NS-07. El panel superior muestra NS-03 y el panel inferior NS-07 en triplicado. Para NS-03, la banda no saltada es 422 bp, y la banda omitida es 212 bp. Para NS-07, las bandas son 836 bp y 624 bp, respectivamente. El análisis de secuencia mostró una concatenación de exón 44 y exón 54 para NS-03 y exón 47 a exón 54 para NS-07. b) Se muestra la eficiencia de omisión antes y después del tratamiento para los pacientes NS-03 y NS-07, calculado a partir de la concentración molar de las dos bandas proporcionadas por el sistema A como banda omitida/(banda omitida + banda no saltada) x 100. La eficiencia de salto para NS-03 fue muy baja después del tratamiento; para NS-07, la eficiencia de salto fue superior al 70%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cuantificación de proteínas de las isoformas de la distrofina antes y después de que el exón omita la terapia. a) Cuantificación de proteínas de isoformas distrofinas antes y después de la terapia de exón omitiendo la terapia. Mancha occidental de biopsia muscular de tibialis anterior de los pacientes NS-03 y NS-07 antes y después del tratamiento y de control saludable en triplicado. La distrofina se puede ver a 427 kDa para el control saludable y a 389 kDa para NS-07 después del tratamiento. No se pudo detectar distrofina para ninguno de los pacientes antes del tratamiento, o tampoco se pudo detectar después del tratamiento para el paciente NS-03. El área de la caja negra se muestra en la Figura 4b. A la izquierda en cada mancha se muestra el marcador. b) La cantidad de distrofina restaurada después del tratamiento para el paciente NS-07. La restauración de la distrofina se calculó sobre la base de las intensidades de las bandas para la distrofina, el fondo, y la isoforma larga y corta de la espectrota según la fórmula: (distrofina - fondo)/(espectro L -fondo) + (espectro S - fondo) donde la relación para el control saludable se establece en 100%. La intensidad de cada banda se midió dentro de las cajas azules que se muestran en la figura. La restauración de la distrofina para NS-07 fue del 9,1% después del tratamiento. La señal de distrofina era demasiado débil para medir en las muestras no tratadas. Los tamaños de los marcadores se muestran en kilodaltons. Didárate: Distrofina, BG: fondo, SL: Isoforma larga de Spectrin, SS: Isóforma corta Spectrin, Mi: Miosina tipo 1. Los tamaños de los marcadores se muestran en kilodaltons. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución	Volumen/Reacción (l)	Concentración final
Agua libre de RNase (siempre)	Variable	-
5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer	5.0	1x
dNTP Mix (que contiene 10 mM de cada dNTP)	1.0	400 M de cada dNTP
Imprimación delantera (10 m)	1.5	0,6 M
Imprimación inversa (10 m)	1.5	0,6 M
QIAGEN OneStep RT-PCR Mezcla de enzimas	1.0	-
Inhibidor de la RNase (opcional)	Variable	5–10 unidades/reacción
Plantilla ARN	50 ng
Total	25

Tabla 1: Reactivos RT-PCR. Los compuestos necesarios para una reacción del RT-PCR.

Cartilla	Secuencia
44F	5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3'
46F	5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3'
48F	5'-CCAAGAAGGACCATTTGACG-3'
54/55R	5'-TCTCGCTCACTCACCCTTTT-3'
54R	5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3'

Tabla 2: Lista de primer plano. Secuencias para las imprimaciones utilizadas en este estudio. F: Adelante, R: Invertir.

1 ciclo	Transcripción inversa	30 min	50 oC
1 ciclo	Paso inicial de activación de PCR	15 min	95 oC
35 ciclos	Desnaturalización	1 min	94 oC
	Recocido	1 min	60 oC
	Extensión	1 min	72 oC
1 ciclo	Extensión final	7 min	72 oC
Mantener		∞	4 oC

Tabla 3: PCR acondicionado utilizado. Mostrar las condiciones de PCR para la reacción RT-PCR.

