En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.
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Artículo de método
Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento terapéutico bien establecido para la diabetes tipo 1. La cápsula renal es el sitio más utilizado para el trasplante de islotes en modelos de roedores. Sin embargo, la cápsula renal apretada limita el trasplante de islotes suficientes en animales grandes y humanos. Se encontró que el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT), un nuevo espacio subcutáneo, era un sitio potencialmente valioso para el trasplante de islotes. Este sitio tiene mejor suministro de sangre que otros espacios subcutáneos. Además, el ISWAT acomoda una masa de islotes más grande que la cápsula renal, y el trasplante en ella es simple. Este manuscrito describe el procedimiento de aislamiento y trasplante de islotes de ratón en el sitio ISWAT de los receptores de ratones diabéticos singéricos. Usando este protocolo, los islotes pancreáticos murinos fueron aislados por la digestión de la colagenasa estándar y se utilizó un hidrogel de matriz de membrana del sótano para fijar los islotes purificados en el sitio ISWAT. Los niveles de glucosa en sangre de los ratones receptores se monitorizaron durante más de 100 días. Los injertos de islotes fueron recuperados en el día 100 después del trasplante para análisis histológicos. El protocolo para el trasplante de islotes en el sitio ISWAT descrito en este manuscrito es simple y eficaz.
Introducción
La incidencia y prevalencia mundial de la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) está aumentando rápidamente, según los datos estadísticos de la Federación Internacional de Diabetes (FID)1. El trasplante de islotes es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de T1DM4. Dado que se informó del gran avance realizado en el trasplante clínico de islotes utilizando el protocolo Edmonton2, la supervivencia del injerto de islotes en funcionamiento en receptores de T1DM después de 5 años ahora alcanza aproximadamente el 50%3.
En el pasado, se exploraron varios sitios de trasplante, como el hígado, la cápsula renal, el bazo, la región intramuscular, el espacio subcutáneo, la médula ósea y la bolsa omental para el trasplante experimental de islotes5,6,7. Algunos de los sitios anteriores han sido probados en entornos clínicos8. Aunque el trasplante de islotes en el hígado sigue siendo el método más utilizado en la aplicación clínica en la actualidad9,hay varios problemas importantes para abordar cuando se utiliza este sitio. Por ejemplo, cómo reducir la pérdida temprana de los islotes trasplantados causada por la reacción inflamatoria mediada instantánea en sangre (IBMIR) y el suministro de mala oxigenación10,11 y cómo recuperar los injertos de islotes si es necesario, porque se localizan difusamente en el hígado. La cápsula renal puede ser un sitio ideal para los receptores de roedores. Sin embargo, la cápsula renal apretada limita el trasplante de suficientes islotes alogénicos en humanos, aunque puede ser un mejor ajuste para el xenotrasplante de islotes debido a las preparaciones de islotes porcinos altamente purificadas utilizadas clínicamente5,12. Por lo tanto, la búsqueda de un sitio más adecuado para el trasplante de islotes está en curso.
El espacio subcutáneo puede utilizarse como un sitio clínicamente aplicable para el trasplante de islotes debido a su accesibilidad. Sin embargo, la eficiencia del trasplante de islotes en el espacio subcutáneo es extremadamente baja, por lo que requiere un número relativamente grande de islotes para revertir la hiperglucemia13. Recientemente, un equipo de investigación japonés encontró el ISWAT, un sitio subcutáneo novedoso superior para el trasplante de islotes en un modelo murino en comparación con el hígado14. El ISWAT contiene la arteria epigástrica y la vena, por lo que el suministro de sangre rica puede asegurar la revascularización del injerto de islet. En este manuscrito, proponemos un método de implantación fácil utilizando un hidrogel de matriz de membrana de sótano para fijar islotes murinos sinémicos en el ISWAT. Este protocolo resulta eficaz para el trasplante de islotes.
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Protocolo
Todos los procedimientos de este protocolo siguieron los principios de bienestar animal del Comité de Revisión de la Etica del Shenzhen Second People's Hospital. Los receptores de injertos de isla y los donantes fueron ratones machoC de 8 a 10 semanas de edad comprados en el Centro Médico de Animales de la Provincia de Guangdong. El procedimiento de recolección, aislamiento, cultivo o administración de las células cosechadas se llevó a cabo en condiciones asépticas.
