Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Summary

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Abstract

El estudio de múltiples modificaciones post-traduccionales (PTM) de proteínas es un paso crucial para entender la conversación cruzada de PTM y obtener información más holística sobre la función de las proteínas. A pesar de la importancia de los estudios de enriquecimiento multi-PTM, pocos estudios investigan más de una PTM a la vez, debido en parte a los gastos, el tiempo y las grandes cantidades de proteínas necesarias para realizar múltiples análisis proteómicos globales de los MPT. El enriquecimiento de afinidad "one-pot" detallado en este protocolo supera estas barreras al permitir la identificación y cuantificación simultánea de péptidos con residuos de lisina que contienen acetilación y succinilación PTMs con bajas cantidades de muestra Entrada. El protocolo implica la preparación de lisado proteico a partir de hígados de ratón de ratones knockout SIRT5, rendimiento de la digestión de trippsina, enriquecimiento para los PTM s y rendimiento del análisis espectrométrico de masas utilizando un flujo de trabajo de adquisición independiente de datos (DIA). Debido a que este flujo de trabajo permite el enriquecimiento de dos PTM de la misma muestra simultáneamente, proporciona una herramienta práctica para estudiar la conversación cruzada PTM sin necesidad de grandes cantidades de muestras, y reduce en gran medida el tiempo necesario para la preparación de la muestra, los datos de datos adquisición y análisis. El componente DIA del flujo de trabajo proporciona información completa específica de PTM. Esto es particularmente importante cuando se estudia la localización del sitio PTM, ya que DIA proporciona conjuntos completos de iones de fragmentos que se pueden descifrar computacionalmente para diferenciar entre diferentes isoformas de localización de PTM.

Introduction

Una infinidad de modificaciones post-traduccionales regulan dinámicamente las proteínas y vías a través de efectos sobre la actividad¹, señalización², y la rotación^3,4. Por ejemplo, las quinasas proteicas se activan o desactivan mediante la adición de los grupos de fosfato^5,y la acetilación con histona y otras modificaciones proporcionan un mecanismo para cambiar la estructura de la cromatina y servir como mecanismos reguladores transcripcionales^6,7. En los últimos años, se ha demostrado que múltiples PTMs trabajan en concierto o compiten para regular la función o actividad proteica^8,9,10,11. Por lo tanto, entender la interferencia PTM es una necesidad emergente en la investigación de PTM. Sin embargo, la mayoría de los flujos de trabajo proteómicos disponibles para identificar y cuantificar los sitios PTM se centran en modificaciones únicas, en lugar de la interacción de múltiples modificaciones. El flujo de trabajo descrito correlaciona "puntos calientes" y residuos de lisina específicos que son modificados por varios MPT diferentes.

Existe una creciente necesidad en la comunidad científica de métodos factibles para estudiar múltiples PTM simultáneamente¹². La mayoría de los métodos para identificar y cuantificar globalmente los sitios de múltiples tipos de PTMs son desafiantes debido a los altos costos y la cantidad de tejido requerido^12,13. No solo los experimentos de enriquecimiento multi-PTM consumen mucho tiempo en términos de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis de datos, sino que estos estudios suelen requerir cantidades grandes y a menudo prohibitivas de proteína^11. Aquí se describe un protocolo para el enriquecimiento y análisis simultáneos de múltiples PTM, que también aborda varias de estas barreras y permite la elaboración de perfiles PTM a gran escala y la evaluación de la conversación cruzada entre varios PM^14. Este flujo de trabajo de una olla describe una manera práctica para que los investigadores biomédicos perfilen globalmente múltiples PTM, identifiquen péptidos modificados co-modificados y estudien la conversación cruzada PTM de una manera eficiente y rentable^14,15.

Aquí, este método se muestra examinando la acilación de proteína mitocondrial, que se estudió por primera vez hace más de 50 años¹⁶. Se concentra específicamente en la acetilación de lisina¹⁷ y la succinilación^18,incluyendo la co-ocurrencia de estas modificaciones en proteínas e incluso la co-modificación a nivel de péptido. Dado que el estudio utiliza un modelo de ratón noqueado sirtuin 5 (SIRT5), fue elegido para centrarse en el enriquecimiento de sitios de acetilación y succinilación. Esta decisión se tomó porque los sitios de socorro son objetivos de SIRT5 desuccinylase y, por lo tanto, se espera que muestren una regulación ascendente significativa en ratones KO, convirtiéndolos en los MCM más relevantes en este caso. Ambos MPT son biológicamente relevantes, como se resume recientemente en Carrico et al.¹⁹. En general, la acetilación muestra efectos importantes sobre la expresión génica y el metabolismo, y la socorro se ha divulgado para regular el metabolismo del corazón y la función²⁰.

El protocolo descrito se puede realizar con una cantidad baja de material de entrada de proteínas (por ejemplo, 1 mg de lisato de proteína) y reduce la duración total del experimento al reducir el tiempo dedicado al procesamiento de muestras, la adquisición de EM y el análisis de datos. En la Figura 1se proporciona un esquema de flujo de trabajo. También hemos utilizado cantidades aún más bajas de material de partida (hasta 100 g de lisato proteico, reduciendo las cantidades de perlas utilizadas en consecuencia), lo que, como era de esperar, reduce el rendimiento global de los péptidos acillados identificados; sin embargo, todavía proporciona resultados muy valiosos y péptidos acilados cuantificables.

Mientras que los llamados flujos de trabajo de arriba hacia abajo o de media reducción normalmente no utilizan enfoques de digestión proteolítica (y, por lo tanto, mantienen la conectividad de varios PTM dentro de una proteína), este protocolo se centra en un enfoque de enriquecimiento de afinidad basado en péptidos para obtener profundidad y sensibilidad adicionales para la identificación y cuantificación de PTM(Figura 1). Además, este flujo de trabajo centrado en péptidos utiliza métodos modernos de espectrometría de masas, incluyendo 1) una combinación de adquisición dependiente de datos (DDA) para generar bibliotecas espectrales y 2) adquisición independiente de datos (DIA) para una cuantificación PTM precisa en un flujo de trabajo sin etiquetas.