Solución	Volumen/Reacción (l)
Agua sin RNase	Variable
BigDye Terminator 3.1 Ready Reaction Mix	3.5
Primer delantero/Primer inverso (3,2 m)	2.0
Plantilla ARN	20 ng
Total	20

Tabla 4: Reactivos necesarios para la reacción de secuenciación. Utilice la imprimación forward o Reverse en la configuración, no ambas al mismo tiempo.

1 ciclo	1 min	96 oC
25 ciclos	10 s	96 oC
	5 s	50 oC
	4 min	60 oC
Mantener	∞	4 oC

Tabla 5: Condiciones de PCR para la secuenciación de Sanger.

Discusión

Los ensayos clínicos de DMD han producido éxitos y fracasos en los últimos años. Tanto RT-PCR como la hinchazón occidental son técnicas comunes para evaluar la eficiencia de salto generada por los compuestos exones-salto administrados a los pacientes. Sin embargo, RT-PCR se ha informado de sobreestimar la eficiencia de omisión en comparación con pcR digital¹⁵. Aunque esto se debe a una serie de razones, es causada principalmente por la amplificación más eficiente de los fragmentos saltados más pequeños durante los ciclos de PCR. Parece que RT-PCR utilizado en este ensayo clínico también generó mayores eficiencias de omisión en comparación con la expresión de proteína estimada por la hinchazón occidental. Según la FDA, esta es una manera más confiable de cuantificar la restauración de la distrofina¹². Por lo tanto, se debe tener precaución al interpretar los resultados de saltar RT-PCR; sin embargo, las muestras todavía se pueden comparar. Las muestras que muestran mayores eficiencias de omisión basadas en los resultados de RT-PCR comúnmente exhbit niveles más altos de expresión de proteínas en los análisis de manchas occidentales.

Dado que todos los pacientes en ensayos clínicos de DMD no tienen el mismo patrón de eliminación, puede ser difícil diseñar imprimaciones y sondas que sean adecuadamente específicas para realizar digitales o qPCR en todas las muestras. Por lo tanto, RT-PCR sigue siendo una buena alternativa para una primera evaluación de la eficiencia de omisión. Antes de que comenzara el ensayo clínico de NS-065/NCNP-01, era tedioso evaluar la eficiencia de omisión para cada paciente in vitro, ya que una biopsia muscular o de piel era obligatoria para generar mioblastos específicos del paciente. Sin embargo, recientemente hemos publicado una novedosa técnica para generar células derivadas de orina (UDC) convertidas por MYOD1 específicas del paciente como un novedoso modelo de células musculares DMD^{modelo 16}. Por lo tanto, sólo se requiere orina del paciente para generar los mióblastos, y no es necesario ningún procedimiento invasivo. Creemos que este método se puede utilizar para detectar diferentes AONs en células específicas del paciente. Además, se pueden probar diferentes imprimaciones y sondas antes de que el paciente comience cualquier ensayo clínico. Esto puede facilitar el uso de qPCR o PCR digital para la medición de saltos exones en ensayos clínicos de DMD en el futuro.

Para realizar análisis de manchas occidentales en este ensayo clínico, se utilizó un solo anticuerpo contra la distrofina, y solo se utilizó un control saludable como muestra de referencia. Por lo tanto, la especificidad del anticuerpo no se validó adecuadamente. Esto, junto con el hecho de que el anticuerpo sólo reconoce el dominio C-terminal de la distrofina, es una limitación del protocolo. Más controles saludables y anticuerpos dirigidos contra diferentes dominios de la molécula de distrofina son recomendables en el futuro.