1. Preparación de isletes
- Preparar una solución de trabajo de colagenasa tipo V. Pesar la colagenasa tipo V y disolver con el tampón de D-Hank a una concentración final de 1 mg/ml, filtrar utilizando una unidad de filtro de 0,22 m de jeringa y una jeringa de 60 ml y preenfriar en hielo. Se requiere un volumen de 5 ml para cada receptor del donante.
- Eutanasia un ratón macho C57BL/6 de 10 semanas de edad (23 x 2 g) por luxación cervical y rocíe la parte externa del ratón con 75% de etanol durante unos segundos. Mientras tanto, llene una jeringa de 5 ml con solución de colagenasa y cambie la aguja de la jeringa con una aguja de perfusión de punta contundente flexión (32 G).
- Coloque el ratón del donante en la posición supina en una bolsa de hielo debajo del endoscopio, corte una abertura transversal usando tijeras oftálmicas puntiagudas rectas en la piel de la zona púbica e incise completamente la piel hacia la cabeza. Luego abra completamente el abdomen a través de una incisión en V desde la región púbica hasta el proceso de xifoide.
- Exponer la vesícula biliar y toda la longitud del conducto biliar común mediante el reposicionamiento del hígado. A continuación, sujeta rinde la abertura duodenal del conducto biliar común con una abrazadera vascular y corta una pequeña abertura en la vesícula biliar.
NOTA: La colocación óptima de la aguja es importante para evitar el flujo de espalda en el hígado y la vesícula biliar. - Cannute el conducto biliar común de la abertura de la vesícula biliar utilizando la aguja de perfusión en el paso 1.2, luego inyecte 2 ml de solución de colagenasa en el páncreas. Después de eso, separe el páncreas perfundido de los intestinos, el estómago y el bazo usando dos pares de microtitécnicas no invasivas, y colóquelo en un tubo cónico de 50 ml sobre hielo.
NOTA: Repita el proceso para todos los ratones donantes. Tres páncreas perfundidos consecutivamente (no más de 40 minutos de diferencia) se pueden combinar en un tubo cónico de 50 ml precargado con 3 ml de solución de colagenasa para cada páncreas. - Añadir 100 l dNase I (10 mg/ml) por páncreas en los tubos cónicos de 50 ml, y digerir los páncreas en un baño de agua a 37 oC agitando los tubos cónicos durante 3-5 min.
NOTA: Agitar los tubos vigorosamente 40 veces en intervalos de 10 s para desasociar el tejido antes de la digestión en el baño de agua, y luego agitar moderadamente los tubos durante la digestión. - Añadir solución de parada (2,5 mg/ml de solución BSA-HBSS) hasta un volumen final de 50 ml para bloquear la digestión, y centrifugar los tubos por pulsos a una velocidad de 750 x g a 4 oC y detenerse rápidamente.
- Vierta el sobrenadante y lave los pellets 2 veces resuponiendo suavemente en 15-25 ml de BSA-HBSS. Centrifugar el tubo con las mismas condiciones de velocidad que se describen en el paso 1.7 durante 1 min.
- Vierta el sobrenadante y enrolle los pellets de los tres tubos cónicos en un tubo cónico de 50 ml. Resuspender los pellets en un volumen total de 10 ml de histopaque-1119. Mezclar homogéneamente, y añadir secuencialmente 5 mL de histopaque-1077 y 5 mL de HBSS mediante pipeteo lentamente a lo largo del lado del tubo.
- Girar las muestras en la centrífuga a 750 x g a 4 oC durante 10 minutos sin frenos.
- Aspirar los islotes de la interfaz HBSS/histopaque-1077 en un tubo cónico de 50 ml utilizando una pipeta Pasteur desechable de 5 ml, añadir BSA-HBSS a un volumen final de 50 ml, y centrífuga de pulso a 750 x g a 4 oC.
- Vierta el sobrenadante y lave los islotes usando 30 ml de BSA-HBSS. Centrífuga durante 1 min a 750 x g a 4oC.
- Resuspenda los islotes usando 30 ml de medio de cultivo (10% FBS-1%P/S-CMRL-1066) por tubo y vierta en un plato de cultivo ligero de 10 cm de diámetro. Bajo un estereomicroscopio, usando puntas de pipeta de carga de gel de 200 l, selecciona a mano los islotes de la solución en función de su morfología (esdecir, esferoidal, blanco). Poner en un plato de cultivo celular sin tratar con 10 ml de medio de cultivo.
