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Artículo de método

Análisis del consumo de oxígeno de los islotes pancreáticos no humanos

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DOI:

10.3791/60696

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18 de diciembre de 2019

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1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University, 2Agilent Technologies, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 4Department of Veterans Affairs Tennessee Valley, 5Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University

En este artículo

Resumen

Este protocolo demuestra la medición precisa y reproducible del consumo de oxígeno en islotes pancreáticos de primates no humanos. Las técnicas de carga de islos y el recubrimiento de la microplaca proporcionan un marco para la medición eficiente de la respiración en otros tipos de esferoides cultivados.

Resumen

La medición del consumo de oxígeno en grupos esferoides de células, como islotes pancreáticos ex vivo, ha sido históricamente difícil. Demostramos la medición del consumo de oxígeno de los islos utilizando una microplaca de 96 pocillos diseñada para la medición del consumo de oxígeno en esferoides. En este ensayo, las microplacas esferoides están recubiertas con un adhesivo para células y tejidos el día anterior al ensayo. Utilizamos un pequeño volumen de solución adhesiva para fomentar la adherencia del isla solo a la parte inferior del pozo. El día del ensayo, 15 islotes se cargan directamente en la base de cada pozo utilizando una técnica que garantiza un posicionamiento óptimo de los islotes y una medición precisa del consumo de oxígeno. Varios aspectos de la respiración mitocondrial son sondeados farmacológicamente en islotes de primates no humanos, incluyendo respiración dependiente de ATP, respiración máxima y fuga de protones. Este método permite resultados consistentes y reproducibles utilizando sólo un pequeño número de islotes por pozo. Teóricamente se puede aplicar a cualquier esferoides cultivados de tamaño similar.

Introducción

Con el fin de mantener los niveles normales de glucosa en sangre, la célula pancreática debe sentir elevaciones en la glucosa y secretar insulina en consecuencia. El acoplamiento de la secreción de insulina con los niveles de glucosa está directamente relacionado con el metabolismo de la glucosa y la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Por lo tanto, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el acoplamiento estímulo-secreción1. La evaluación de la función mitocondrial de las células puede revelar defectos que conducen a una secreción de insulina deteriorada. La secreción de glucagón por células pancreáticas también está estrechamente ligada a la función mitocondrial2. Aunque las líneas celulares de islotes inmortalizadas han demostrado ser útiles para algunos tipos de ensayos, la fisiología de estas células no recapitula con precisión la función de islotes enteros, como lo ilustra la potenciación de la secreción de insulina por glucagón3,4 y la inhibición de la secreción de glucagón por insulina/somatostatina5,6 en islotes intactos. Esto demuestra la necesidad de medir el consumo de oxígeno utilizando islotes enteros e intactos.

Las técnicas para la medición de la respirometría de células de islotes han evolucionado con el tiempo, desde el uso de colorantes fluorescentes sensibles al oxígeno7 hasta sensores de estado sólido que miden directamente el consumo de oxígeno8. Inicialmente diseñadopara células monocapa y adherentes, los sistemas de placas de cultivo celular comúnmente utilizados han demostrado ser ineficaces para los islotes pancreáticos. Como los islotes no se adhieren naturalmente a los pozos, son propensos a ser empujados a la periferia del cultivo bien resultando en una medición inexacta del consumo de oxígeno9. Para combatir este problema, se desarrollaron placas especializadas de 24 pocillos con una depresión central que podría contener islotes9. Sin embargo, el sistema de placas de 24 pocillos estaba limitado por el gran número de islotes requeridos (50-80 por pozo) y el número de condiciones que se podían probar simultáneamente10. El reciente desarrollo de microplacas de 96 pocillos diseñadas específicamente para el análisis de flujo extracelular en esferoides ha superado estas barreras, permitiendo la medición de la respirometría de islotes con 20 o menos islotes por pozo10.

