Artículo de método

Protocolo de dosificación escalonada para aumentar el rendimiento en ensayos GPCR basados en impedancia sin etiquetas

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DOI:

10.3791/60686

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21 de febrero de 2020

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1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

En este artículo

Resumen

Este protocolo demuestra el registro en tiempo real de las relaciones de dosis-respuesta completa para la activación gpCR inducida por agonistas a partir de una sola capa de células cultivada en un solo microelectrodo mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. El nuevo esquema de dosificación aumenta significativamente el rendimiento sin pérdida en la resolución de tiempo.

Resumen

Los ensayos basados en impedancia sin etiquetas se utilizan cada vez más para estudiar de forma no invasiva la activación de GPCR inducida por ligandos en experimentos de cultivo celular. El enfoque proporciona supervisión de celdas en tiempo real con una resolución de tiempo dependiente del dispositivo hasta varias decenas de milisegundos y está altamente automatizado. Sin embargo, cuando los números de muestra son altos (por ejemplo, estudios de dosis-respuesta para varios ligandos diferentes), el costo de las matrices de electrodos desechables, así como la resolución de tiempo disponible para grabaciones secuenciales bien por pozo pueden llegar a ser limitador. Por lo tanto, aquí presentamos un protocolo de adición agonista en serie que tiene el potencial de aumentar significativamente la salida de ensayos GPCR sin etiquetas. Usando el protocolo de adición agonista en serie, un agonista GPCR se agrega secuencialmente en el aumento de las concentraciones a una sola capa de celda mientras se supervisa continuamente la impedancia de la muestra (modo agonista). Con este enfoque en serie, ahora es posible establecer una curva de dosis-respuesta completa para un agonista GPCR a partir de una sola capa de células. El protocolo de adición agonista en serie es aplicable a diferentes tipos de acoplamiento GPCR, Gq Gi/0 o Gs y es compatible con los niveles de expresión recombinantes y endógenos del receptor en estudio. El bloqueo de receptores por los antagonistas de GPCR también es evaluable (modo antagonista).

Introducción

Este informe presenta una descripción detallada de un protocolo de adición en serie desarrollado para la cuantificación de la activación del receptor acoplado a proteínaS G inducida por ligandos (GPCR) en células cultivadas adherentemente mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) participan en una multitud de funciones fisiológicas y enfermedades humanas1. Debido a esto y su buena accesibilidad en la superficie celular, los PCPR son uno de los objetivos de drogas más importantes. Esta evaluación se refleja en un número estimado de 700 medicamentos aprobados dirigidos a los GPCR, equivalente a una cuota del 35 % en todos los medicamentos comercializados2.

El desarrollo de nuevos fármacos comprende dos procesos centrales: i) la identificación y caracterización funcional de las moléculas diana biológicas, y ii) el descubrimiento de nuevas sustancias de plomo y su desarrollo en fármacos administrables. En ambos procesos, se requieren métodos eficientes para evaluar cuantitativamente las interacciones farmacológicas y la posterior respuesta biológica posterior. Diferentes etapas del proceso de desarrollo de fármacos preclínicos utilizan diferentes métodos de análisis que van desde estudios de interacción biomolecular entre fármaco y objetivo, sobre estudios funcionales sobre células en cultivo, hasta experimentos con material orgánico extirpado o animales enteros. Tanto el significado fisiológico como la complejidad biológica aumentan de los3primeros a los segundos. Aunque el objetivo general es minimizar los experimentos en animales, los estudios farmacológicos que utilizan órganos aislados de animales de laboratorio o incluso animales enteros se consideran inevitables para caracterizar exhaustivamente a los nuevos candidatos a fármacos. En términos de lectura analítica, los estudios farmacológicos de órganos proporcionan una respuesta funcional distal e integradora "holística" de mayor relevancia fisiológica. Un inconveniente de estos experimentos es que no son compatibles con el cribado de alto rendimiento por razones técnicas y éticas y han sido sustituidos en gran medida por estudios basados en el cultivo celular in vitro4.