Aquí, resumimos los protocolos que se utilizaron en el reciente ensayo exploratorio iniciado por el investigador, primero en humanos de NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 es potencialmente aplicable al 10,1% de los pacientes con DMD.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Escalera de ADN de 100 bp	Takara	3407A	solución de marcador para MultiNA
1mol/l-Tris-HCl Solución tampón (pH 7.6)	Nacalai	35436-01
2-mercaptoetanol	Nacalai	21418-42
2-metilbutano (isopentano)	Sigma-Aldrich	15-2220
5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo	Falcon	352235
6&veces; Tampón de carga	Takara	9156
Agarosa ME	Iwai químico	50013R
Analizador de ADN Applied Biosystems 3730 Applied	Biosystems	A41046
BD Matrigel Matrix	BD Biosciences	356234
BigDye Terminator v3.1 Kit de secuenciación de ciclos	Applied Biosystems	4337455
Albúmina sérica bovina solución	Sigma-Aldrich	A8412
Azul de bromofenol	Nacalai	05808-61
Centri-Sep 96-Platos de pocillos	Applied Biosystems	4367819
Cóctel de inhibidores de proteasa cOmplete	Roche	4693116001
DMEM/F-12	Gibco	11320033
ECL Prime Reactivo de bloqueo	GE healthcare	RPN418
ECL Prime Western Blotting Reactivo de detección	Healthcare RPN2232
Endo-Porter	GeneTools	2922498000
Experion Estación de electroforesis automatizada	Bio-Rad	7007010	Sistema de electroforesis Microchip A
Experion Kit de análisis de ADN 1K para 10 chips	Bio-Rad	7007107JA
Experion Estación de cebado	Bio-Rad	7007030
Experion Vortex Station II	Bio-Rad	7007043
Papel de filtro de transferencia extra grueso	Bio-Rad	1703965
EzBlot	Atto	AE-1460
GelRed Tinción de gel de ácido nucleico	Biotium	41003
vial de vidrio	Iwaki	1880 SV20
Glicerol	Nacalai	17045-65
Histofine Tinción simple MAX PO	Nichirei	424151
Suero de caballo	Gibco	16050122
Membrana de transferencia Immobilon-P	Millipore IPVH304F0
ITS Suplemento de medios líquidos	Sigma-Aldrich	I3146
Metanol	Sigma-Aldrich	34860
MicroAmp Película adhesiva transparente	aplicada Biosystems	4306311
MultiNA	SHIMADZU	MCE-202	Sistema de electroforesis con microchip B
Multiplaca Placas de PCR de 96 pocillos	Bio-Rad	mlp9601
NanoDrop One Microvolumen Espectrofotómetro UV-Vis con Wi-Fi	Thermo Scientific	ND-ONE-W
NovocastraTM Anticuerpo monoclonal liofilizado de ratón distrofina (C-terminal)	Leica biosystems	NCL-DYS2
NovocastraTM Anticuerpo monoclonal liofilizado de ratón Spectrin	Leica biosystems	NCL-SPEC1
NuPAGE 3-8% Tris-Acetato Protein Gels	Invitrogen	EA03785BOX
NuPAGE Antioxidante	Invitrogen	NP0005
NuPAGE LDS Sample Tampón	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Agente reductor de muestras	Invitrogen	NP0009
NuPAGE Tris-Acetato SDS Tampón de funcionamiento	Invitrogen	LA0041
Oriole Tinción de gel fluorescente	Bio-Rad 1610496
PBS	Gibco	10010023
solución de penicilina-estreptomicina estabilizada	Sigma-Aldrich	P4458
Physcotron Microhomogeneizador práctico	MICROTEC	NS-310E3
Pierce Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Scientific	23227
Reactivo de infección / transfección de polibreno	Sigma-Aldrich	TR-1003
Solución de tinción de yoduro de propidio	BD Pharmingen	556463
QIAGEN OneStep Kit RT-PCR	Qiagen	210212
RNeasy Mini Kit de Tejido Fibroso	Qiagen	74704
SDS	Nacalai	31606-75
Máquina de transferencia semiseca	Bio Craft	41-1293
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494	para MultiNA
TAE Buffer	Nacalai	35430-61
Goma Tragacantth	Wako	200-02245
Tampón Tris-EDTA	Nippon Gene	316-90025	para
MultiNA Tripsina-EDTA (0.05%)	Gibco	25300054
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
Urea	Nacalai	35907-15
Wizard SV Gel y sistema de limpieza PCR	Promega	A9281
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001