Los flujos de trabajo DIA superan la estocasticidad de muestreo de los esquemas de exploración DDA típicos fragmentando exhaustivamente todas las señales de péptidos dentro del rango m/z muestreado²¹. Esta característica también es extremadamente beneficiosa en términos de localización del sitio, ya que es más fácil obtener información sobre qué iones de fragmentos específicos se modifican dentro del péptido. Además, los flujos de trabajo DIA permiten la identificación y cuantificación de isoformas menores de péptido PTM con iones precursores idénticos. Los métodos DIA también pueden determinar una localización específica del sitio PTM dentro de un péptido basado en iones de fragmentos correspondientes específicos que se miden exhaustivamente en todo momento. Sin embargo, los enfoques DDA a menudo utilizan características de "exclusión dinámica" que excluyen el muestreo múltiple de MS/MS para el mismo ion precursor, por lo que faltan isoformas menores de PTM.

La estrategia de enriquecimiento simultáneo que se describe aquí es ideal para estudios que se beneficiarán de la elaboración de perfiles y cuantificación global de múltiples PTM, examinando la conversación cruzada de PTM y entendiendo las interacciones dinámicas de las modificaciones post-traduccionales. La identificación de múltiples PTM enriquecidos en un flujo de trabajo combinado ha sido descrita por: enriquecimiento global, en serie o paralelo de PTM que contiene péptidos proteolíticos, o alternativamente por el análisis de proteínas intactas. En comparación directa con el enriquecimiento en serie de la acetilación y la succinilación, la eficiencia de la metodología de un solo pozo se estableció como muy similar¹⁴. Estos protocolos alternativos requieren cantidades significativas de material y tiempo de partida y pueden ser prohibitivamente caros. Por el contrario, el protocolo de un solo depósito proporciona un método económico y eficiente para el enriquecimiento de más de una PTM con análisis e identificación posteriores.

Los tejidos hepáticos de ratón se obtienen de ratones noqueadores SIRT5 y se utilizan aquí como material de partida. Este protocolo también se puede realizar para los leligadores proteicos de diferentes tejidos o experimentos de cultivo celular. Este protocolo se puede aplicar a los lelitos proteicos obtenidos de tejidos o pellets de cultivo celular.

Protocol

Todos los experimentos descritos en el protocolo siguen las directrices del Comité Institucional de Investigación Animal del Instituto Buck.

1. Extracción de proteína del tejido homogeneizado y digestión con proteasa

1. Recién preparar el tampón de lisis a una concentración final de urea de 8 M, bicarbonato de trietilammonio de 50 mM (TEAB), 1 M de trihostatina A (TSA), 20 mM de nicotinamida, cloruro sódico de 75 mM (NaCl), 1 cóctel inhibidor de proteasa/fosfatasa (PIC) con agua de grado HPLC.
2. Agregue una perla de acero estéril a un tubo de 2 ml compatible con un homogeneizador de molino de cuentas y, a continuación, coloque la pieza de tejido (tamaño de un guisante) en el tubo. Agregue el tampón de lisis (500 l) y el vórtice brevemente para asegurarse de que el tampón cubra la pieza de tejido (agregue más tampón de lisis, si es necesario). Coloque los tubos en conjuntos de adaptadores preenfriados, asegurando que los tubos estén equilibrados entre los dos adaptadores del homogeneizador.
3. Homogeneizar las muestras 2veces a 25 Hz durante 3 min cada una a 4oC. Si el tejido no está completamente homogeneizado, gire los tubos brevemente y transfiera el lisado homogeneizado a un tubo de 1,5 ml recién etiquetado. A continuación, agregue un tampón de lisis adicional a la pieza de tejido restante y repita la homogeneización 2veces a 25 Hz durante 3 minutos cada uno. Dos rondas de homogeneización son típicamente suficientes para romper el tejido.
4. Retire la perla de metal con una pinza. Entre cada muestra, enjuague la pinza con agua de grado HPLC, metanol de grado HPLC y agua de grado HPLC de nuevo.
5. Combinar los lysates homogeneizados si se aplicaron dos rondas de homogeneización y sonicar muestras con un ultrasonicador para 10 ciclos a 30 s encendido/30 s apagado y 4 oC en alta potencia.
6. Centrifugar los lysates homogeneizados a 14.000 x g durante 10 min a 4oC para limpiar el lisado. Transfiera el sobrenadante (lisado despejado) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, evitando cualquier capa de grasa que pueda sentarse encima del sobrenadante y cualquier escombro en la parte inferior del tubo.
7. Realizar un ensayo de ácido bicincino (BCA) para medir la concentración proteica del iscaso transparente con una dilución adecuada (por ejemplo, 1:20 y/o 1:200). Según los resultados de BCA, alícuota 1 mg de proteína de cada muestra.
8. Reducir las proteínas en ditiothreitol de 4,5 mM (TDT) a 37 oC durante 30 min con agitación a 1.400 rpm. Posteriormente, proteínas alquilados en yodoacetamida de 10 mM (IAA) con incubación en la oscuridad (lugar en cajón o armario) a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
   NOTA: Se pueden utilizar reactivos alternativos, como N-etilmaleide (NEM) en lugar de IAA.
9. Añadir 50 mM TEAB a las muestras para diluir la concentración de urea por debajo de 2 M. Punto 1 l de la muestra en un papel de pH para asegurarse de que el pH de la muestra diluida esté entre 7,0-8,5. Añadir trippsina a cada muestra en una proporción de 1:50 (trippsina a proteína, wt/wt) y digerir la proteína con agitación a 37 oC durante la noche (alrededor de 14-16 h).
10. Atemple los digeridos con un 10% de ácido fórmico para alcanzar el 1% de ácido fórmico al día siguiente. Vórtice y gire brevemente. Detecte 1 l de la muestra en tiras de pH para asegurarse de que el digerido es de pH a 2-3. Muestras de centrífuga a 1.800 x g durante 15 minutos a RT para pellet cualquier material insoluble.

