Artículo de método

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

DOI:

10.3791/60728

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17 de mayo de 2020

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1State Key Laboratory of Agro-Biotechnology and Ministry of Agriculture Key Laboratory of Soil Microbiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Resumen

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Las técnicas de etiquetado de proximidad (PL) que utilizan ascorbato peroxidasa (APEX) o Escherichia coli biotin ligase BirA (conocida como BioID) se han utilizado con éxito para la identificación de interacciones proteína-proteína (IPP) en células de mamíferos. Sin embargo, los requisitos de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en PL basado en APEX, tiempo de incubación más largo con biotina (16–24 h) y mayor temperatura de incubación (37 oC) en PL basado en BioID limitan gravemente sus aplicaciones en plantas. El PL basado en TurboID recientemente descrito aborda muchas limitaciones de BioID y APEX. TurboID permite el etiquetado rápido de proximidad de proteínas en tan solo 10 minutos en condiciones de temperatura ambiente (RT). Aunque la utilidad de TurboID se ha demostrado en modelos animales, recientemente demostramos que la PL basada en TurboID funciona mejor en plantas en comparación con BioID para el etiquetado de proteínas que son proximales a una proteína de interés. Aquí se proporciona un protocolo paso a paso para la identificación de socios de interacción proteica utilizando el dominio del receptor N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la familia de proteínas de repetición rica en leucina (NLR) de unión a nucleótidos como modelo. El método describe la construcción vectorial, la agroinfiltración de construcciones de expresión de proteínas, el tratamiento de la biotina, la extracción y desalación de proteínas, la cuantificación y el enriquecimiento de las proteínas biotinyladas mediante la purificación de afinidad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar otras proteínas de interés en Nicotiana y otras especies de plantas.

Introducción

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Los IBP son la base de varios procesos celulares. Los métodos tradicionales para identificar los IBP incluyen el cribado de levadura-dos híbridos (Y2H) y la inmunoprecipitación junto con espectrometría de masas (IP-MS)1. Sin embargo, ambos sufren de algunas desventajas. Por ejemplo, el cribado De2H requiere la disponibilidad de la biblioteca Y2H de las especies vegetales o animales objetivo. La construcción de estas bibliotecas es costosa y laboriosa. Además, el enfoque Y2H se realiza en la levadura de organismo eucariota de una sola célula heteróloga, que puede no representar el estado celular de las células eucariotas superiores.

Por el contrario, IP-MS muestra baja eficiencia en la captura de IBP transitorios o débiles, y también es inadecuado para aquellas proteínas con baja abundancia o alta hidrofobicidad. Muchas proteínas importantes implicadas en las vías de señalización de la planta como las quinasas similares a los receptores (RK) o la familia NLR de receptores inmunes se expresan en niveles bajos y a menudo interactúan con otras proteínas de forma transitoria. Por lo tanto, restringe en gran medida la comprensión de los mecanismos subyacentes a la regulación de estas proteínas.

Recientemente, se han desarrollado y utilizado métodos de etiquetado de proximidad (PL) basados en ascorbato peroxidasa (APEX) y un mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conocido como BioID) para el estudio de los IBP2,,3,4. El principio de PL es que una proteína objetivo de interés se fusiona con una enzima, que cataliza la formación de biotinyl-AMP de lábil (bio-AMP). Estos bio-AMP libres son liberados por las enzimas PL y difuminados a la proximidad de la proteína diana, permitiendo la biotinilación de proteínas proximales en las aminas primarias dentro de un radio estimado de 10 nm5.

Este enfoque tiene ventajas significativas sobre los enfoques tradicionales Y2H e IP-MS, como la capacidad de capturar PPI transitorios o débiles. Además, PL permite el etiquetado de proteínas proximales de la proteína diana en sus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL tienen desventajas únicas al aplicarlas a diferentes sistemas. Por ejemplo, aunque APEX ofrece una cinética de etiquetado más alta en comparación con BioID y se aplica con éxito en sistemas de mamíferos, el requisito de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en este enfoque hace que no sea adecuado para estudios de PL en plantas.