Los métodos para cuantificar la activación de GPCR en cultivos celulares incluyen diferentes ensayos químicos basados en etiquetas, que detectan específicamente a los segundos mensajeros, el estado de fosforilación de las proteínas de señalización aguas abajo, la activación transcripcional a través de ciertos factores de transcripción o el tráfico de receptores intracelulares inducido por ligando4,5. Un inconveniente de estos ensayos basados en etiquetas es la necesidad de etiquetar las células con colorantes potencialmente dañinos o marcadores radiactivos. Esto a menudo requiere ejecutar el ensayo como una determinación de punto final para un tiempo de exposición que debe especificarse a priori. El uso de ensayos de punto final basados en etiquetas sufre de este momento muy limitado y sesgado del experimento y el riesgo de que las etiquetas químicas y las sondas puedan interferir con la fisiología celular regular, potencialmente desapercibida para el experimentador.

En los últimos años, han surgido ensayos sin etiquetas para el seguimiento de la activación de GPCR, como técnicas basadas en impedancia o métodos ópticos que aplican rejillas de guía de onda resonantes5,6. El etiquetado de las células no es necesario experimentalmente con estos enfoques. Como estas lecturas físicas operan en señales de baja amplitud, estos métodos se consideran no invasivos, permiten la supervisión continua de células potencialmente en tiempo real y el tiempo de observación sólo está limitado por el cultivo celular no por la lectura. Al igual que las lecturas de órganos enteros, los enfoques sin etiquetas suelen informar sobre las respuestas celulares holísticas, muy por debajo de la activación del receptor cuando la integración a lo largo de toda la red de señalización conduce a cambios dependientes del tiempo, sino más bien poco específicos en la morfología celular o la redistribución masiva. Mientras que los ensayos basados en impedancia miden la firma dieléctrica de los cambios en la forma de la célula7,8, las mediciones que utilizan rejillas de guía de onda resonantes son sensibles a los cambios en el índice de refracción en la interfaz de sustrato celular que se derivan de la redistribución dinámica de masa (DMR)9. El carácter integrador hace que los métodos libres de etiquetas sean extremadamente sensibles a los eventos mediados por receptores independientemente del tipo(s) de proteína G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13)o -arrestina implicada en la cascada de señalización6 y adecuada para los niveles de expresión endógena del receptor.

En un ensayo estándar basado en impedancia sin etiquetas, las células se cultivan adherentemente en placas de varios pocillos con electrodos coplanares de película de oro depositados en la parte inferior de cada pozo10. Estas matrices de electrodos están conectadas a un analizador de impedancia y las respuestas celulares a un estímulo experimental se registran a partir de pozos individuales mediante lecturas de impedancia resueltas en el tiempo. En un ensayo típico de GPCR se añade un ligando en concentraciones individualmente diferentes a cada individuo bien. Los cambios inducidos por ligando en el curso de tiempo de impedancia se analizan con respecto a las características de la curva, como el cambio máximo de señal, el área bajo la curva, el cambio de señal dentro de un intervalo de tiempo determinado o la pendiente de la curva en un punto de tiempo especificado, con el fin de cuantificar la potencia y eficacia del ligando11.

El costo de las matrices de electrodos puede limitar la aplicación de esta técnica en campañas de detección de alto rendimiento (HTS). Además, con un número cada vez mayor de muestras a seguir en paralelo, el número de mediciones individuales aumenta y, por lo tanto, reduce la resolución de tiempo disponible para cada pocal gradualmente, incluso para las grabaciones multicanal de última generación. En tales condiciones, las respuestas celulares rápidas y transitorias pueden escapar de la medición. Además, el pozo convencional – un enfoque de concentración impone un factor de tiempo y costo significativo a los desarrollos de órgano en chip o cuerpo en chip perfundidos con respecto a su idoneidad en el análisis de interacción ligando-GPCR.

Por esta razón, desarrollamos un protocolo de dosificación escalonada que permite el registro de curvas de dosis-respuesta completa de activación GPCR inducida por ligando en monocapas celulares cultivadas mediante el monitoreo continuo de la impedancia de un solo pozo mientras que la concentración agonista se incrementa escalonadamente. El protocolo de adición agonista en serie aumenta significativamente el rendimiento por pozo de una concentración a 10 o más concentraciones, como se muestra en el ejemplo actual de células humanas U-373 MG, que endógenamente expresan el receptor de histamina 1 (H1R). Por lo tanto, el método tiene el potencial de mejorar significativamente el rendimiento en estudios de dosis-respuesta sin etiquetas, mientras que la resolución de tiempo se mantiene al máximo instrumental.