2. Desalación de péptidos proteolíticos no enriquecidos mediante extracción en fase sólida a gran escala

1. Obtener cartuchos que contengan resina C18 que pueda unir hasta 10 mg de proteína. Coloque estos cartuchos en un aparato de vacío para utilizar una aspiración al vacío que pueda tirar del líquido a través del cartucho durante cada uno de los siguientes pasos. Designe un cartucho para cada muestra de péptido.
2. Añadir 800 ml de acetonitrilo 80% (ACN) en 0,2% de ácido fórmico a los cartuchos con 19,8% de agua y utilizar la succión al vacío para tirar del líquido a través. Repita este paso 1x, evitando el secado de los cartuchos por completo.
3. Equilibrar los cartuchos añadiendo 800 ml de ácido fórmico al 0,2% en agua con succión al vacío para tirar de todo el volumen a través del filtro. Repita este 2x. Cargue los péptidos en los cartuchos con succión al vacío. Lavar los péptidos 2x con 800 ml de ácido fórmico al 0,2% en agua bajo succión al vacío.
4. Coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 ml debajo de cada cartucho para recoger el péptido eludo en el paso final. Bajo eluto de succión al vacío los péptidos de los cartuchos, primero con 800 s de 80% De ACN en 0.2% ácido fórmico y 19.8% de agua, luego con 400 l de la misma solución. Seque completamente las muestras de péptidos desalados en un concentrador de vacío (2-3 h).

3. Enriquecimiento simultáneo de péptidos K-acetilados y K-succinilados con cuentas de inmunoafinidad

1. Resuspender los péptidos secos en 1,4 ml de tampón frío de purificación de inmunoafinidad (IAP). Vórtice para mezclar y asegurar un pH de 7. Muestras de centrífuga a 10.000 x g durante 10 min a 4oC. Puede aparecer un pequeño pellet.
2. Deje los péptidos en hielo mientras prepara anticuerpos. A un tubo de K-acetil y tubo de perla de anticuerpo K-succinyl (volumen: 100 l de lodo por tubo), añadir 1 ml de solución salina con fosfato frío 1x (PBS) y mezclar mediante pipeteo. Transfiera toda la solución a un nuevo tubo de 1,5 ml y gire en una centrífuga en miniatura durante 30 s a RT.
3. Aspirar el PBS, teniendo cuidado de evitar aspirar cualquier cuenta. Repita el lavado 3x lavándolo de nuevo con 1 ml de PBS frío 1x, centrifugando durante 30 s en RT y aspirando fuera del PBS.
4. Vuelva a suspender las perlas en aproximadamente 440 s de PBS. Para el enriquecimiento de una olla (alrededor de 62,5 g de cada anticuerpo inmovilizado para perlas de anticuerpos K-acetil y K-succinyl) se utiliza una cuarta parte del número de perlas en cada tubo PTM (100 ml, proporcionado por el fabricante). Pipetear las cuentas varias veces para mezclar bien. Retire 100 sL de perlas de anticuerpos de acetil-lisina y transfiera en un tubo con puntas precortadas de 200 l, asegurando que la mezcla maestra permanezca constantemente bien mezclada.
5. Haga lo mismo con las perlas de anticuerpos succinilo-lisina eliminando 100 éL de cuentas de anticuerpos succinilo-lisina al tubo para alcanzar partes iguales del anticuerpo acetil-lisina y el anticuerpo saccinilo-lisina en cada tubo. Gire hacia abajo durante 30 s en una centrífuga en miniatura y aspirar los medios con la punta del cargador de gel (las cuentas se volverán blancas).
   NOTA: Cada tubo debe tener un pellet de perla similar en la parte inferior.
6. Pipetear el péptido resuspendido directamente sobre las cuentas lavadas. Tenga cuidado de evitar cualquier pellets (añadir rápidamente para evitar secar las cuentas). Incubar los péptidos con perlas a 4oC durante la noche con agitación.

4. Elución de los péptidos unidos a perlas de anticuerpos

1. Gire las muestras de péptidos a 2.000 x g durante 30 s a 4 oC. Retire el sobrenadante que contiene péptidos no unidos y ahorre para futuros experimentos si lo desea. Añadir 1 mL de búfer IAP frío 1x a las perlas para lavar y mezclar invirtiendo 5x. Girar a 2.000 x g durante 30 s a 4oC. Aspirar la solución IAP y repetir el paso de lavado IAP 1x para un total de dos lavados.
2. Añadir 1 ml de agua HPLC fría a las perlas y mezclar invirtiendo 5x. Girar a 2.000 x g durante 30 s a 4oC. Aspirar al agua. Repita el paso de lavado de agua dos veces para un total de tres lavados. Gire un tiempo adicional a 2.000 x g durante 30 s a 4 oC para recoger el agua restante en la parte inferior del tubo. Aspirar cualquier agua extra que pueda haberse acumulado con puntas de carga de gel de punta plana. Tenga cuidado de evitar aspirar las cuentas.
3. Añadir 55 s de ácido trifluoroacético al 0,15% en agua a las cuentas. Incubar las perlas durante 10 minutos a RT mientras que ocasionalmente tocando la parte inferior del tubo para mezclar. Gire las cuentas en RT durante 30 s en una centrífuga en miniatura. Retire los péptidos eludados y reserve con una punta de carga de gel de punta plana.
4. Añadir 45 s l de ácido trifluoroacético al 0,15% de ácido trifluoroacético en agua a las cuentas. Incubar durante 10 minutos a RT mientras toca la parte inferior del tubo de vez en cuando para mezclar. Gire las cuentas en RT durante 30 s en una centrífuga en miniatura. Retire la segunda elución con una punta de carga de gel de punta plana y combínela con la primera elución.
5. Gire los péptidos combinados eluted a 12.000 x g durante 5 minutos en RT para peletizar cualquier cuenta que lleve. Transfiera la solución de muestra de péptidos a un nuevo tubo de 500 ml.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

5. Desalación de péptidos enriquecidos

NOTA: El pH de las muestras debe ser inferior a 4 para una unión óptima a la punta que contiene resina C18. Utilice una punta de pipeta de 10 ml que contenga 0,6 l de resina C18 y una pipeta de 10 ml para controlar la punta.