Aquí, demostramos el uso de este sistema para medir el consumo de oxígeno en los islotes del macaco japonés (Macaca fuscata), un modelo animal con biología de islotes similar a los humanos11,12. En este protocolo, se analizan 15 islotes macacos por pozo. En nuestras manos, 15 islotes por pozo produjeron un mayor consumo de oxígeno basal que menos islotes, con activación robusta y represión de la respiración en respuesta a la manipulación farmacológica. Destacamos los pasos para prepararnos para el ensayo, un método eficaz para la carga constante de islotes en el centro de cada pozo, y desafíos comunes al realizar este ensayo.

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Protocolo

1. Preparación de microplacas y cartuchos de sensores el día antes de ejecutar el ensayo

Los islotes fueron aislados de macacos japoneses de tres años como se describió anteriormente13. Este método es muy similar al utilizado para aislar los islotes humanos de los donantes de cadáveres, pero difiere de los ratones, en los que la páncreata a menudo se infla con solución de colagenasa mientras el animal está bajo sedación y antes de la extracción de órganos. La recuperación de islos se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregón (ONPRC) y la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón y fueron aprobados por la IACUC de la ONPRC. La ONPRC se atiene a la Ley y Reglamentos de Bienestar Animal aplicados por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la Política del Servicio de Salud Pública sobre El Cuidado y Uso De Animales de Laboratorio de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud.

  1. Preparación de la microplaca de esferoides
    1. Preparar 3 ml de una solución de 0,1 M de bicarbonato sódico. El filtro esteriliza la solución. Utilizamos un filtro de 0,45 m(Tabla de materiales).
    2. En una campana de cultivo celular, añadir 200 l de adhesivo celular y tisular(Tabla de materiales)a 2,8 ml de bicarbonato sódico de 0,1 M. A continuación, agregue 20 l de esta solución a la parte inferior de cada pocal de la microplaca esferoide de 96pocillos (Tabla de materiales). Asegúrese de que las burbujas de aire se eliminan de la punta del pipeteo y sólo la parte inferior de la placa está cubierta. El recubrimiento de la microplaca evita que los islotes se muevan hacia arriba por los lados de los pozos cuando se añaden medicamentos y se mezclan en el pozo durante el ensayo.
      NOTA: Sólo es necesario recubrir tantos pozos como se utilizará para los islotes cuando se ejecute el ensayo. Si sólo se utilizan unos pocos pozos, la solución adhesiva de la célula se puede reducir adecuadamente. El adhesivo celular utilizado en el ensayo es una solución proteica formulada extraída del mejillón marino. Alternativamente, los pozos de microplacas se pueden recubrir con 20 sL de poli-D-lisina de 100 g/ml.
    3. Incubar la placa en una incubadora de 37oC, no CO2 durante una hora.
    4. En un entorno estéril, aspirar la solución adhesiva celular de la placa. Lave cada pocal dos veces con 400 oC de agua estéril de 37 oC utilizando un pipeta multicanal. Dejar secar al aire.
    5. Después de 30-40 minutos, cubra la placa y guárdela durante la noche a 4oC.
  2. Hidratación del cartucho del sensor
    1. En un entorno estéril, abra el paquete del cartucho del sensor(Tabla de materiales)y retire el contenido. Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicios públicos.
    2. Llene cada pocal de la placa de servicios con 200 ml de agua estéril y baje el cartucho del sensor de nuevo en la placa de servicios públicos. Coloque el cartucho del sensor montado y la placa de servicio en una incubadora de 37 oC que no sea CO2 durante la noche.
  3. Preparación del calibrador
    1. Aliquot 25 mL de calibrador(Tabla de Materiales)en un tubo cónico de 50 ml. Colocar el tubo en una incubadora de 37oC, que no sea CO2 durante la noche.