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Protocolo

1. Sembrado celular en matrices de electrodos

NOTA: La selección del diseño del electrodo es un equilibrio entre la sensibilidad y el número de células en estudio. Cuanto más pequeño es el electrodo, más sensible es la medida, pero cuanto menor es el número de células en estudio. Para las células que muestran fuertes fluctuaciones de impedancia a lo largo del tiempo en condiciones basales, son preferibles electrodos más grandes o interdigitados.

  1. Precaliente todas las soluciones necesarias para el paso y la sembración de células estándar en un baño de agua de 37 oC. Para los ensayos con células Humanas U-373 MG se necesita: solución salina tamponada de fosfato (PBS) sin calcio y magnesio, 0,05% (p/v) de tripasina, medio de cultivo celular (Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM) complementado con 5% (v/v) de suero de becerro fetal (FCS), 2 mM de lglutamina y 100 g/mL de penicilina/streptomicina).
  2. Enjuague la capa celular del cultivo de material cultivado en la parte inferior de los matraces o platos de cultivo celular convencionales con PBS dos veces.
  3. Retire el PBS, agregue la solución de trippsina (1 mL para 25 cm2)y deje que las células incuban a 37 oC durante 5 min (se aplica a las células Mg de U-373).
  4. Control para el desprendimiento completo de las células desde la parte inferior del sustrato de crecimiento mediante microscopía.
  5. Detener la reacción de trippsina tan pronto como las células se separan por completo agregando 9 ml de medio de cultivo celular por 1 ml de trippsina a la suspensión celular. Enjuague cuidadosamente las celdas restantes de la parte inferior del sustrato de cultivo celular pipeteando la suspensión sobre el sustrato.
  6. Recoger la suspensión celular con una pipeta y transferirla a un tubo de centrifugación (tubo de 15 ml o 50 ml).
  7. Gire las células por centrifugación a 110 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
  8. Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender a fondo el pellet celular en el medio de cultivo antes de contar las células (por ejemplo, utilizando un hemacitómetro para microscopios de contraste de fase y conteo manual).
  9. Ajuste la suspensión de la celda a la densidad celular deseada. Para experimentos con células Mg U-373, utilice 100 000 células/cm2 para cultivar una capa celular confluente dentro de 48 h. Esto se traduce en una densidad celular de 200 000 celdas/ml para matrices de electrodos de 8 pozos con un área de crecimiento de 0,8 cm2 y un volumen de pozo de 400 ol.
    NOTA: Para experimentos de activación de GPCR reproducibles, las células deben crecer a monocapas confluentes en las matrices de electrodos. Para garantizar la expresión adecuada del receptor en la superficie celular, las células deben ser sembradas al menos 36 h antes de realizar el experimento. Probar diferentes densidades celulares para la sembración celular a menudo es significativo para identificar las mejores condiciones experimentales.
  10. Añadir la suspensión celular a los pozos de la matriz de electrodos y dejar que las ventas se asienten a temperatura ambiente durante 10 – 15 minutos con el fin de asegurar la distribución homogénea de las células en la parte inferior de los pozos.
  11. Cultivar células durante al menos 36 h en una incubadora de cultivo celular estándar con 5% deCO2 (dependiendo del tipo medio) a 37oC y atmósfera humidificada. Cambiar el medio de cultivo celular 24 h antes del experimento.
  12. El día del experimento, inspeccione las capas celulares en las matrices de electrodos mediante microscopía (contraste de fase) para asegurar una cobertura completa de electrodos con células.

2. Equilibrio de células en medio libre de suero

  1. Medio precálido sin suero, en este estudio: Medio L15 de Leibovitz.
  2. Retire el medio de cultivo celular de las células cultivadas en matrices de electrodos y sustitúyalos por un medio precalentado sin suero. Utilice 200 l para matrices de electrodos con formato de 8 pozos y 150 l para matrices de electrodos de 96 pozos.
  3. Dejar que las células se equilibren en un medio libre de suero a 37 oC durante al menos 2 h. El tiempo de equilibrio depende en gran medida del tipo de celda. Por ejemplo, las células MG U-373 necesitan 2 h, las células CHO necesitan 4 h, BAEC puede requerir equilibrio durante la noche en el medio L-15.
    NOTA: El medio L-15 es independiente del CO2 y requiere una atmósfera libre de CO2. Para el equilibrio en L-15 fije la incubadora en 0 % CO2. El equilibrio puede ser monitoreado por lecturas de impedancia, lo que recomendamos hacer para los primeros experimentos.