1. Humedezca previamente la punta C18 pipeteando 10 ml de acetonitrilo en la punta. Dispensar acetonitrilo en residuos. Repita este paso dos veces más.
2. Equilibrar la punta lavando 3x con 10 éL de ácido fórmico al 0,2% en agua. Dispensar la solución en residuos después de cada equilibrio.
3. Cargue los péptidos de la muestra en la punta pipeteando y dispensando continuamente la muestra de péptido enriquecido con la punta. Pipetear hacia arriba y hacia abajo repetidamente al menos 20 veces y dispensar la solución restante de la punta.
4. Lave la punta que contiene péptido unido con 10 ml de ácido fórmico al 0,2% en agua. Dispensar la solución en residuos. Repita este paso 9x.
5. Eluir los péptidos en un tubo nuevo utilizando 10 l de un tampón de elución que contiene 0,2% de ácido fórmico, 50% de acetonitrilo y 49,8% de agua. Pipetear y dispensar repetidamente los 10 ml de solución dentro del nuevo tubo 15x. Repita este paso con un búfer de elución adicional de 10 ml, pipeteando repetidamente en el mismo tubo que la elución anterior.
6. Péptidos secos completamente en el concentrador de vacío (aproximadamente 20 min). Resuspender los péptidos secos en un volumen apropiado de 0,2% de ácido fórmico en agua.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

6. Adquisición de datos mediante DDA y DIA

NOTA: Analice las muestras con los métodos DDA y DIA LC-MS/MS, que se pueden ajustar en función del instrumento espectrométrico de masa disponible. Aquí, las muestras fueron analizadas usando un sistema HPLC 2D nano-LC acoplado a un espectrómetro de masas de alta resolución.

1. Utilice un sistema HPLC combinado con un sistema HPLC de plataforma basado en chip conectado directamente a un espectrómetro de masas (también se pueden utilizar muchas configuraciones y sistemas LC-MS).
2. Análisis de muestras utilizando HPLC-ESI-MS/MS de fase inversa
   1. Después de la inyección, transfiera las mezclas de péptidos a un chip de precolumna C18 y desallos los péptidos lavando con la fase móvil A a 2 l/min durante 10 min. A continuación, transfiera los péptidos a una columna analítica y eluda a un caudal de 300 nL/min con un gradiente de 2-3 h utilizando las fases móviles A y B. Específicamente, utilice un gradiente lineal de 5% de fase móvil B a 35% fase móvil B durante 80 minutos.
   2. Posteriormente, rampa de la fase móvil B a 80% sobre 5 min, a continuación, mantener en 80% B durante 8 min antes de volver a 5% B para un 25 min de re-equilibración.
3. Construir un método de instrumento MS para DDA y definir los siguientes experimentos de escaneo de instrumentos
   1. Experimento 1: Escaneo de iones precursores MS1 de m/z 400-1,500 (tiempo de acumulación de 250 ms). Establezca el umbral de intensidad para activar los escaneos MS/MS para los recuentos de iones de estados de carga de 2-5 a 200. Establezca la exclusión dinámica de iones precursores en 60 s.
   2. Experimento 2: Escaneo de iones de producto MS/MS con un rango de escaneo MS2 de m/z 100-1,500 (tiempo de acumulación de 100 ms por cada escaneo de iones de 30 productos por ciclo). Establezca la dispersión de energía de colisión en CES 5 y, a continuación, seleccione el"modode escaneo de iones de producto de alta sensibilidad".
      NOTA: El método DDA adquirirá espectros de MS/MS para los 30 iones precursores más abundantes después de cada exploración MS1 de encuesta por ciclo, y el tiempo total del ciclo será de 3,3 s. Las adquisiciones de DDA se utilizarán para construir bibliotecas espectrales como se describe en la sección 7.
4. Construir un método de instrumento MS para DIA y definir los siguientes experimentos de escaneo de instrumentos.
   1. Experimento 1: realizar el escaneo de iones precursores MS1 de m/z 400-1,250 (tiempo de acumulación de 250 ms).
   2. Experimento 2: realice escaneos de iones de productos MS/MS para 64 segmentos SWATH variables con un rango de escaneo MS2 de m/z 100-1,500 (tiempo de acumulación de 45 ms por cada escaneo de iones de 64 productos por ciclo). Establezca la dispersión de energía de colisión en CES 10 y, a continuación, seleccione el"modode escaneo de iones de producto de alta sensibilidad".
   3. Utilice la estrategia de adquisición de 64 ventanas variables DIA/SWATH tal como se describe en Schilling et al.²² para obtener una cuantificación sin etiquetas con un tiempo de ciclo total de 3,2 s. En resumen, en esta adquisición, en lugar de que el cuadrúpolo Q1 transmita un rango de masa estrecho a través de la celda de colisión, se pasa una ventana más ancha de ancho de ventana variable (5 -90 m/z) en pasos incrementales sobre todo el rango de masa (m/z 400 -1,250 con 64 segmentos SWATH, cada uno con un tiempo de acumulación de 45 ms, produciendo un tiempo de ciclo de 3.2 s, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un escaneo MS1, que incluye un con un tiempo de acumulación de 250 ms).
      NOTA: El ancho de la ventana variable se ajusta de acuerdo con la complejidad de la corriente de iones MS1 típica observada dentro de un cierto rango m/z utilizando un algoritmo de calculadora de ventana variable²² (se eligen ventanas más estrechas en rangos m/z "ocupados", ventanas anchas en rangos m/z con pocos iones precursores de elución). En otras plataformas de instrumentos MS, se pueden implementar otras estrategias de ventana según el DIA.

7. Análisis de datos

NOTA: Algunos ajustes de análisis de datos deben cambiarse y adaptarse al experimento específico. Por ejemplo, la base de datos de proteínas (archivo FASTA) seleccionada depende de las especies a partir de las cuales se preparó la muestra (aquí, Mus musculus). A continuación, se describe el análisis de datos para muestras de ratón enriquecidas para péptidos acetilados y succinilados.