Por el contrario, la PL basada en BioID evita el uso del tóxico H2O2, pero la tasa de etiquetado es lenta (requiere 18-24 h para completar la biotinylación), lo que hace que la captura de IBP transitorios sea menos eficiente. Por otra parte, la temperatura de incubación más alta (37 oC) necesaria para el PL eficiente por BioID introduce estrés externo a algunos organismos, como las plantas4. Por lo tanto, se ha notificado un despliegue limitado de PL a base de BioID en plantas (es decir, protoplastias de arroz, Arabidopsis y N. benthamiana) 6,7,8,9. La enzima TurboID recientemente descrita supera las deficiencias de APEX y PL. basado en BioID demostró una alta actividad que permite la realización de PL dentro de 10 min en RT10. La PL basada en TurboID se ha aplicado con éxito en células de mamíferos, moscas y gusanos10. Recientemente, nosotros y otros grupos de investigación optimizamos y ampliamos de forma independiente el uso de PL basado en TurboID para el estudio de los IBP en diferentes sistemas vegetales, incluyendo las plantas de N. benthamiana y Arabidopsis y raíces peludas de tomate11,,12,,13,,14. Los análisis comparativos indicaron que TurboID funciona mejor para PL en plantas en comparación con BioID11,14. También ha demostrado la robustez de la PL basada en TurboID en planta mediante la identificación de una serie de interacciones novedosas con un receptor inmune NLR11, una proteína cuyos socios de interacción son generalmente difíciles de obtener utilizando métodos tradicionales.

Este protocolo ilustra el PL basado en TurboID en planta describiendo la identificación de proteínas de interacción del dominio N-terminal TIR del receptor inmune NLR en plantas de N. benthamiana. El método se puede extender a cualquier proteína de interés en N. benthamiana. Más importante aún, proporciona una referencia importante para la investigación de IBP en otras especies vegetales como Arabidopsis,tomate, y otros.

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Protocolo

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NOTA: En la Figura 1se muestra una descripción general del método.

1. Preparación de materiales vegetales

  1. Cultivar semillas de N. benthamiana en suelo húmedo a alta densidad y mantenerlas en una cámara climática con una luz de 16 h (alrededor de 75 omol/m2s) y fotoperiodo oscuro de 8 h a 23-25 oC.
  2. Aproximadamente 1 semana más tarde, transfiera cuidadosamente cada plántula joven a ollas de 4' x 4' y mantenga las plántulas en la misma cámara.
  3. Mantener las plantas en la cámara durante aproximadamente 4 semanas hasta que crezcan hasta una etapa de hoja de 4-8 para la posterior agroinfiltración15.

2. Construcción de fusiones TurboID

  1. Utilice la técnica de clonación molecular estándar para generar la fusión de la proteína diana con TurboID (PCR TurboID de Plásmido de Addgene #107177). Aquí, usamos el dominio N-terminal TIR del receptor inmune NLR como la proteína objetivo de interés y construido TIR fusionado a TurboID bajo el control del promotor del virus de mosaico de coliflor 35S (p35S::TIR-TurboID).
    NOTA: La fusión de la enzima TurboID al carboxilo-terminus o amino-terminus de la proteína diana dependerá de la proteína de interés. Por lo general, para una proteína citoplasmasmática, ambos termini deben ser aceptables, siempre y cuando la fusión TurboID no afecte la función de la proteína diana. Sin embargo, para una proteína localizada por membrana, la topología proteica debe caracterizarse de antemano antes de determinar qué terminus es mejor para la fusión TurboID.
  2. Construir un citrino fusionado con TurboID bajo el mismo promotor para servir como el control para el posterior análisis proteómico cuantitativo.
    NOTA: Es importante construir un control TurboID para identificar el proteome proximal a la proteína objetivo. El control de fusión TurboID debe mostrar un nivel de expresión similar al de la proteína diana fusionada con TurboID. Esto se puede determinar empíricamente ajustando la concentración de Agrobacterium durante la agroinfiltración. Además, es importante que la proteína de control tenga un patrón de localización subcelular similar al de la proteína diana de interés.