3. Monitoreo del equilibrio celular con lecturas de impedancia

  1. Coloque la matriz de electrodos en el soporte de la matriz de conexión del analizador de impedancia.
  2. Garantice un contacto adecuado de baja impedancia entre los electrodos y el analizador de impedancia. Esta comprobación es diferente individualmente para diferentes instrumentos.
    NOTA: Si el instrumento no puede conectarse a los electrodos, vuelva a abrir la abrazadera de contacto, vuelva a ajustar la matriz de electrodos para un posicionamiento adecuado dentro del soporte y vuelva a intentarlo.
  3. Seleccione el tipo de electrodo y/o el formato multipozo en la interfaz de usuario del software.
  4. Configure los parámetros de medición. Hay diferentes opciones disponibles.
    NOTA: Para seleccionar la frecuencia de CA más sensible, nos referimos a la literatura y los manuales de instrumentos, ya que depende de la disposición del electrodo y el tipo de celda en estudio. Típicamente, la frecuencia de sensación está en el rango de 4 kHz – 50 kHz. Aquí, las células U-373 MG se cultivaban con electrodos de trabajo circulares de 250 m de diámetro y fueron monitoreadas a una frecuencia de CA de 12 kHz.
    1. Si hay disponibles modos de adquisición de datos de frecuencia única y múltiple, seleccione el modo de frecuencia única para garantizar la máxima resolución de tiempo. La medición se realizará con esta única frecuencia. Para los instrumentos más extendidos, hay una serie de frecuencias preestablecidas a lo largo de la ventana de frecuencia disponible.
    2. Si el número de pozos en estudio es bajo o la resolución de tiempo no es crítica, seleccione varias grabaciones de frecuencia en su lugar. Las lecturas de impedancia en un número especificado de frecuencias se registrarán para cada pozo para un análisis en profundidad posterior.
      NOTA: La resolución de tiempo disminuye con el aumento del número de frecuencias registradas por pozo y el número creciente de pozos. Las opciones de selección de frecuencia y modo de adquisición de datos varían según el tipo de instrumento y la versión.
  5. Inicie la adquisición de los datos del curso de tiempo.
  6. Siga la impedancia de la capa celular (al menos 2 h) hasta que la impedancia se haya estabilizado. Mientras tanto, prepare las soluciones agonistas.
  7. Cuando las capas de celda han alcanzado un nivel de impedancia estable, (i) procede a la adición agonista en serie dentro del mismo experimento o (ii) termina la adquisición de datos e inicia un nuevo conjunto de datos para supervisar la activación del receptor inducida por agonistas.

4. Preparación de soluciones agonistas para experimentos en modo agonista

  1. Calcular la concentración de soluciones agonistas según sea necesario para cada paso de la dosificación en serie de acuerdo con la ecuación (1). n oscila entre 1 y el número total de adiciones en serie i. x denota concentración y volumen en el pozo en el paso n. y denota la concentración y el volumen de la "solución a agregar" en el paso n.

figure-protocol-1

NOTA: Considere el número de réplicas y calcule el volumen total de "solución para agregar" para cada paso de concentración. Los resultados de un cálculo típico se dan en los Cuadros 1-4. Se necesita una idea general sobre el rango de concentración agonista a estudiar, ya que el rango define las concentraciones y el número de porciones que se administrarán durante la adición en serie. Usando el protocolo de adición agonista en serie la concentración agonista se incrementa escalonadamente. Por lo tanto, la cantidad de agonista ya en el pozo cuando se añade la siguiente dosis debe tenerse en cuenta. Cuando el número de moléculas agonistas ya presentes en el pozo es nx á cx x Vx (con la concentración actual cx y volumen Vx) y el número de moléculas en el pozo después de la siguiente adición es nx+y, el número de moléculas que se añadirán ny se determina por la concentración cy el volumen Vy de la solución que se aplicará al pozo (ny a cy Vy Y). Después de añadir una porción de agonista, la nueva cantidad de moléculas agonistas en el pozo es: cx+y á Vx+y á cx vx x cy a V y aV y. Este cálculo se aplica a cada paso siguiente. Debido a la interdependencia de la concentración agonista en el pozo y la cantidad de agonista en las porciones que se añadirán con cada paso, es importante definir las concentraciones finales después de cada paso de antemano.