2. Protocolo para la preparación de medios, carga de islotes y carga de cartucho de sensor el día del ensayo

  1. Preparación de medios
    1. A 48,5 ml de soporte base (DMEM mínimo, ver Tabla de materiales), añadir 500 ml cada uno de 1 mM de piruvato sódico y 2 mM de glutamina. Además, añadir 496 ml de 200 mg/ml de glucosa (la concentración final de glucosa en los medios es de 5,5 mM).
      NOTA: La concentración basal de glucosa se mantuvo constante para estos experimentos. Sin embargo, la glucosa también se puede utilizar para estimular la respiración además de las manipulaciones farmacológicas descritas soplar10.
    2. Confirme que el pH es 7,4 +/- 0,1, ajustando si es necesario.
  2. Preparación del cartucho del sensor
    1. Saque el cartucho del sensor de la incubadora, retire la tapa del cartucho del sensor y vierta el agua de los pozos. Coloque 200 ml de calibrador precalentado en cada pocil y reemplace la tapa del cartucho del sensor.
    2. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la incubadora durante aproximadamente 1 hora (hasta que sea necesario).
  3. Preparación de medicamentos para el ensayo de estrés mitocondrial
    1. Abra el kit de prueba de esfuerzo(Tabla de materiales)y elimine el contenido. Inventa stock y soluciones de trabajo para Oligomicina, Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) y Rotenone/Antimycin A (AA) de la siguiente manera.
      1. Oligomicina: añadir 630 l de medios montados al tubo para hacer un stock de 100 m. A continuación, diluir a 45 m con medios para obtener la concentración de puerto (la concentración final del pozo después de la inyección será de 4,5 m)
      2. FCCP: añadir 720 l de medios montados al tubo para hacer un stock de 100 m. Diluir a 10 m con medios para obtener la concentración de puertos (la concentración final del pozo será de 1 M)
        NOTA: BSA y/o FBS no deben añadirse a los medios, ya que esto puede afectar a la acción de los desacopladores mitocondriales14.
      3. Rotenona/AA: añadir 540 l de medios montados al tubo para hacer 50 m de stock. Diluir a 25 m con medios para obtener la concentración de puertos (la concentración final del pozo será de 2,5 m)
        NOTA: Las concentraciones anteriores han producido resultados consistentes en nuestras manos. El FCCP adicional no dio lugar a un mayor aumento de la respiración. Sin embargo, las concentraciones de fármacos pueden necesitar ser ajustadas dependiendo del tamaño de los islotes, y especialmente con islotes de diferentes especies o esferoides no islotes. Como referencia, el diámetro medio de un isla de primate no humano es de aproximadamente 150 m15.
  4. Preparación de placa esferoide y transferencia de islotes
    1. Pisera a mano en un plato de cultivo celular de 60 mm x 15 mm que contiene medios ensamblados para obtener una pureza cercana al 100%.
      NOTA: Los islotes deben aparecer redondeados, con una periferia claramente definida, y parecen más densos que los contaminantes del tejido exocrina. Evite los islotes que aparecen dañados o deshilachados. En este experimento, el tamaño del islote no se midió directamente, aunque intentamos seleccionar islotes de tamaño aproximadamente equivalente para cada pozo y muestra.
    2. Cargue cada pozo de microplaca esferoide con 175 ml de soporte ensamblado utilizando una pipeta multicanal.
    3. Usando una pipeta P20 establecida en 15 l, aspirar 15 islotes de la placa de cultivo celular. Los islotes deben ser visibles en la punta de la pipeta a simple vista.
    4. Para transferir islotes a microplaca esferoide, baje la punta de la pipeta hasta la parte inferior del pozo, apenas levante y pipetee lentamente un volumen muy pequeño (5 l). Confirme que todos los islotes han salido de la punta de la pipeta. Cada pozo debe recibir 15 islotes. Ocasionalmente revise la microplaca esferoide bajo el microscopio para verificar que los islotes están en la parte inferior de cada pozo en lugar de pegados a los lados.
      NOTA: Evite cargar los pozos de esquina con islotes. El oxígeno y el flujo de pH del plástico pueden ocurrir durante el ensayo, y esto se exacerba en los cuatro pozos de esquina.
    5. Una vez que todos los islotes han sido transferidos a la microplaca esferoide, incubar la microplaca en una incubadora de 37 oC, no CO2 mientras completa los pasos a continuación.
  5. Carga del cartucho del sensor y ejecución del ensayo
    1. Retire el cartucho del sensor de la incubadora. Los puertos A-C para cada pozo deben cargarse con medicamentos o medios. Los pozos que contienen islotes y los cuatro pozos de esquina deben estar cargados con droga. Los pozos que no son de esquina sin islotes deben cargarse con medios. El puerto D se puede dejar vacío. Puerto de carga A (arriba a la izquierda de cada sensor) con 20 ml de oligomicina o medios. Cargue el puerto B (arriba a la derecha) con 22 sl de FCCP o de medios. Puerto de carga C (abajo a la izquierda) con 25 s de Rotenone/AA o medios.
    2. Programe un ensayo analizador de flujo extracelular para un período de respiración basal de 30 minutos (5 ciclos de mezcla de 3 minutos, medida de 3 minutos), período de medición de oligomicina de 42 minutos (7 ciclos de mezcla de 3 minutos, medida de 3 minutos), 30 minutos FCCP (5 ciclos de mezcla de 3 minutos, 3 minutos de medida) y 30 minutos Rotenone/AA (5 ciclos de mezcla de 3 minutos, 3 minutos de medida).
    3. Ejecute el ensayo y siga las instrucciones en pantalla para calibrar el sensor e insertar la microplaca.

