Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

Yongliang Zhang; Yuanyuan Li; Xinxin Yang; Zhiyan Wen; Ugrappa Nagalakshmi; Savithramma P. Dinesh-Kumar

doi:10.3791/60728

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Artículo de método

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

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DOI:

10.3791/60728

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17 de mayo de 2020

Yongliang Zhang^*¹ , Yuanyuan Li^*²^,³ , Xinxin Yang¹ , Zhiyan Wen¹ , Ugrappa Nagalakshmi² , Savithramma P. Dinesh-Kumar²^,³

¹State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, ²Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, ³Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Resumen

Las técnicas de etiquetado de proximidad (PL) que utilizan ascorbato peroxidasa (APEX) o Escherichia coli biotin ligase BirA (conocida como BioID) se han utilizado con éxito para la identificación de interacciones proteína-proteína (IPP) en células de mamíferos. Sin embargo, los requisitos de peróxido de hidrógeno tóxico (H₂O₂) en PL basado en APEX, tiempo de incubación más largo con biotina (16–24 h) y mayor temperatura de incubación (37 oC) en PL basado en BioID limitan gravemente sus aplicaciones en plantas. El PL basado en TurboID recientemente descrito aborda muchas limitaciones de BioID y APEX. TurboID permite el etiquetado rápido de proximidad de proteínas en tan solo 10 minutos en condiciones de temperatura ambiente (RT). Aunque la utilidad de TurboID se ha demostrado en modelos animales, recientemente demostramos que la PL basada en TurboID funciona mejor en plantas en comparación con BioID para el etiquetado de proteínas que son proximales a una proteína de interés. Aquí se proporciona un protocolo paso a paso para la identificación de socios de interacción proteica utilizando el dominio del receptor N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la familia de proteínas de repetición rica en leucina (NLR) de unión a nucleótidos como modelo. El método describe la construcción vectorial, la agroinfiltración de construcciones de expresión de proteínas, el tratamiento de la biotina, la extracción y desalación de proteínas, la cuantificación y el enriquecimiento de las proteínas biotinyladas mediante la purificación de afinidad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar otras proteínas de interés en Nicotiana y otras especies de plantas.

Introducción

Los IBP son la base de varios procesos celulares. Los métodos tradicionales para identificar los IBP incluyen el cribado de levadura-dos híbridos (Y2H) y la inmunoprecipitación junto con espectrometría de masas (IP-MS)¹. Sin embargo, ambos sufren de algunas desventajas. Por ejemplo, el cribado De2H requiere la disponibilidad de la biblioteca Y2H de las especies vegetales o animales objetivo. La construcción de estas bibliotecas es costosa y laboriosa. Además, el enfoque Y2H se realiza en la levadura de organismo eucariota de una sola célula heteróloga, que puede no representar el estado celular de las células eucariotas superiores.