Protocolo de dosificación escalonada para aumentar el rendimiento en ensayos GPCR basados en impedancia sin etiquetas

Judith  A. Stolwijk; Anne-Kathrin Mildner; Christian Kade; Michael Skiba; Guenther Bernhardt; Armin Buschauer; Harald Huebner; Peter Gmeiner; Joachim Wegener

doi:10.3791/60686

Method Article

Protocolo de dosificación escalonada para aumentar el rendimiento en ensayos GPCR basados en impedancia sin etiquetas

DOI:

10.3791/60686

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February 21st, 2020

Judith A. Stolwijk¹ , Anne-Kathrin Mildner¹ , Christian Kade¹ , Michael Skiba¹ , Guenther Bernhardt² , Armin Buschauer² , Harald Huebner³ , Peter Gmeiner³ , Joachim Wegener¹^,⁴

¹Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, ²Institute of Pharmacy, University of Regensburg, ³Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, ⁴Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

Summary

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Este protocolo demuestra el registro en tiempo real de las relaciones de dosis-respuesta completa para la activación gpCR inducida por agonistas a partir de una sola capa de células cultivada en un solo microelectrodo mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. El nuevo esquema de dosificación aumenta significativamente el rendimiento sin pérdida en la resolución de tiempo.

Abstract

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Los ensayos basados en impedancia sin etiquetas se utilizan cada vez más para estudiar de forma no invasiva la activación de GPCR inducida por ligandos en experimentos de cultivo celular. El enfoque proporciona supervisión de celdas en tiempo real con una resolución de tiempo dependiente del dispositivo hasta varias decenas de milisegundos y está altamente automatizado. Sin embargo, cuando los números de muestra son altos (por ejemplo, estudios de dosis-respuesta para varios ligandos diferentes), el costo de las matrices de electrodos desechables, así como la resolución de tiempo disponible para grabaciones secuenciales bien por pozo pueden llegar a ser limitador. Por lo tanto, aquí presentamos un protocolo de adición agonista en serie que tiene el potencial de aumentar significativamente la salida de ensayos GPCR sin etiquetas. Usando el protocolo de adición agonista en serie, un agonista GPCR se agrega secuencialmente en el aumento de las concentraciones a una sola capa de celda mientras se supervisa continuamente la impedancia de la muestra (modo agonista). Con este enfoque en serie, ahora es posible establecer una curva de dosis-respuesta completa para un agonista GPCR a partir de una sola capa de células. El protocolo de adición agonista en serie es aplicable a diferentes tipos de acoplamiento GPCR, G_q G_i/0 o G_s y es compatible con los niveles de expresión recombinantes y endógenos del receptor en estudio. El bloqueo de receptores por los antagonistas de GPCR también es evaluable (modo antagonista).

Introduction

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Este informe presenta una descripción detallada de un protocolo de adición en serie desarrollado para la cuantificación de la activación del receptor acoplado a proteínaS G inducida por ligandos (GPCR) en células cultivadas adherentemente mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) participan en una multitud de funciones fisiológicas y enfermedades humanas¹. Debido a esto y su buena accesibilidad en la superficie celular, los PCPR son uno de los objetivos de drogas más importantes. Esta evaluación se refleja en un número estimado de 700 medicamentos aprobados dirigidos a los GPCR, equivalente a....

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Protocol

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1. Sembrado celular en matrices de electrodos

NOTA: La selección del diseño del electrodo es un equilibrio entre la sensibilidad y el número de células en estudio. Cuanto más pequeño es el electrodo, más sensible es la medida, pero cuanto menor es el número de células en estudio. Para las células que muestran fuertes fluctuaciones de impedancia a lo largo del tiempo en condiciones basales, son preferibles electrodos más grandes o interdigitados.

Precaliente todas las soluciones necesarias para el paso y la sembración de células estándar en un baño de agua de 37 oC. Para los ensayos con células Humanas U-373 MG se necesita: solució....

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Results

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Un esquema típico para la preparación de las diversas soluciones agonistas se muestra para un experimento utilizando matrices de electrodos de 8 pozos con histamina como agonista en las Tablas 1-4. La Tabla 1 y la Tabla 2 presentan volúmenes y concentraciones para un experimento utilizando el modo de adición 1 (cf., Figura 1), mientras que la Tabla 3 y la Tabla 4 presentan volúmenes y concen.......

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Discussion

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Este protocolo describe un método para mediciones de impedancia sin etiquetas para determinar la relación dosis-respuesta de activación GPCR inducida por agonistas en ausencia o presencia de antagonistas específicos para el mismo receptor. La prueba de concepto de este método se presentó en una publicación reciente¹². Hasta nuestro conocimiento, es el primer estudio que describe el establecimiento de una curva de dosis-respuesta completa de activación GPCR mediada por agonistas utilizando una sola.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Agradecemos a Barbara Goricnick y Nadja Hinterreiter por su ayuda con el cultivo celular y la preparación de soluciones experimentales. Los autores agradecen el apoyo financiero del Research Training Group 1910 "Medicina química de ligandos GPCR selectivos" financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) bajo el número de subvención 222125149. JAS está particularmente agradecido por una beca otorgada por el Programa Bávaro de Igualdad de Género.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Bü cámara de conteo de rker	Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Alemania)	640210
matraces de cultivo celular de 25 cm²	Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)	690175
Incubadora de células (Heraeus Function Line BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Alemania)	\
Centrífuga (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Alemania)	\
Clorhidrato de	difenhidraminaSigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)	D3630
Medio esencial mínimo de Eagle con 4,5 g/L de D-glucosa y 2,2 g/L de NaHCO₃	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)	D5671
Instrumento de impedancia (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EE. UU.)	\
Matrices de electrodos de 8 pocillos (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EE. UU.)	\	Base de PET con electrodo de trabajo de 0.049 mm^{2< / sup> y contraelectrodo de ~ 50 mm^{2< / sup> (oro)}}
Matrices de electrodos de 96 pocillos (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, EE. UU.)	\	Base de PET con dos electrodos (oro) con un área total de electrodos de 0,256 mm²
Suero fetal de ternero (FCS)	Biochrom (Berlín, Alemania)	S0615
Dihidrocloruro de histamina	Carl Roth (Karlsruhe, Alemania)	4017.1
Campana de flujo laminar (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Alemania)	51022515	armario de seguridad de clase II
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Alemania)	21083-027
L-glutamina	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)	G7513
Micropipeta grande (100 - 1000 µ L)	Brandt (Wertheim, Alemania)	704780
Micropipeta grande (20 - 200 y micro; L)	Brandt (Wertheim, Alemania)	704778
Microscopio (contraste de fase, Nikon Diaphot)	Nikon (Dü sseldorf, Alemania)
Penicilina/estreptomicina	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)	P0781
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)	D8537
Pipeta serológica	Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)	607 180
Pipeta (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Alemania)	26300
Tripsina	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Alemania)	T4174	en PBS con tubo de EDTA de 1 mM
, 15 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)	188 271
Tubo, 50 mL	Greiner bio-one (Frickenhausen, Alemania)	210 261
células U-373 MG	ATCC (Rockville, MD, EE. UU.)	ATCC HTB-17
(TW21)	Julabo (Seelbach, Alemania)	\

Baño de agua

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs.<....

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