NOTA: Se puede realizar una segunda selección manual si la pureza de los islotes primero purificados no es óptima después de la primera selección. - Compruebe la pureza de los islotes seleccionados a mano por tinción de ditizona bajo un microscopio de luz y detecte la viabilidad de los islotes por diacetato de fluoresceína (FDA)-yoduro propidium (PI) que se tiñen bajo un microscopio fluorescente.
- Cultivo de los islotes aislados en medio de cultivo (como en el paso 1.13) en una incubadora a 37 oC, 95% aire-5% CO2 antes del trasplante.
2. Trasplante de islotes ISWAT
- Inducir la diabetes en los ratones machos de 8 semanas de edad C57BL/6 (22 x 2 g) mediante una sola inyección de estreptozotocina (STZ). En el día -4, ayuna rinde los ratones durante 4-6 h y, a continuación, prepare una solución STZ del 2% utilizando un búfer de citrato de 0,1 M (pH 4,4). Pesar, resuspender en tampón e inyectar los ratones por vía intraperitoneal a una dosis de 180 mg/kg.
NOTA: La solución STZ debe estar recién preparada antes de su uso y cubierta con papel de aluminio debido a su sensibilidad a la luz. Debe utilizarse inmediatamente, ya que perderá actividad en un plazo de 15-20 minutos. - Perforar las venas caudales de los ratones inyectados por STZ para recoger algo de sangre alrededor de las 10 AM del día -1 y el día 0 y medir el nivel de glucosa en sangre que no está en ayunas utilizando una tira de prueba y un instrumento básico de control de glucosa en sangre. Los ratones se utilizarán como receptores de trasplante de islotes si los niveles de glucosa en sangre de los 2 días de prueba consecutivos son al menos de 20 mmol/L.
- En el día 0, pesar y marcar todos los ratones receptores. Anestetizar a cada receptor inyectando 60 mg/kg de pentobarbital sódico por vía intraperitoneal.
NOTA: Administre un pellizco de dedo del dedo del pecho para comprobar la profundidad de la anestesia. Si el ratón receptor no tiene reflejo de abstinencia, el nivel de anestesia es suficiente para la cirugía. Si no es así, administre un 10 mg/kg de pentobarbital sódico adicional. El pentobarbital sódico utilizado se diluyó en solución salina fisiológica estéril a una concentración del 2% (m/v). - Saque el hidrogel de un congelador de -20 oC y manténgalo en hielo para permitir la descongelación. El hidrogel es líquido a 4-10 oC y se solidifique a una temperatura más alta.
- Escoja los equivalentes de los islotes de 450 a 500 euros (IEQ) para cada receptor en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml bajo el estereomicroscopio (como en el paso 1.13) con 200 ml de medio de cultivo y manténgalo en hielo hasta que esté listo para el trasplante.
- Swab el área inguinal izquierda del receptor usando 75% de etanol. Colóquelo en la posición supina y fije las cuatro extremidades con cinta quirúrgica. Afeitar el cabello alrededor del sitio quirúrgico con cortadoras eléctricas y frotar el área con iodophor.
- Haga una incisión vertical de la piel en esta área usando las tijeras oftálmicas y las microtiñezers no invasivas, identifique la arteria epigástrica inferior y la vena en el ISWAT, y cree un pequeño bolsillo por encima de los vasos.
- Gire el tubo de los islotes durante 30 s a 200 x g y retire el sobrenadante tanto como sea posible. Aspirar 20 l de hidrogel completamente desalidez y cargarlo en el tubo con los islotes. Resuspenda los islotes suavemente, evitando burbujas.
- Entregue toda la mezcla de islet-hidrogel en el tubo en el bolsillo (paso 2.7) del recipiente con una punta de pipeta de 200 ml.
NOTA: Este proceso requiere dos técnicos, uno para recoger los bordes del bolsillo utilizando microtitécnicas no invasivas, y el otro para entregar la mezcla de islet en el bolsillo. - Añadir 20 s de cefalosporina (5-10 mg) en el lugar del trasplante después de que la mezcla de islotes y hidrogel es completamente solidificada, luego utilizar una sutura quirúrgica 5-0 para cerrar el músculo y la piel con el método de sutura continua.
NOTA: El hidrogel necesita unos 3 minutos para solidificar se debe a la temperatura corporal. - Coloque el recipiente en una jaula limpia y manténgalo caliente con una almohadilla térmica. Sigue supervisando hasta que el destinatario se recupere por completo y comience a moverse de forma autónoma. A continuación, administrar 0,03 mg/ml de buprenorfina con solución salina fisiológica estéril por vía intraperitoneal, según 0,1 mg/Kg dosis.