3. Agroinfiltración

  1. Transformación de los plásmidos a Agrobacterium
    1. Añadir 0,5 g de los plásmidos generados a partir de los pasos 2.1 y 2.2 a 50 l de las células competentes de la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101, preparadas como se describió anteriormente16.
      NOTA: También se pueden utilizar otras cepas de Agrobacterium, como GV2260.
    2. Incubar sobre hielo durante 30 min.
    3. Choque de calor en un baño de agua a 42 oC durante 60 s.
    4. Añadir 400 ml de medio de LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl; pH a 7,0) a la Agrobacterium e incubar a 28oC durante 90 min.
    5. Placar todo el contenido en el tubo en el agar LB complementado con antibióticos adecuados para seleccionar el plásmido, así como para el Agrobacterium (para GV3101: 50 mg/L gentamicina y 50 mg/L rifampicina).
    6. Incubar placas a 28oC durante 36–48 h hasta que las colonias individuales sean visibles.
  2. Recoger y rayar varias colonias individuales en una placa de agar LB fresco con antibióticos (ver paso 3.1.5) y crecer a 28 oC durante la noche.
    NOTA: Es más óptimo realizar la COLONIA PCR para confirmar la presencia de la construcción binaria específica en el Agrobacterium. En nuestra experiencia, más del 95% de las colonias contienen las construcciones binarias introducidas.
  3. Inocular 3 ml de medio LB más antibióticos apropiados (ver paso 3.1.4) con la colonia Agrobacterium albergando la construcción de interés, e incubar agitando durante la noche a 28 oC hasta que la DO600 del cultivo de Agrobacterium alcance 2.0.
  4. Centrifugar las células a 3.000 x g y resuspenderlas a OD600 a 1,0 en tampón de agroinfiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH a 5,6], 250 m de acetosiringona).
    NOTA: Aunque es óptimo incubar el inóculo durante 2 h en RT antes de la agroinfiltración, en nuestra experiencia con la cepa GV3101, no ha habido una gran diferencia entre la expresión de proteína diana con frente a sin incubación.
  5. Utilice una jeringa sin aguja de 1 ml para infiltrarse en el inóculo en la epidermis (abaxial) de las hojas de N. benthamiana completamente maduras.
    NOTA: Para preparar una cantidad suficiente de materiales de hoja para tres réplicas biológicas: una hoja entera generalmente se infiltra, tres hojas se infiltran por planta, y se utilizan de tres a cuatro plantas para cada construcción. Para cada hoja, 1.5–2.0 mL de agrobacterias resuspendidas es suficiente.
  6. Después de 36 h de post-infiltración (hpi), infiltrarse 200 m de biotina (en 10 mM MgCl2 solución) en las hojas pre-infiltradas con construcciones TurboID.
  7. Mantener la planta durante 3-12 horas adicionales antes de cosechar el tejido de la hoja como se describe en la sección 4.
    NOTA: La razón para elegir los 36 hpi para la infiltración de biotina es que la expresión de proteína objetivo alcanza su punto máximo en este momento según estudios anteriores11. Se recomienda determinar el tiempo necesario para una expresión óptima de la proteína objetivo de interés. El tiempo de incubación después de la infiltración de biotina depende del diseño experimental y la proteína diana en estudio. Por lo general, 3-12 h de tratamiento de biotina permite el etiquetado de la mayoría de las proteínas proximales a la proteína diana por las fusiones TurboID.

4. Recogida de muestras de hojas

NOTA: Para el procesamiento posterior de las muestras de hojas, use guantes estériles para evitar la contaminación por queratina de las muestras. Todos los reactivos también deben estar lo más libres de queratina como sea posible.

  1. Cortar las hojas infiltradas en la base del pecíolo, eliminar la vena de la hoja, a continuación, flash-congelar el tejido de la hoja en nitrógeno líquido.
  2. Moler el tejido de la hoja con un mortero y un mortero y almacenar el polvo de la hoja en tubos de halcón de 15 ml o 50 ml a -80 oC para su uso posterior.
    NOTA: Tome de tres a cuatro piezas de hojas para cada una de las tres réplicas biológicas de diferentes plantas. El protocolo se puede pausar aquí. Antes de las etapas posteriores, se recomienda evaluar la expresión proteica y la biotinylación de la proteína diana mediante análisis inmunoblot. Las manchas occidentales típicas se muestran en la Figura 2.

5. Extracción de proteína total de la hoja

  1. Transfiera aproximadamente 0,35 g de polvo de hoja a un tubo de 2 ml. Prepare dos tubos para cada muestra.
    ADVERTENCIA: Use guantes cuando toque cualquier objeto enfriado por nitrógeno líquido.
  2. Añadir 700 l de tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl [pH a 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [p/v], 0,5% desoxicolato de sodio [p/v], 1 mM de TDT, 1 comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa) a 0,35 g de polvo de hoja.
  3. Vortex los tubos durante 10 min.
  4. Deje las muestras en hielo durante 30 minutos.
  5. Mezcle el contenido cada 4-5 minutos girando los tubos al revés varias veces.

6. Eliminación de la biotina libre por desalación

NOTA: Esta sección tarda unos 50 minutos.