Modo 1: El volumen en el pozo aumentará con cada paso a medida que el líquido se agrega continuamente.
Usando este modo y un formato de 8 pozos, utilice Vx1 a 200 l y Vy1 .... Vyi a 30 ol.

Modo 2: El volumen en el pozo es constante ya que el volumen añadido con cada paso se elimina justo antes de la adición posterior.
Usando este modo y un formato de 96 pozos, utilice Vx1 a 150 l y Vy1 .... Vyi a 75 ol.

  1. Imprima la hoja de datos con el volumen total por concentración e instrucciones detalladas para pipeteo.
  2. Prepare todas las soluciones en la cantidad requerida. Haga todas las soluciones agonistas en el mismo medio libre de suero que se utiliza para el equilibrio de las células.
    ADVERTENCIA: El dihidrocloruro de histamina se considera peligroso por la Norma de Comunicación de Peligros de la OSHA de 2012 (29 CFR 1910.1200). La histamina causa irritación de la piel, irritación ocular grave, puede causar una reacción alérgica en la piel, alergia, síntomas de asma o dificultades respiratorias si se inhala y puede causar irritación respiratoria. Tenga en cuenta la ficha de datos de seguridad.
    NOTA: Haga que las soluciones agonistas sean lo más frescas posible. La estabilidad de los agonistas en la solución puede variar considerablemente. Almacene las soluciones a 4 oC o menos hasta su uso en el experimento. Para algunas moléculas aditivos estabilizadores adicionales, como BSA cuando se utilizan moléculas basadas en péptidos o lípidos, se pueden considerar para prevenir la adsorción a las paredes de pozos y tubos.
  3. Si realiza el experimento en formato de 96 pocillos, transfiera soluciones a una placa convencional de 96 pocillos (sin electrodos) y utilice una tubería de canal de 8 (o 12) para una transferencia rápida de líquido a la matriz de electrodos.

5. Preparación de soluciones agonistas para experimentar en modo antagonista

NOTA: Prepare la(s) solución(es) antagonista(s) con la concentración que se aplicará en todo. El volumen y la concentración de la solución antagonista dependen del modo de adición agonista (1 o 2). Ejemplos de experimentos en formato de 8 o 96 pozos en el modo de adición 2: (A) formato de 8 pozos (Vx1 a 200 l,antagonista v a 200 ol); (B) Formato de 96 pozos (Vx1 a 150 l,antagonista de V a 75 ol).

  1. Calcule la concentración de cada solución agonista necesaria para cada paso de la dosificación en serie como se describe en el paso 4.1.
  2. Hacer todas las soluciones agonistas en el mismo medio libre de suero que se utiliza para el equilibrio de las células y añadir el antagonista en la misma concentración final que se planeó para los pozos respectivos en el experimento.
    NOTA: En este caso, la solución de stock de histamina (10 mM) se prepara en medio L-15. Cuando los agonistas se disuelven en otros disolventes (por ejemplo, dimetil sulfoxid (DMSO), etanol) se debe incluir un control de disolvente para tener en cuenta el aumento de la carga de disolvente según cada paso de adición.

6. Realizar el protocolo de adición en serie en modo agonista

  1. Inicie la adquisición de datos como se describe en los pasos 3.1 – 3.5.
  2. Precaliente las soluciones agonistas antes de su uso colocándolas en la incubadora unos 10 – 15 minutos antes de la adición.
    NOTA: Cuando se utilizan sustancias termolábiles, las soluciones no deben mantenerse a 37 oC durante demasiado tiempo. Si el precalentamiento durante 10 – 15 minutos se considera crítico, lleve soluciones a 37 oC poco antes de la adición en un baño de agua.
  3. Ejecute la dosificación en serie agonista en función del modo de adición seleccionado. El siguiente modo 1 el volumen total del pozo aumenta con cada adición de la siguiente dosis. En el modo 2 el mismo volumen que se añade con cada paso también se elimina de nuevo justo antes de añadir la siguiente dosis más alta.
    NOTA: El tiempo necesario para el equilibrio de la capa celular entre dos dosis agonistas posteriores depende del tiempo de respuesta de las células. Un experimento inicial en modo paralelo (un pozo – una concentración) revela (i) tiempos de respuesta de celda para diferentes concentraciones agonistas y (ii) el parámetro de curva más sensible (por ejemplo, impedancia máxima, impedancia después del tiempo x).

