En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.
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Artículo de método
Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento terapéutico bien establecido para la diabetes tipo 1. La cápsula renal es el sitio más utilizado para el trasplante de islotes en modelos de roedores. Sin embargo, la cápsula renal apretada limita el trasplante de islotes suficientes en animales grandes y humanos. Se encontró que el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT), un nuevo espacio subcutáneo, era un sitio potencialmente valioso para el trasplante de islotes. Este sitio tiene mejor suministro de sangre que otros espacios subcutáneos. Además, el ISWAT acomoda una masa de islotes más grande que la cápsula renal, y el trasplante en ella es simple. Este manuscrito describe el procedimiento de aislamiento y trasplante de islotes de ratón en el sitio ISWAT de los receptores de ratones diabéticos singéricos. Usando este protocolo, los islotes pancreáticos murinos fueron aislados por la digestión de la colagenasa estándar y se utilizó un hidrogel de matriz de membrana del sótano para fijar los islotes purificados en el sitio ISWAT. Los niveles de glucosa en sangre de los ratones receptores se monitorizaron durante más de 100 días. Los injertos de islotes fueron recuperados en el día 100 después del trasplante para análisis histológicos. El protocolo para el trasplante de islotes en el sitio ISWAT descrito en este manuscrito es simple y eficaz.
Introducción
La incidencia y prevalencia mundial de la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) está aumentando rápidamente, según los datos estadísticos de la Federación Internacional de Diabetes (FID)1. El trasplante de islotes es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de T1DM4. Dado que se informó del gran avance realizado en el trasplante clínico de islotes utilizando el protocolo Edmonton2, la supervivencia del injerto de islotes en funcionamiento en receptores de T1DM después de 5 años ahora alcanza aproximadamente el 50%3.
En el pasado, se exp....
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Protocolo
Todos los procedimientos de este protocolo siguieron los principios de bienestar animal del Comité de Revisión de la Etica del Shenzhen Second People's Hospital. Los receptores de injertos de isla y los donantes fueron ratones machoC de 8 a 10 semanas de edad comprados en el Centro Médico de Animales de la Provincia de Guangdong. El procedimiento de recolección, aislamiento, cultivo o administración de las células cosechadas se llevó a cabo en condiciones asépticas.
1. Preparación de isletes
- Preparar una solución de trabajo de colagenasa tipo V. Pesar la colagenasa tipo V y disolver con el tampón de D-Hank a una concentración fina....
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Resultados
En este protocolo se introducen dos procedimientos: preparación de islotes murinos y trasplante de islotes en el sitio ISWAT. En el primer procedimiento, después de perfumar y digerir con solución de colagenasa tipo V, purificar con Histopaque-1119 e Histopaque-1077 y un paso adicional de recogida manual, los islotes murinos aislados serán lo suficientemente puros para el trasplante (como se muestra en la Figura 1)y los islotes aislados que tienen una alta viabilidad se utilizarán para el tr.......
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Discusión
El trasplante de islotes de páncreas es una terapia prometedora para tratar la T1DM. El efecto de esta terapia se ve afectado por muchos factores y elegir un sitio óptimo para la implantación de islotes es extremadamente importante. El sitio anatómico ideal para el trasplante de islotes debe tener las siguientes características: accesibilidad para trasplantes simples, biopsia sin procedimientos de recuperación de injertos; complicaciones reducidas; alta tasa de éxito del control de la glucosa en sangre; y la supervivenci.......
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Divulgaciones
Los autores no informan de conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de I+D de China (2017YFC1103704)Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en la Provincia de Guangdong (2019), Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201412020), Fondo para el Alto Nivel Construcción de disciplina médica de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZJ2018059), Medical Fundación de Investigación Científica de la Provincia China de Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,22 y mu; m Unidad de filtro accionada por jeringa | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| tubo de centrífuga de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL pipeta Pasteur | JingAn Biological, China | J00085 | |
| jeringa de 5 mL | Szboon, China | 20170829 | |
| tubo cónico de 50 | mL Corning | 430829 | |
| 5-0 sutura quirúrgica | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| jeringa de 60 mL | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Etanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ratón IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilución (1:200) |
| anti-ratón Anticuerpo de glucagón | Abcam | ab10988 | Dilución (1:100) |
| anti-ratón anticuerpo de insulina | Célula Tecnología de señalización | 3014s | Dilución (1:100) |
| aguja de perfusión de punta roma | Oloey, China | 005 | 32G, amarillo |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 | Centro Médico de Animales para Ratones de la provincia | 8 ~ 10 semanas | |
| placa de cultivo celular | BIOFIL, China | TCD000100 | General,No tratado,87,8 mm de diámetro |
| centrífuga | Thermo Scientific | ST16R | |
| cefalosporina | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| colagenasa Tipo V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tampón D-Hank | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| ditizona | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Medios de tinción de eosina | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| diacetato de fluoresceína (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| Puntas de pipeta con carga de gel | |||
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| medios de tinción de hematoxilina | Tecnología de señalización celular | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hidrogel | BD Biosciences | 356234 | Matriz de membrana basal |
| Yodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| placa de cultivo hermética a la luz | DVS, China | AN-5058548 | Hecho a sí mismo, plato de vidrio rociado con pintura negra |
| Cinta adhesiva médica | Cofoe, China | K12001 | |
| micropinzas no invasivas | RWD Life Science | F11033-11 y F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Sistema básico de control de glucosa en sangre | Johnson & Tijeras | 33391713 | |
| RWD Life Science | S12012-12 y S11001-08 | ||
| P/S (penicilina / estreptomicina) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sódico | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Yoduro de propidio | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (estreptozotocina) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Tira reactiva | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugado Cabra anti-Conejo IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilución (1:200) |
| pinza vascular | RWD Life Science | R31006-04 |
Referencias
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
