Este protocolo demuestra la medición precisa y reproducible del consumo de oxígeno en islotes pancreáticos de primates no humanos. Las técnicas de carga de islos y el recubrimiento de la microplaca proporcionan un marco para la medición eficiente de la respiración en otros tipos de esferoides cultivados.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Análisis del consumo de oxígeno de los islotes pancreáticos no humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
La medición del consumo de oxígeno en grupos esferoides de células, como islotes pancreáticos ex vivo, ha sido históricamente difícil. Demostramos la medición del consumo de oxígeno de los islos utilizando una microplaca de 96 pocillos diseñada para la medición del consumo de oxígeno en esferoides. En este ensayo, las microplacas esferoides están recubiertas con un adhesivo para células y tejidos el día anterior al ensayo. Utilizamos un pequeño volumen de solución adhesiva para fomentar la adherencia del isla solo a la parte inferior del pozo. El día del ensayo, 15 islotes se cargan directamente en la base de cada pozo utilizando una técnica que garantiza un posicionamiento óptimo de los islotes y una medición precisa del consumo de oxígeno. Varios aspectos de la respiración mitocondrial son sondeados farmacológicamente en islotes de primates no humanos, incluyendo respiración dependiente de ATP, respiración máxima y fuga de protones. Este método permite resultados consistentes y reproducibles utilizando sólo un pequeño número de islotes por pozo. Teóricamente se puede aplicar a cualquier esferoides cultivados de tamaño similar.
Introducción
Con el fin de mantener los niveles normales de glucosa en sangre, la célula pancreática debe sentir elevaciones en la glucosa y secretar insulina en consecuencia. El acoplamiento de la secreción de insulina con los niveles de glucosa está directamente relacionado con el metabolismo de la glucosa y la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Por lo tanto, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el acoplamiento estímulo-secreción1. La evaluación de la función mitocondrial de las células puede revelar defectos que conducen a una secreción de insulina deteriorada. La secreción de glucagón por células pancreátic....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de microplacas y cartuchos de sensores el día antes de ejecutar el ensayo
Los islotes fueron aislados de macacos japoneses de tres años como se describió anteriormente13. Este método es muy similar al utilizado para aislar los islotes humanos de los donantes de cadáveres, pero difiere de los ratones, en los que la páncreata a menudo se infla con solución de colagenasa mientras el animal está bajo sedación y antes de la extracción de órganos. La recuperación de islos se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Investig....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para cargar islotes en microplacas, se deben aspirar 15 islotes en 15 ml de medios, como se muestra en la Figura 1A. Los islotes se asentarán naturalmente hacia la parte inferior de la punta del pipeteo en pocos segundos. Luego, la punta de la tubería se baja a la parte inferior del pozo. La punta se levanta ligeramente, y un pequeño volumen (alrededor de 5 ollos) se pipetea junto con los islotes. Esta técnica da como resultado la colocación .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El estudio del consumo de oxígeno de los islotes se ha visto obstaculizado anteriormente por la forma esférica de los islotes, su falta de adherencia a las superficies de cultivo y el número de islotes requeridos por pozo. En este protocolo, destacamos la eficacia de la microplaca esferoide de 96 pocillos para medir el consumo de oxígeno de los islotes en un pequeño número de islotes y demostramos una técnica para manipular y cargar islotes que es técnicamente factible y produce Resultados.
Pa.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer el Núcleo de Cribado de Alto Rendimiento de Vanderbilt por el uso de sus instalaciones, Agilent Biotechnologies, el Dr. Paul Kievit (Universidad de Salud y Ciencia de Oregón) para los aislamientos de islas de primates no humanos, y Eric Donahue (Universidad DeVanderbilt) para obtener ayuda con la Figura 1. J.M.E. fue apoyado por NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio T32GM007347. M.G. fue apoyado por el NIH/NIDDK (R24DK090964-06) y el Departamento de Asuntos de Veteranos (BX003744).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de cultivo celular, 60 mm X 15 mm estilo | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Adhesivo para células y tejidos | Corning | 354240 | |
| Tubo cónico, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrosa anhidra | Fisher Scientific | BP350-1 | Para solución de glucosa, 200 mg/ml, fileteada estéril |
| Depósitos desechables (estériles), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | para la carga de pipeta multicanal |
| EZFlow Sterile 0.45 μ m PES Filtro de jeringa, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamina | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Puntas de pipeta multicanal | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Pipeta multicanal, 15-1250 μ L ThermoFisher | Scientific | 4672100BT | Pipetas |
| P20, P200 y P1000 | recomendadas Sonda | de pH 2231000602 | |
| Hanna Instruments | HI2210-01 | ||
| Puntas de pipeta, 20 μ L, 200 μ L, 1000 μ L | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Incluye oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A |
| Analizador Seahorse XFe96 | Agilent | S7800B | Incluye estación de preparación con 37 ° C incubadora sin CO2 |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Incluye cartucho de sensor, microplaca de esferoide y calibrante |
| Bicarbonato de sodio | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Microscopio estereoscópico | Olympus | SZX9 | |
| Jeringa (estéril), 5 mL | BD | 309603 | Para filtración estéril |
| Agua (estéril) | Sigma | W3500-500mL |
Referencias
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Etiquetas
Islotes de primates no humanosmedición del consumo de oxígenoensayo en microplaca de esferoidesanálisis de la respiración mitocondrialtécnica de adhesión de islotesanalizador de flujo extracelularoligomicina FCCP rotenonaprotocolo de siembra de islotesmanipulación de islotes primariosevaluación de la función mitocondrial