1. Utilice un motor de búsqueda de base de datos MS para analizar las adquisiciones de DDA. Cree un método de motor de búsqueda de base de datos de la siguiente manera:
   1. Para parámetros de descripción de muestra: seleccione"Identificación"en Tipo de muestra, seleccione"Acido iodoacético"en "Alquilación de cisteína", seleccione"Trippsin"en "Digestión" (suponiendo que c-terminal cleaveen en lisina y arginina), seleccione "TripleTOF 6600" en Instrumento, en Factores especiales, verifique El énfasis de la acetilación y la sucinylación,y seleccione Musculus.
   2. Para los parámetros de procesamiento específicos: seleccione"Modificaciones biológicas"en Enfoque de IDENTIFICACión, seleccione"SwissProt" en Base de datos, seleccione "Id. completo" en Esfuerzo de búsqueda, seleccione "0.05 (10%)" en "Umbral de proteína detectada", y seleccione"Ejecutar análisisde tasa de detección falsa" en "Calidad de resultados". Guarde el método del motor de búsqueda y envíe los archivos sin procesar espectrométricos de masas para que los procese el motor de búsqueda de base de datos utilizando el método generado.
      NOTA: En un proceso iterativo, todos los escaneos de MS y MS/MS son recalibrados automáticamente por el motor de búsqueda en función de las anotaciones y resultados iniciales.
2. Haga clic en"Exportar resumen de péptidos"al finalizar la búsqueda y filtrar todos los resultados de identificación de péptidos por un "umbral de confianza" de 99 en un software de hoja de cálculo (por ejemplo, Excel; tasa de falso descubrimiento [FDR] de 1%).
3. En el archivo de hoja de cálculo "Resumen de péptidos", filtre todos los péptidos que contienen la anotación PTM "acetillación" y "succinylation" en la columna de modificación para generar un informe de resultados para presentar exclusivamente los péptidos acilados y sus proteínas correspondientes.
4. Para crear bibliotecas espectrales de MS/MS para seguir procesando el archivo en bruto DIA y la cuantificación relativa adicional, abra el software de análisis cuantitativo DIA. Seleccione la pestaña"Biblioteca",luego (en la parte inferior de la página) haga clic en"Generar biblioteca espectral"desde " Motor debúsquedade base de datos " y abra un informe FDR del motor de búsqueda de base de datos (el archivo *FDR.xlsx), que se generó automáticamente como parte del proceso de búsqueda de la base de datos de archivos sin formato DDA. A continuación, haga clic en "next" y seleccione el "LibrarySettings Schema" y "next". Seleccione "Uniprot_mouse_proteome" como base de datos y, a continuación, haga clic en "next" y "goa_mouse" como el archivo de anotación genética (ontología). Finalmente, haga clic en "terminar", y se generará la biblioteca espectral.
   NOTA: La información sobre los péptidos acetilados y succinilados de los archivos de datos sin procesar del DDA, los escaneos de iones precursores de MS1 y los escaneos de iones de fragmentos de MS2 se incluirá en las bibliotecas espectrales (esto incluye el tiempo de retención, el patrón de fragmentación de MS/MS, etc.).
5. Utilice el software de análisis proteómico cuantitativo DIA para realizar la cuantificación relativa de los niveles de acetilación y succinilación y crear hojas de cálculo de péptidos candidatos que contienen PTM que se pueden utilizar para el análisis de datos posterior.
   1. Para analizar y cuantificar los péptidos que contienen PTM, abra el software de análisis cuantitativo DIA, utilice el esquema de análisis de plantilla. El esquema de la plantilla está disponible en el software seleccionando la opción " Perspectiva deconfiguración" "Análisis DIA" "BGS PTF" (ya sea significativo o disperso, dependiendo del experimento).
      NOTA: En lugar de utilizar la plantilla de análisis BGS PTM en el software de análisis cuantitativo DIA, todos los ajustes específicos de PTM también se pueden configurar manualmente siguiendo estas instrucciones: 1) en "identificación", seleccione "Localización PTM" (límite de probabilidad de 0,75); 2) en"cuantificación", seleccione "agrupación de péptidos menores" "secuencia modificada"; y 3) en"post-análisis",seleccione"agrupaciónde abundancia diferencial" "grupo menor" (configuración de cuantificación). Estos ajustes activarán la función de localización PTM para que los péptidos modificados aparezcan como entradas individuales y el análisis diferencial se realice a nivel de péptido.
   2. Para iniciar el Análisis de cuantificación, seleccione la pestaña"Pipeline"y, a continuación, haga clic en"Configurar un análisis DIA desde archivo",abra los archivos sin procesar de MS DIA de interés para la cuantificación relativa. Seleccione "Asignar biblioteca espectral" y seleccione la biblioteca que se construyó arriba, haga clic en "load" "siguiente". Seleccione el esquema de análisis "BGS PTMs" y haga clic en "next". Seleccione el archivo FASTA de la base de datos adecuada "Uniprot_mouse_proteome" "siguiente". Defina la configuración de la condición, que asigna las diferentes condiciones a los ejemplos, y haga clic en "next". Seleccione "goa_mouse" como el archivo de anotación genética (ontología) y haga clic en "siguiente". Revise el resumen del análisis (resumen de la configuración del experimento) y seleccione " directorio desalida" "acabado". Por último, haga clic en"Ejecutar canalización"para realizar el análisis cuantitativo sin etiquetas.
      NOTA: Los módulos estadísticos del software de análisis cuantitativo DIA realizan automáticamente análisis de FDR, generan mapas de calor y trazados volcánicos comparando las diferentes condiciones, generan listas de péptidos y proteínas identificados y cuantificados, y proporcionan Valores Q junto con cambios de pliegue relativos comparando diferentes condiciones.
6. Como alternativa, utilice software para la eliminación de interferencias de conjuntos de datos DIA para procesar datos y realizar análisis estadísticos después de exportar las áreas pico extraídas para sitios de acetilación y succinilación.

8. Visualización de datos de péptidos modificados y evaluación de la localización del sitio PTM

1. Para abrir un análisis cuantitativo DIA generado, seleccione la pestaña"Análisis"seguida de "cargar el experimento de software deanálisis cuantitativo"(desde un experimento guardado abriendo un *. SNE). Navegue hasta el *. SNE archivo de resultados y seleccione "abrir".
2. En el panel izquierdo, haga clic en la flecha a la izquierda del tercer archivo *.wiff de datos sin procesar desde la parte superior para expandir y visualizar los 64 segmentos SWATH. Haga clic en la flecha a la izquierda del segmento [428.7-437.3] para ampliar el segmento específico y mostrar los péptidos modificados identificados para este rango de masa. Haga clic en el triplicar péptido cargado KQYGEAFEK[Acetil]R.
   NOTA: De forma predeterminada, el panel superior derecho normalmente muestra el MS2 XIC, y el panel inferior muestra MS1 Isotope Envelope XIC
   1. En el panel superior, seleccione"Gráfica de localización PTM". En el panel inferior, seleccione"Gráfica de localización PTM".
   2. En la gráfica de localización de PTM, seleccione la secuencia de péptidos superiores "KQYGEAFEK[Acetyl]R", con una puntuación total de localización De PTM de 18,32. Haga clic en la flecha a la izquierda para expandir la vista y visualizar los iones de confirmación y refutación. Haga clic en la flecha junto a"Inicios de confirmación",a continuación, seleccione el ion "y3 [+42]" para resaltar ese ion en particular, que confirma que el sitio de acetilación se encuentra en K2 de la secuencia de péptidos.
   3. En la gráfica de localización de PTM seleccione la segunda secuencia de péptidos "K[Acetyl]QYGEAFEKR" con una puntuación de localización PTM total (muy baja) de 1. Haga clic en la flecha a la izquierda para expandir la vista y visualizar los iones de confirmación y refutación. Haga clic en la flecha junto a"Confirmar iones",luego en la flecha junto a la"Refuting Ions",luego seleccione algunos iones de fragmento para visualizar y evaluar el cromatograma de iones extraído y los espectros MS/MS (Figura 5).
      NOTA: La puntuación de localización PTM asignada y la inspección visual indican que el isómero PTM correcto es KQYGEAFEK[Acetil]R, mientras que no existe evidencia mínima o no para el otro isómero PTM posible K[Acetyl]QYGEAFEKR.

