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Artículo de método

Inducción de raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformación mediada en trigo sarracenotataricum tataricum)

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DOI:

10.3791/60828

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11 de marzo de 2020

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1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science, Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University

En este artículo

Resumen

Describimos un método de inducir raíces peludas por Agrobacterium rhizogenes-transformación mediada en trigo sarraceno tartá ) (Fagopyrum tataricum). Esto se puede utilizar para investigar las funciones genéticas y la producción de metabolitos secundarios en el trigo sarraceno tártaro, ser adoptado para cualquier transformación genética, o utilizado para otras plantas medicinales después de la mejora.

Resumen

El trigo sarraceno taráfilo (TB)[Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] posee diversas actividades biológicas y farmacológicas porque contiene abundantes metabolitos secundarios como flavonoides, especialmente rutinarina. Agrobacterium rhizogenes se han utilizado gradualmente en todo el mundo para inducir raíces peludas en plantas medicinales para investigar las funciones genéticas y aumentar el rendimiento de metabolitos secundarios. En este estudio, hemos descrito un método detallado para generar a. rizogenes-raíces peludas mediadas en la tuberculosis. Los cotiledons y el eje hipocotiledónider a los 7-10 días fueron seleccionados como explantas e infectados con A. rizogenes llevando un vector binario, que indujo raíces peludas aventureras que aparecieron después de 1 semana. La transformación de la raíz peluda generada se identificó en función de la morfología, la selección de resistencia (kanamicina) y la expresión génica del reportero (proteína fluorescente verde). Posteriormente, las raíces peludas transformadas se autopropagaron según sea necesario. Mientras tanto, un factor de transcripción de mieloblastosis (MYB), FtMYB116,se transformó en el genoma de la tuberculosis utilizando las raíces pellizudas mediadas por A. rhizogenespara verificar el papel de FtMYB116 en la síntesis de flavonoides. Los resultados mostraron que la expresión de genes relacionados con el flavonoide y el rendimiento de los compuestos flavonoides (rutina y quercetina) fueron significativamente (p < 0.01) promovidos por FtMYB116,lo que indica que las raíces peludas mediadas por A. rhizogenespueden utilizarse como una herramienta alternativa eficaz para investigar las funciones génicas y la producción de metabolitos secundarios. El protocolo detallado paso a paso descrito en este estudio para generar raíces peludas puede ser adoptado para cualquier transformación genética u otras plantas medicinales después del ajuste.

Introducción

Tartary sarraceno (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) es un tipo de dicotiledón perteneciente al género Fagopyrum y la familia Polygonaceae1. Como un tipo de alimento homóloga de la medicina china, la tuberculosis ha estado recibiendo un interés considerable debido a su composición química distintiva y diversas bioactividades contra las enfermedades. La tuberculosis es principalmente rica en carbohidratos, proteínas, vitaminas y carotenoides, así como en polifenoles como ácidos fenólicos y flavonoides1. Varias actividades biológicas y farmacológicas de flavonoides, incluyendo antioxidante, antihipertensivo2, y antiinflamatorias, así como propiedades anticancerígenas y antidiabéticas, se han demostrado3.

Agrobacterium rhizogenes es una bacteria del suelo que contribuye al desarrollo de la enfermedad de las raíces peludas en varias plantas superiores, especialmente dicotiledos, infectando los sitios de la herida4,,5. Este proceso se inicia mediante la transferencia del ADN-T en el plásmido de inducción de raíces (Ri)5,6 y se acompaña comúnmente de la integración y expresión de un gen exógeno del plásmido Ri y los pasos subsiguientes de generación del fenotipo de raíz peluda7. A. rhizogenes-raíces vellosas transgénicas mediadas, como una poderosa herramienta en el campo de la biotecnología vegetal, han sido más ampliamente utilizados debido a su estable y alta productividad y fácil obtención en un corto período de tiempo. Por otra parte, raíces peludas inducidas por A. rizogenes se distinguen eficientemente por su desarrollo de raíz plagiotrópica y crecimiento altamente ramificado en un medio libre de hormonas8. Se pueden utilizar en varios campos de investigación, incluyendo la producción artificial de semillas, investigación de nódulos de raíz, y en el estudio de las interacciones con otros organismos como hongos micorrizas, nematodos, y patógenos de la raíz7,9. Además, los cultivos de transformación de raíces peludas se han utilizado ampliamente como un sistema experimental para investigar las vías bioquímicas y la señalización química y para producir metabolitos secundarios vegetales que se utilizan como productos farmacéuticos, cosméticos y aditivos alimentarios8,,10. Los valiosos metabolitos secundarios, incluyendo alcaloides indólicos, aconitas, alcaloides tropano, terpenoides y flavonoides, sintetizados en raíces peludas de tipo salvaje se han investigado durante varias décadas en numerosas especies, como el ginsenoside en Panax ginseng11,coumarine en Ammi majus12,y compuestos fenólicos en TB2,,13.