  1. Equilibrar la columna de desalación.
    1. Retire el sellador en la parte inferior de la columna de desalación y coloque la columna en un tubo de 50 ml.
    2. Retire la solución de almacenamiento por centrifugación a 1000 x g y 4 oC durante 2 min y asegúrese de que la tapa esté aflojada.
    3. Coloque la columna de desalación en un tubo de 50 ml. Equilibrar la columna 3x con 5 ml de tampón de lisis RIPA, cada vez centrifugando a 1000 x g y 4 oC durante 2 min y descartando el flujo.
    4. Transfiera la columna de desalación a un nuevo tubo de 50 ml y guárdela temporalmente a 4 oC para su uso posterior.
  2. Gire los tubos del paso 5.4 a 16.500 x g y 4 oC durante 10 minutos y transfiera el sobrenadante de los dos tubos a un nuevo tubo de 2 ml.
  3. Añadir 1.500 l de extracto proteico a la parte superior de la resina de la columna de desalación equilibrada (del paso 6.1.4). Cuando el extracto proteico entre en la resina, agregue otros 100 l de tampón de lisis RIPA.
    NOTA: Aunque se utilizaron 1.400 l de tampón de lisis RIPA para la extracción de proteínas de las hojas, el volumen total después de la extracción y desalación de proteínas se incrementó invariablemente en cierta medida en relación con el volumen original. Por lo tanto, una combinación de las muestras de cada grupo como se describe en los pasos 5.1 y 5.4 puede dar lugar a al menos 1.500 l de extracto de proteína por muestra.
  4. Centrifugar a 1000 x g y 4oC durante 2 min y dejar las muestras desaladas en hielo temporalmente.

7. Cuantificación de los extractos de proteína dessalada utilizando un ensayo de Bradford

  1. Preparar 50 ml de cada solución de BSA degradada: 0 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml y 1 mg/ml.
  2. Diluir el extracto de proteína desalada mezclando una muestra de 5 ml con 45 ml de ddH2O.
  3. Preparar 1 x regente Bradford diluyendo el regente 5x Bradford (100 mg de Coomassie azul brillante G250, 47 mL de metanol, 100 mL de 85% ácido fosfórico, 53 mL de ddH2O).
  4. Añadir 50 ml de la solución de BSA de cada gradiente y 50 l de extracto de proteína diluida a los 2,5 ml de 1 regente de Bradford.
  5. Incubar a RT durante 10 min.
  6. Añadir 200 ml de solución de cada muestra a un pozo de una placa ELISA (tres réplicas técnicas por muestra).
  7. Mida el OD595 con un lector de microplacas.
  8. Dibuje la curva estándar en función del valor de la solución BSA degradada y calcule la concentración de las muestras de proteínas desaladas. Por lo general, la concentración total de proteínas obtenida a partir de 0,7 g de hojas oscila entre 3 y 6 mg/ml.
  9. Preparar 6–8 mg de extracto de proteína desalada para la posterior purificación de afinidad.

8. Enriquecimiento de proteínas biotinyladas

  1. Tomar 200 l de perlas magnéticas conjugadas con streptavidn-C1 en un tubo de 2 ml.
  2. Equilibrar las perlas magnéticas conjugadas estreptavivida-C1 con 1 ml de tampón de lisis RIPA durante 1 min en RT.
  3. Después de cada lavado, utilice el estante magnético para adsorjar las perlas durante 3 minutos y retire suavemente la solución pipeteando.
  4. Repita los pasos 8.2 y 8.3.
  5. Transfiera el extracto de proteína desalada a las cuentas magnéticas conjugadas conjugadas con streptavidn-C1 equilibradas.
  6. Incubar el tubo a 4 oC durante 12 h (o durante la noche) en un rotador para purificar las proteínas biotiniladas.
  7. Capturar las perlas en un bastidor magnético durante 4 minutos en RT hasta que las perlas se acumulan en un lado del tubo, a continuación, retire suavemente el sobrenadante por pipeta.
  8. Añadir 1,7 ml de tampón de lavado I (2% SDS en agua) al tubo y mantenerlo en el rotador en RT durante 8 min. Repita el paso 8.3.
  9. Añadir 1,7 mL de tampón de lavado II (50 mM HEPES: pH a 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de ácido desoxicólico [w/v], 1% De tritón X-100) al tubo y mantenerlo en el rotador a RT durante 8 min.
  10. Añadir 1,7 mL de tampón de lavado III (10 mM Tris-HCl: pH a 7,4, 250 mM de LiCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de ácido desoxicólico [w/v], 1% NP40 [v/v]) al tubo y mantenerlo en el rotador a RT durante 8 min. Repita el paso 8.3.
  11. Añadir 1,7 ml de 50 mM Tris-HCl (pH a 7,5) para retirar el detergente y, a continuación, repita el paso 8.3.
  12. Transfiera las perlas a un nuevo tubo de 1,5 ml y repita los pasos 8.11 y 8.3.
  13. Lave las perlas 6x durante 5 min cada una con tampón de bicarbonato de amonio de 50 mM en RT.
  14. Añadir 1 mL de amortiguador de bicarbonato de amonio de 50 mM a las perlas magnéticas y mezclar bien.
  15. Retirar 100 l de perlas para el análisis de inmunoblot para confirmar el enriquecimiento de proteínas biotinyladas. En la Figura 3se muestra una mancha occidental típica.
  16. Congele con flash el resto de las muestras de proteínas y se almacene a -80 oC o envíelas inmediatamente para el análisis de LC-MS/MS en hielo seco.
    NOTA: Los resultados típicos de la EM se muestran en una publicación anterior (Zhang et al. 2019; Figura 2, Datos suplementarios 1 y Datos complementarios 2)11. Todos los conjuntos de datos están disponibles en MassIVE (que se encuentra en ) utilizando el identificador: MSV000083018 y MSV000083019.