Results

La Figura 1 muestra un diagrama general del flujo de trabajo, incluyendo la cosecha del tejido de hígados de ratón, utilizando 1 mg de proteína para digerir el lisado proteico con trippsina, incubando péptidos con cuentas conjugadas por anticuerpos, adquiriendo las muestras en la EM, y finalmente realizando análisis DIA/SWATH de los datos utilizando varios paquetes de software proteómico cuantitativo (académicos y comerciales).

La Figura 2A muestra cómo la cronología del flujo de trabajo y las cantidades de muestra y proteína requeridas, en comparación con los métodos alternativos que se utilizan actualmente para estudios de enriquecimiento multi-PTM. El método de una olla se puede realizar a la mitad de tiempo y con la mitad del número de muestras que estos métodos alternativos. En comparación con los dos métodos de enriquecimiento de una sola PTM, el protocolo de una olla también requiere la mitad de la cantidad de proteína.

Este protocolo ha demostrado ser una alternativa viable y rentable. La Figura 2B muestra que el coeficiente medio de variación (CV) para las áreas de péptidos modificados fue menor en el método de un solo bote que en los enriquecimientos de pTM único y pTM en serie. La Figura 2C,D muestra que, al comparar los métodos de enriquecimiento PTM y PTM de un solo depósito, no se observaron diferencias notables entre las correlaciones de las cuantificaciones a nivel de sitio para las dos modificaciones. Esto también fue cierto para las correlaciones a nivel de péptido y a nivel de fragmento. La misma observación se mantuvo para las tres correlaciones al comparar los enriquecimientos de una olla y de pTM en serie. Todos los datos sin procesar de MS subyacentes y las hojas de resultados de Excel procesadas asociadas con un informe reciente de Basisty et al.¹⁴ están disponibles y se pueden descargar desde MassIVE (MSV00081906) y ProteomeXchange (PXD008640).

En general, si bien las estrategias de enriquecimiento de anticuerpos pueden mostrar ciertas limitaciones, como la posible oclusión de los epítopos o una especificidad limitada, los anticuerpos utilizados en este estudio son mezclas de clones generados de forma independiente y, por lo tanto, proporcionan gamas más amplias de Especificidades.

Los resultados experimentales documentan la posibilidad de detectar y evaluar la interferencia De PTM. La Figura 3 muestra los datos de un enriquecimiento exitoso e ilustra un ejemplo para un péptido que contiene múltiples y diferentes modificaciones de acilo que visualizan la conversación cruzada PTM. La Figura 3A muestra un péptido que se acetila en un residuo de lisina y se sucinta en el otro, y la Figura 3B muestra el mismo péptido sucinylated en ambas lisinas. Esto demuestra que el mismo residuo de lisina se puede modificar con ambos grupos de acilación, y existe la posibilidad de que se produzca una charla cruzada en ese sitio. La Figura 4 muestra el número de residuos de lisina que se identificaron como se describe en las secciones 7.1-7.3 para llevar ambas modificaciones, apuntando también hacia una posible conversación cruzada PTM.

Como demuestra la Figura 5, el procesamiento de conjuntos de datos DIA PTM con software proteómico cuantitativo nos permite identificar qué residuos específicos de lisina se modifican. Este es un concepto conocido como localización del sitio, que es un paso esencial para cualquier análisis para la determinación de posibles interferencias PTM. La Figura 5 muestra dos posibles isoformas junto con los iones de confirmación y refutación para cada uno que podrían visualizarse y evaluarse como se describe en las secciones 8.1-8.3 (específicamente los pasos 8.3.2 y 8.3.3). Basándonos en esta información, pudimos identificar con confianza cuál de las dos isoformas estaba presente en la muestra original. El espectro MS/MS de la isoforma confirmada KQYGEAFEKacR demuestra claramente que los iones y_{(y 2}-y₅) que contienen el residuo de lisina acetilada, que se desplazó en 42 m/z (la masa de incremento de un grupo acetil), confirmaron el residuo específico de lisina en el péptido que se modificó.