R: Modo 1 / 8-formato de pozo

  1. Añadir 30 ml de la primera solución con la menor concentración de agonista a las células que se equilibraron en 200 oL de medio libre de suero.
  2. Deje que las células respondan y equilibren durante el período de tiempo predefinido (por ejemplo, 15 min).
  3. Añadir 30 sde la segunda solución con la siguiente concentración más alta.
  4. Repita los pasos 6.3.1-6.3.3 con la tercera, cuarta, etc., solución agonista.
    NOTA: Al trabajar con 10 pasos de concentración, se producirá un volumen total de 500 l al final del experimento, que está justo por debajo del volumen máximo aplicable de estos pozos de 550 ol.

B: Modo 2 / 96-formato de pozo

NOTA: Pausa la adquisición de datos durante cada paso de manipulación de líquidos (adición/eliminación) a través del software del instrumento de impedancia cuando se ejecutan experimentos en formato de 96 pozos. El manejo de líquidos más elaborado puede interferir con la adquisición de datos. Utilice una pipeta multicanal.

  1. Pausa la adquisición de datos.
  2. Añadir 75 ml de la primera solución con la menor concentración de agonista a las células que se equilibraron en 150 oL de medio libre de suero.
  3. Reanudar la adquisición de datos.
  4. Deje que las células respondan y equilibren durante el período de tiempo predefinido (por ejemplo, 15 min).
  5. Aproximadamente 1 – 2 min antes de que termine el tiempo de equilibrio regular, detenga la medición y retire 75 s de cada pocal.
    NOTA: El punto de tiempo en el que se debe eliminar la solución depende del número de pozos monitoreados en paralelo y de la velocidad de pipeteo. El tiempo necesario para la eliminación de las soluciones no debe exceder el tiempo entre pasos posteriores.
  6. Añadir 75 ml de la segunda solución con la siguiente concentración más alta y reanudar la medición.
  7. Repita los pasos 6.3.8-6.3.10 con la tercera, cuarta, etc., solución agonista.

7. Realizar el protocolo de adición en serie en modo antagonista

  1. Inicie la medición como se describe en los pasos 3.1 – 3.5.
  2. Durante el equilibrio de las capas celulares, prepare la solución antagonista (p. ej., 200 ml de clorhidrato de difenhidramina de 1,5 m en medio L15).
    ADVERTENCIA: El clorhidrato de difenhidramina tiene posibles efectos agudos para la salud. Es perjudicial si se ingiere o inhala, puede causar irritación de los ojos y la piel. Puede causar irritación respiratoria y del tracto digestivo. Tenga en cuenta la ficha de datos de seguridad.
  3. Precalentar las soluciones antagonistas y agonistas colocándolas en la incubadora unos 10 – 15 minutos antes de la adición a los cultivos celulares (cf. 6.2). Si los pozos libres de antagonistas también están incluidos en el ensayo, también se precalienta el medio libre de suero.
  4. Agregue la solución antagonista a los pozos designados. Deje que las células se equilibren con antagonista durante 15 – 20 min. Si se incluyen pozos libres de antagonistas, agregue el mismo volumen de medio libre de suero a estos pozos.
  5. Según la adición antagonista en el modo 2,eliminar la solución de los pozos
    (A) Formato de 8 pozos (200 l)
    (B) Formato de 96 pozos (75 l)
  6. Ejecute la secuencia de adición agonista como se describe en el paso 6.3.

8. Exportación y análisis de datos

  1. Exporte datos utilizando el software del instrumento de impedancia para convertir todos los datos grabados de propiedad a formatos de datos comunes (por ejemplo, csv). Este paso permite la reorganización y presentación de datos con otros paquetes de software.
  2. Cargue los datos con formato csv en software de análisis de datos científicos.
  3. Normalice los valores de impedancia restando la impedancia del último punto de datos antes de la primera adición de la solución agonista y estableciendo la hora de adición a t a 0. Trazar el curso de tiempo de impedancia normalizada.
  4. Trazar los cursos de tiempo individuales e identificar el máximo en impedancia después de cada paso de adición. Componga una hoja de datos con estos valores.
  5. Trazar los valores de los cambios de impedancia máximo (o mínimo, si procede) en función de la concentración agonista. Esto se puede hacer para pozos individuales o para los promedios (media de SD).
  6. Utilice una rutina de ajuste de datos para determinar las concentraciones efectivas medias máximas (EC50) y la respuesta máxima (EMax)utilizando el modelo logístico de cuatro parámetros (ecuación 2):