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Resultados

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Los datos representativos, que ilustran los resultados esperados basados en el protocolo descrito, se adaptan de Zhang et al11. La Figura 1 resume los procedimientos para realizar PL basado en TurboID en N. benthamiana. La Figura 2 muestra la expresión proteica y biotinylación en las hojas infiltradas de N. benthamiana. La Figura 3 muestra que las proteínas biotiniladas en las hojas infiltra...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ligaa de biotina TurboID es generada por la evolución dirigida basada en la visualización de levaduras del BioID10. Tiene muchas ventajas sobre otras enzimas PL. TurboID permite la aplicación de PL a otros sistemas de modelos, incluyendo moscas y gusanos, cuya temperatura óptima de crecimiento es de alrededor de 25 oC10. Aunque el enfoque PL ha sido ampliamente utilizado en sistemas animales, su aplicación en plantas es limitada. El protocolo descrito aquí proporciona un...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Ciencia y Tecnología Transgénica (2019ZX08010-003 a Y.Z.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31872637 a Y.Z.), y los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales (2019TC028 a Y.Z.), y NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, y NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Espectrofotómetro 721Metash, fabricado en ChinaQ/SXFZ6para medición OD600
Bicarbonato de amonioSigmaA6141-500G
BiotinaSigmaB4639-1G50 mM Centrífuga
EppendorfCentrífuga 5702
CentrífugaEppendorf5417R
Cóctel de inhibidores de proteasa OmpleteRoche11697489001
Ácido desoxicólicoSigmaD2510-100G
DL-Dthiothreitol (DTT)VWR Life Science0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Invitrogen65001Para la purificación por afinidad
EDTASigmaE6758-500G
Placa ELISACorningCostar 3590
HEPESSigmaH3375-1KG
Ácido clorhídrico (HCl)Fisher ScientificA144S-212
Immobilon-P Membrana PVDFMilliporeIPVH00010Para el análisis de Western blot
Solución de cloruro de litio (LiCl), 8MSigmaL7026-500ML
Refrigerado a baja velocidad centrífugaZonkia, fabricada en ChinaKDC-2046para desalinizar
cloruro de magnesio, hexahidrato (MgCl2· 6H2O)SigmaM9272-500G
Rack magnéticoInvitrogen123.21DPara la adsorción de cordones
Multiskan FC Microplato FotómetroThermo Fisher ScientificN07710Para OD595 medición NP-40
(IGEPAL CA-630)SigmaI8896-100ML
Rata anti-HARoche11867423001
Mezclador rotacionalKylin-Bell Lab InstrumentWH-986para
IP Incubadora de choqueLabotery, hecho en ChinaZQPZ-228
Cloruro de sodio (NaCl)Fisher ScientificS271-3
Desoxicolato de sodioSigmaD2510-100G
Dodecil sulfato de sodio (SDS)SigmaL4390-1KG
Estreptavidina-HRPAbcamab7403
Tritón X-100Fisher ScientificBP151-100
Trizma baseSigmaT1503-1KG
VortexScientific IndustriesG-560E
Water-jacket IncubadoraAzul pard, hecho en ChinaGHP-9080Para incubación
AgrobacteriumColumna desalinizadora Zeba SpinThermo Fisher Scientific89893Para la eliminación de biotina

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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