Figura 1: Flujo de trabajo típico para el enriquecimiento de PTM de un solo pozo. El tejido (aquí, los hígados) se cosechan de SIRT5 KO y ratones de tipo salvaje (WT), y las proteínas se lysed, trypsin-digested en péptidos, y desalados. Los péptidos se enriquecen entonces con inmunoafinidad con combinaciones de cuentas de sacciinilo y acetil-anticuerpo. Los flujos de trabajo paralelos de MS miden tanto 1) pequeñas alícuotas de cambios en la expresión de proteína salteada entera (para la normalización de proteínas) y 2) péptidos enriquecidos que contienen acilo para la identificación del sitio de acilación (DDA-MS) y la localización del sitio, seguidos de la cuantificación (DIA-MS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación del flujo de trabajo de una olla con métodos alternativos. (A) Comparación del tiempo, los costes y los materiales necesarios para el flujo de trabajo de una olla, el enriquecimiento de PTM en serie y dos enriquecimientos de PTM único. (B) Comparación de los CV entre el flujo de trabajo de una olla, el enriquecimiento de pTM de una sola acetil-lisina y el enriquecimiento único de PTM de sacicl-lisina. Análisis de correlación de Spearman comparando las áreas de pico de péptido de acilo obtenidas del flujo de trabajo de una olla, y los enriquecimientos de una sola PTM: gráficas correspondientes de los resultados del área pico log2 para (C) sitios de acetilación y (D) sitios de suculnilación. Las taludes de regresión y los factores de correlación se indican en los paneles individuales¹⁴. Se procesaron dos réplicas biológicas independientes para cada una de las condiciones. Esta cifra ha sido modificada de Basisty et al.¹⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Crosstalk entre las modificaciones de la acetilación y la succinilación de los residuos de lisina. Espectros MS/MS de péptidos trípticos de tiolasa mitocondrial 3-cetoacilo-CoA que muestran la misma secuencia de aminoácidos pero han sido modificados en dos residuos de lisina con diferentes PTMs. (A) MS/MS del péptido AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKacK y (B) MS/MS del péptido AANEAGYFNEEMAPIEVKsuccTKsuccK. Esta cifra ha sido modificada de Basisty et al.¹⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Superposición y conversación cruzada entre los residuos de lisina acetilados y sucintados, ejemplos específicos en complejos proteicos. (A) Diagrama de Venn que muestra superposición entre 2.235 sitios de acetilación y 2.173 sitios de succinilación. De ellos, 943 sitios fueron acetilados y sucinylados. Se analizó el hígado de un ratón noqueador SIRT5 (des-succinylase) y se identificaron muchos sitios de socorro. De hecho, eran más abundantes de lo que se observa normalmente en el hígado de ratón (los péptidos modificados se filtraron a un valor Q de <0.05). (B) Complejos de proteínas que muestran el porcentaje de sus subunidades que contienen sitios acetilados y sucinilados (la línea roja negrita representa la importancia determinada por la prueba exacta de Fisher). (C) Diagrama del complejo ATP sintasa: subunidades de proteínas en rojo representan las subunidades que contienen sitios acetilados y sucintados. Esta cifra ha sido modificada de Basisty et al.¹⁴. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El software de proteómica cuantitativa descifra la localización del sitio de péptidos de los PTM. Sobre la base de la fragmentación MS/MS del péptido, es posible proporcionar información sobre el residuo específico de lisina que el grupo de acetil está modificando. Esto muestra la capacidad del software para ofrecer información valiosa sobre la localización del sitio de los PtM. (A) Dos posibilidades de modificación de residuos de lisina y localización del sitio PTM: KQYGEAFEKacR (izquierda) y KacQYGEAFEKR (derecha). Se muestran iones de fragmento "Confirmación" y "refutación" para cada una de las posibles isoformas de localización del sitio del péptido. Sobre la base de esta información, se asignan las puntuaciones de confirmación y la refutación de puntuaciones, confirmando la presencia de isoforma KQYGEAFEKacR en la muestra. (B) Espectro MS/MS correspondiente a la isoforma confirmada KQYGEAFEKacR indicando que todos los iones, incluido el residuo de lisina acetilada (y₂ y superior), llevan una masa de incremento de +42 m/z, que corresponde a la modificación de la acetil. Los iones b observados no contienen la modificación. (C) Cromatografía iónica extraída (XIC) con abundantes áreas pico resultantes de_{y 2} e y₃ iones, que conforman el sitio de acetilación en la isoforma confirmada KQYGEAFEKacR. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo describe una técnica novedosa para el enriquecimiento simultáneo de Múltiples PTM para comprender más eficazmente la interferencia PTM. Los métodos alternativos para alcanzar este objetivo tienden a ser prohibitivamente lentos y costosos, y requieren grandes cantidades de proteína para tener éxito^11,13. Este protocolo presenta un flujo de trabajo de enriquecimiento multi-PTM que implica la incubación en cuentas conjugadas por anticuerpos para dos PTM a la vez para mejorar la eficiencia general del experimento. Este método también implica el uso de DDA para la generación de bibliotecas espectrales y adquisiciones de DIA MS para detectar y cuantificar los péptidos presentes con interferencia reducida de los iones de fragmentos^22,23. Los programas de software, como los motores de búsqueda de bases de datos MS, se utilizan para analizar y cuantificar datos de adquisiciones de DDA, mientras que Quantitative Proteomics Software²⁴ y el software de análisis cuantitativo dia^{específico 25} son necesarios para interpretar los espectros complejos producidos por las adquisiciones de DIA.

Hay varios pasos críticos dentro de este protocolo que deben seguirse cuidadosamente. Como el objetivo principal del protocolo es enriquecer para múltiples PTMs simultáneamente, el paso de enriquecimiento de anticuerpos-afinidad (sección 2) es crítico para el éxito del experimento. Al realizar lavados en las cuentas, es necesario asegurarse de que ninguna de las cuentas se aspira accidentalmente. También es necesario asegurarse de que la concentración de urea se ha diluido a 1 M antes de la digestión con tripsina (paso 1.8). Aunque se requiere urea de 8 M anteriormente en el protocolo de solubilización de proteínas, las concentraciones de urea por encima de 1 M inhibirán la actividad enzimática de la trippsina. Además, es importante comprobar constantemente el pH de la muestra en todo el protocolo. Esto es especialmente importante antes de la digestión. Si el pH de la muestra y la solución de trippsina no se neutralizan adecuadamente antes de la incubación, puede resultar en una digestión ineficiente en la que muchos sitios de escisión pueden perderse, lo que resulta en menos identificaciones de péptidos.

Algunas modificaciones en el protocolo pueden ser útiles al preparar muestras. Para un lisato proteico adquirido a partir de 1 mg de material de partida, una cuarta parte de las perlas de anticuerpos proporcionadas en cada tubo de exploración PTM se pueden utilizar como una alternativa rentable. Se puede utilizar una mayor cantidad de material de partida para obtener mejores resultados, siempre y cuando la cantidad de perlas de anticuerpos utilizadas se incremente proporcionalmente. Otra modificación que puede mejorar el flujo de trabajo es digerir muestras con otra proteasa además de la trippsina. Esta modificación resultaría en una mayor variabilidad en los péptidos aislados, proporcionando una mayor cobertura de los residuos de proteínas. Aunque no es necesario, se recomienda que la trippsina sea una de las enzimas utilizadas para el análisis de PTM debido a su alta especificidad de escisión^26.