figure-protocol-2

NOTA: c indica la concentración agonista, A1 es el mínimo y A2 es la asintota máxima de la curva de dosis-respuesta sigmoidal (A2 o EMax). EC50 es la concentración en el punto de inflexión de la curva, y n corresponde a la pendiente de la colina.

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Resultados

Un esquema típico para la preparación de las diversas soluciones agonistas se muestra para un experimento utilizando matrices de electrodos de 8 pozos con histamina como agonista en las Tablas 1-4. La Tabla 1 y la Tabla 2 presentan volúmenes y concentraciones para un experimento utilizando el modo de adición 1 (cf., Figura 1), mientras que la Tabla 3 y la Tabla 4 presentan volúmenes y concen...

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Discusión

Este protocolo describe un método para mediciones de impedancia sin etiquetas para determinar la relación dosis-respuesta de activación GPCR inducida por agonistas en ausencia o presencia de antagonistas específicos para el mismo receptor. La prueba de concepto de este método se presentó en una publicación reciente12. Hasta nuestro conocimiento, es el primer estudio que describe el establecimiento de una curva de dosis-respuesta completa de activación GPCR mediada por agonistas utilizando una sola...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Barbara Goricnick y Nadja Hinterreiter por su ayuda con el cultivo celular y la preparación de soluciones experimentales. Los autores agradecen el apoyo financiero del Research Training Group 1910 "Medicina química de ligandos GPCR selectivos" financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) bajo el número de subvención 222125149. JAS está particularmente agradecido por una beca otorgada por el Programa Bávaro de Igualdad de Género.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bü cámara de conteo de rkerMarienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Alemania)640210
matraces de cultivo celular de 25 cm2Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)690175
Incubadora de células (Heraeus Function Line BB15)Thermo Scientific (Darmstadt, Alemania)\
Centrífuga (Heraeus 1S-R)Thermo Scientific (Darmstadt, Alemania)\
Clorhidrato dedifenhidraminaSigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)D3630
Medio esencial mínimo de Eagle con 4,5 g/L de D-glucosa y 2,2 g/L de NaHCO3Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)D5671
Instrumento de impedancia (ECIS Zθ)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EE. UU.)\
Matrices de electrodos de 8 pocillos (8W1E PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EE. UU.)\Base de PET con electrodo de trabajo de 0.049 mm2< / sup> y contraelectrodo de ~ 50 mm2< / sup> (oro)
Matrices de electrodos de 96 pocillos (96W1E+ PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EE. UU.)\Base de PET con dos electrodos (oro) con un área total de electrodos de 0,256 mm2
Suero fetal de ternero (FCS)Biochrom (Berlín, Alemania)S0615
Dihidrocloruro de histaminaCarl Roth (Karlsruhe, Alemania)4017.1
Campana de flujo laminar (Herasafe, KS 12)Thermo Scientific (Darmstadt, Alemania)51022515armario de seguridad de clase II
Leibovitz' L-15 mediumThermo Scientific (Darmstadt, Alemania)21083-027
L-glutaminaSigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)G7513
Micropipeta grande (100 - 1000 µ L)Brandt (Wertheim, Alemania)704780
Micropipeta grande (20 - 200 y micro; L)Brandt (Wertheim, Alemania)704778
Microscopio (contraste de fase, Nikon Diaphot)Nikon (Dü sseldorf, Alemania)
Penicilina/estreptomicinaSigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)P0781
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)D8537
Pipeta serológicaGreiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)607 180
Pipeta (accu-jet pro)Brandt (Wertheim, Alemania)26300
TripsinaSigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)T4174en PBS con tubo de EDTA de 1 mM
, 15 mLGreiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)188 271
Tubo, 50 mLGreiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)210 261
células U-373 MGATCC (Rockville, MD, EE. UU.)ATCC HTB-17
(TW21)Julabo (Seelbach, Alemania)\
Baño de agua

Referencias

  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
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