- Repita los pasos 2.3–2.11 para cada ratón del destinatario.
- Mida los niveles de glucosa en sangre que no están en ayunas de los ratones receptores (como en el paso 2.2) 3-4 veces a la semana durante el primer mes, y 1 veces a la semana a partir de entonces.
- Al final del seguimiento (100 días después del trasplante), bajo anestesia (realizada como en el paso 2.3) se extirpa el ISWAT que lleva el injerto de los receptores siguiendo los pasos estériles descritos en el paso 2.6. Fijar el tejido en formalina y paraformaldehído de acuerdo con los protocolos histológicos para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) e inmunofluorescencia de insulina y glucagón.
- Agregue cefalosporina y cierre la incisión de los receptores como en el paso 2.10, luego prepárese para la recuperación como en el paso 2.11.
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Resultados
En este protocolo se introducen dos procedimientos: preparación de islotes murinos y trasplante de islotes en el sitio ISWAT. En el primer procedimiento, después de perfumar y digerir con solución de colagenasa tipo V, purificar con Histopaque-1119 e Histopaque-1077 y un paso adicional de recogida manual, los islotes murinos aislados serán lo suficientemente puros para el trasplante (como se muestra en la Figura 1)y los islotes aislados que tienen una alta viabilidad se utilizarán para el tr...
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Discusión
El trasplante de islotes de páncreas es una terapia prometedora para tratar la T1DM. El efecto de esta terapia se ve afectado por muchos factores y elegir un sitio óptimo para la implantación de islotes es extremadamente importante. El sitio anatómico ideal para el trasplante de islotes debe tener las siguientes características: accesibilidad para trasplantes simples, biopsia sin procedimientos de recuperación de injertos; complicaciones reducidas; alta tasa de éxito del control de la glucosa en sangre; y la supervivenci...
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Divulgaciones
Los autores no informan de conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de I+D de China (2017YFC1103704)Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en la Provincia de Guangdong (2019), Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201412020), Fondo para el Alto Nivel Construcción de disciplina médica de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZJ2018059), Medical Fundación de Investigación Científica de la Provincia China de Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y mu; m Unidad de filtro accionada por jeringa | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| tubo de centrífuga de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL pipeta Pasteur | JingAn Biological, China | J00085 | |
| jeringa de 5 mL | Szboon, China | 20170829 | |
| tubo cónico de 50 | mL Corning | 430829 | |
| 5-0 sutura quirúrgica | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| jeringa de 60 mL | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Etanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ratón IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilución (1:200) |
| anti-ratón Anticuerpo de glucagón | Abcam | ab10988 | Dilución (1:100) |
| anti-ratón anticuerpo de insulina | Célula Tecnología de señalización | 3014s | Dilución (1:100) |
| aguja de perfusión de punta roma | Oloey, China | 005 | 32G, amarillo |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 | Centro Médico de Animales para Ratones de la provincia | 8 ~ 10 semanas | |
| placa de cultivo celular | BIOFIL, China | TCD000100 | General,No tratado,87,8 mm de diámetro |
| centrífuga | Thermo Scientific | ST16R | |
| cefalosporina | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| colagenasa Tipo V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tampón D-Hank | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| ditizona | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Medios de tinción de eosina | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| diacetato de fluoresceína (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| Puntas de pipeta con carga de gel | |||
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| medios de tinción de hematoxilina | Tecnología de señalización celular | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hidrogel | BD Biosciences | 356234 | Matriz de membrana basal |
| Yodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| placa de cultivo hermética a la luz | DVS, China | AN-5058548 | Hecho a sí mismo, plato de vidrio rociado con pintura negra |
| Cinta adhesiva médica | Cofoe, China | K12001 | |
| micropinzas no invasivas | RWD Life Science | F11033-11 y F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Sistema básico de control de glucosa en sangre | Johnson & Tijeras | 33391713 | |
| RWD Life Science | S12012-12 y S11001-08 | ||
| P/S (penicilina / estreptomicina) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sódico | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Yoduro de propidio | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (estreptozotocina) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Tira reactiva | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugado Cabra anti-Conejo IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilución (1:200) |
| pinza vascular | RWD Life Science | R31006-04 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