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Resultados

Para cargar islotes en microplacas, se deben aspirar 15 islotes en 15 ml de medios, como se muestra en la Figura 1A. Los islotes se asentarán naturalmente hacia la parte inferior de la punta del pipeteo en pocos segundos. Luego, la punta de la tubería se baja a la parte inferior del pozo. La punta se levanta ligeramente, y un pequeño volumen (alrededor de 5 ollos) se pipetea junto con los islotes. Esta técnica da como resultado la colocación ...

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Discusión

El estudio del consumo de oxígeno de los islotes se ha visto obstaculizado anteriormente por la forma esférica de los islotes, su falta de adherencia a las superficies de cultivo y el número de islotes requeridos por pozo. En este protocolo, destacamos la eficacia de la microplaca esferoide de 96 pocillos para medir el consumo de oxígeno de los islotes en un pequeño número de islotes y demostramos una técnica para manipular y cargar islotes que es técnicamente factible y produce Resultados.

Pa...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean reconocer el Núcleo de Cribado de Alto Rendimiento de Vanderbilt por el uso de sus instalaciones, Agilent Biotechnologies, el Dr. Paul Kievit (Universidad de Salud y Ciencia de Oregón) para los aislamientos de islas de primates no humanos, y Eric Donahue (Universidad DeVanderbilt) para obtener ayuda con la Figura 1. J.M.E. fue apoyado por NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio T32GM007347. M.G. fue apoyado por el NIH/NIDDK (R24DK090964-06) y el Departamento de Asuntos de Veteranos (BX003744).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo celular, 60 mm X 15 mm estiloCorning430166
Cell-Tak Adhesivo para células y tejidosCorning354240
Tubo cónico, 50 mLFalcon352070
Dextrosa anhidraFisher ScientificBP350-1Para solución de glucosa, 200 mg/ml, fileteada estéril
Depósitos desechables (estériles), 25 MLVistalab3054-1033para la carga de pipeta multicanal
EZFlow Sterile 0.45 μ m PES Filtro de jeringa, 13 mmFoxx Life Sciences371-3115-OEM
L-glutaminaGibco25030-081200 mM (100x)
Puntas de pipeta multicanalThermoFisher Scientific94410810
Pipeta multicanal, 15-1250 μ L ThermoFisherScientific4672100BTPipetas
P20, P200 y P1000recomendadas Sondade pH 2231000602
Hanna InstrumentsHI2210-01
Puntas de pipeta, 20 μ L, 200 μ L, 1000 μ LOlympus24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base MediaAgilent103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test KitAgilent103015-100Incluye oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A
Analizador Seahorse XFe96AgilentS7800BIncluye estación de preparación con 37 ° C incubadora sin CO2
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak MiniAgilent102905-100Incluye cartucho de sensor, microplaca de esferoide y calibrante
Bicarbonato de sodioFisher ScientificBP328-500
Piruvato de sodioGibco11360-070100 mM (100x)
Microscopio estereoscópicoOlympusSZX9
Jeringa (estéril), 5 mLBD309603Para filtración estéril
Agua (estéril)SigmaW3500-500mL
Eppendorf

Referencias

  1. Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
  2. Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
  3. Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420(1970).
  4. Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
  5. Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139(2019).
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  10. Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
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