Una limitación de este protocolo es que los PTM que se están estudiando necesitan tener químicos similares para ser enriquecidos simultáneamente¹⁴. Los procedimientos para las diferentes perlas conjugadas con anticuerpos deben ser similares, utilizando disolventes y soluciones similares, incluidas condiciones de elución similares, y preferiblemente del mismo proveedor. Por esta razón, el método descrito aquí utiliza consistentemente la acetilación y la succinilación como ejemplo, que utilizan perlas conjugadas con anticuerpos (Cell Signaling Technology, Inc). Aunque este método se puede aplicar teóricamente a cualquier número de PTM, se necesitarían estudios adicionales para evaluar la limitación exacta del protocolo a este respecto. Además, dado que se trata de un método de enriquecimiento basado en anticuerpos, el método sólo puede proporcionar una cuantificación relativa de los sitios PTM.

En comparación con los métodos de enriquecimiento multi-PTM existentes, este flujo de trabajo es una alternativa más factible y rentable. A partir de este experimento, se observó que la eficacia de este método se compara muy bien con métodos alternativos, como los enriquecimientos individuales o en serie. La Figura 2B muestra que la mediana del CV para las áreas de pico de péptidos modificados se redujo realmente en el método de un solo bote en comparación con los enriquecimientos de un solo PTM y los enriquecimientos de serie-PTM^13. Analizamos además los resultados experimentales que evalúan las cuantificaciones a nivel de sitio para la acetilación o la succinilación. Además, el análisis de correlación de Spearman(Figura 2C,D)demostró que el enriquecimiento de PTM de un solo depósito se realizaba de forma similar a los flujos de trabajo de enriquecimiento de PTM único. Esto también fue cierto para las correlaciones a nivel de péptidos y fragmentos. La misma observación se mantuvo para las tres correlaciones al comparar una olla con el enriquecimiento de PTM en serie.

Este protocolo permite a los investigadores obtener información biológica fascinante sobre la conversación cruzada PTM de una manera rápida y rentable. El componente DIA del flujo de trabajo permite a los investigadores comprender más acerca de los PTM, ya que proporciona información sobre la localización del sitio y supera desafíos como la baja ocupación del sitio de los PMM. Los iones precursores tienden a excluirse con DDA, lo que es particularmente importante al estudiar los PTF, ya que la ocupación del sitio es a menudo baja hasta el punto en que estos péptidos no se seleccionan para MS/MS pero todavía contienen información crucial. Se podrían realizar experimentos de seguimiento para evaluar el límite superior de cuántos MPT se pueden enriquecer simultáneamente utilizando este método. Una mejora futura de este flujo de trabajo puede incluir el desarrollo de plataformas de software más avanzadas para automatizar aún más el análisis de la localización del sitio y la ocupación del sitio PTM.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tampón de biocarbonato de trietilamonio (TEAB)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU	T7408
Acetonitrilo, Burdick y Jackson grado LC-MS	Burdick and Jackson, Muskegon, MI, EE. UU	36XL66
Sonicador Bioruptor	Diagenode, Denville, NJ, EE. UU	. B01020001
chip de precolumna C18 (200 µ m x 6 mm chip ChromXP C18-CL, 3 mmm, 120 A)	SCIEX, Framingham, MA, EE. UU	. 5015841
chip C18-CL (75 y micro; m x 15 cm ChromXP, 3 y micro; m, 300 Å)	SCIEX, Framingham, MA, EE. UU.	804-00001
Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	D9779-5G
Eppendorf Thermomixer Compact	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	T1317-1EA
Tubo Eppendorf (2.0 mL Safelock)	Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania	22363352
Ácido fórmico	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	F0507-500ML
Estándar de péptidos de normalización del tiempo de retención indexado (iRT)	Biognosys AG, Schlieren, Zúrich, Suiza	Ki-3002-2
Yodoacetamida (IAA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	I1149-25G
mapDIA		enlace web	para la eliminación de interferencias de conjuntos de datos DIA
Metanol, Burdick y Jackson Grado LC-MS	Burdick y Jackson, Muskegon, Michigan, Estados Unidos	BJLC230-4
Dispensador de agua ultrapura PURELAB flex 1	VWR International, Radnor, PA, EE. UU.	89204-088
mProphet en Skyline		incorporado en Skyline	Algoritmos estadísticos integrados para evaluaciones FDR
Cartuchos Oasis HLB SPE Waters	Corp., Milford, MA, EE. UU	Cartuchos de WAT094225	para desalinizar lisados de proteínas, hasta 50 mg de material
Solución salina tamponada con fosfato	Life Technologies	10010023
Pierce BCA Assay Thermo	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	23225
ProteinPilot 5.0 - 'Motor de búsqueda de bases de datos MS'SCIEX	, Framingham, MA, USA	descarga de software SCIEX	búsqueda de bases de datos
MS PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764	Señalización celular Tecnología	13764	perlas de anticuerpos para el enriquecimiento por afinidad
PTMScan Motivo de acetil-lisina [Ac-K] Kit #13416	Tecnología de señalización celular	13416	perlas de anticuerpos para el enriquecimiento de afinidad
Tripsina liofilizada de grado secuencial	Life Technologies	23225
Skyline - 'Software de proteómica cuantitativa'MacCoss	lab (académico)	software	de código abiertoSoftware de proteómica cuantitativa (académico)
Spectronaut - 'DIA Quantitative Analysis	Software'Biognosys AG, Schlieren, Zúrich, Suiza	Sw-3001	DIA Software de análisis cuantitativo / Localización de sitios PTM
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrador	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	SPD131DDA-115	Instrumento para concentrar el volumen líquido de muestras
TissueLyser II	Qiagen, Hilden, Alemania	85300	instrumento para la lisis eficiente de tejidos
Ácido trifluoroacético (TFA)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	T6508-1L
TripleTOF 6600: tiempo de vuelo cuadrupolar ortogonal (QqTOF)espectrómetro de masas	SCIEX, Framingham, MA, EE. UU	Por cotización	espectrómetro de masas de alta resolución
Ultra Plus sistema	de HPLC nano-LC 2DSCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, EE. UU	Modelo #845	sistema de separación cromatográfica
Urea	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	PI29700
Agua, Burdick y Jackson LC-MS	Burdick y Jackson, Muskegon, MI, EE. UU.	600-30-76
Puntas de pipeta ZipTip C18, P10	Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL	ZTC18S096	Puntas cargadas de resina C-18 para la desalinización de mezclas de péptidos