Raíces peludas se han producido utilizando A. rizogenes en 79 especies de plantas de 27 familias14. Por ejemplo, A. rhizogenes-transformación de raíz peluda mediada se ha divulgado en soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, y achicoria (Cichorium intybus L.) 20. Tb transformación de raíz peluda también se ha investigado2. Pocos protocolos detallados están disponibles con respecto al desarrollo de raíces peludas mediadas por A. rhizogenes ya sea que lleven un vector binario o no. Por ejemplo, Sandra et al.21 introdujeron un método para producir raíces peludas de papa transgénicas sostenidas en brotes de tipo salvaje. Las raíces peludas completamente desarrolladas podrían visualizarse 5-6 semanas después de la inyección de A. rizogenes llevando el gen del reportero de gus en los internodos del tallo de las plantas de papa. Otro estudio también había reportado un sistema radicular peludo transgénico inducido por A. rhizogenes albergando el gen reportero gusA en yute (Corchorus capsularis L.) 22.23 obtuvieron raíces peludas de tabaco transgénica utilizando A. rhizogenes transformados con la expresión vector pBI121 que transporta el gen del ácido1tetrahidrocannabinólico (THCA) para producir THCA.

Sin embargo, un proceso paso a paso para una generación efectiva de transformación de la raíz peluda, especialmente en la tuberculosis, ha sido relativamente menos demostrado. En este estudio, hemos descrito un protocolo detallado utilizando A. rhizogenes que llevan el gen reportero (GFP), un marcador selectivo (Kan), y un gen de interés (b4, un gen identificado de nuestro grupo pero inédito de la familia básica helix-loop-helix(bHLH)) para generar transformación genética de raíz peluda en TB. El experimento duró 5-6 semanas, desde la inoculación de semillas hasta la generación de raíces peludas, que involucraron la preparación de explantas, infección, cocultura, subcultura ción y posterior propagación. Además, A. rhizogenes que contiene un plásmido binario que transporta el transgén de tuberculosis del factor de transcripción de mieloblastosis 116 (FtMYB116) se utilizó para determinar si FtMYB116 puede promover la acumulación de flavonoides, particularmente la rutina, en la tuberculosis a nivel genético y metabólico a través de la transformación de la raíz peluda de TB. FtMYB116, que es un factor transcripcional inducido por la luz, regula la síntesis de rutina en diferentes condiciones de luz5. La calcocona sintasa (CHS), la flavanona-3-hidroxilasa (F3H), el flavonoide-3'-hidroxilasa (F3'H) y la flavonol sintasa (FLS)24 son enzimas clave implicadas en la vía metabólica de la biosíntesis de rutina. Por lo tanto, este estudio demuestra la sobreexpresión de FtMYB116 en raíces peludas de tuberculosis y la expresión de genes clave de enzimas, así como el contenido de rutina y otros flavonoides como la quercetina.

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Protocolo

La TB utilizada en este estudio fue nombrada como BT18, que se originó a partir de la raza de "JinQiao No.2" cultivada por el Centro de Investigación de Pequeño Grano Varios de la Academia Shanxi de Ciencias Agrícolas. Los pasos primarios de este protocolo se ilustran en el cuadro 1.

NOTA: Operar la manipulación relacionada con explantes rápidamente, y cuando sea posible, mantener los platos Petri cerrados para evitar marchitamientos y contaminación. A menos que se indique lo contrario, todas las incubaciones explantarse se llevaron a cabo bajo la condición de una luz de 14 horas y un fotoperiodo oscuro de 10 horas a 25 oC. A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones relacionadas con explantas o bacterias se realizaron en condiciones asépticas en una campana de flujo laminar. Todos los ingredientes de medios para A. rhizogenes y cultivos de plantas in vitro se proporcionan en la Tabla 1. Después de ajustar el pH, todos los medios fueron autoclavedos a 120 oC durante 20 min. Los medios solidificados se prepararon llenando 25 ml de medio en una placa Petri de 9 cm de diámetro y permitiéndole solidificarse.

ADVERTENCIA: Deposite todas las bacterias y plantas modificadas genéticamente en el contenedor de residuos apropiado. Operar todos los productos químicos peligrosos en un armario de humos y depositarlos en el contenedor de residuos peligrosos.

1. Preparación de explantes de tuberculosis

  1. Preparación de semillas de tuberculosis
    1. Seleccione semillas de tuberculosis regordetas y no dañadas(Figura 1A1) que se hayan conservado a una temperatura inferior a 20 oC durante no más de 2 años.
    2. Remoje las semillas en agua a 28 oC durante aproximadamente 20 minutos para que la capa de semillas pueda pelarse fácilmente(Figura 1A2). Si es necesario, utilice tijeras para cortar una ranura en las semillas para facilitar el peeling.
  2. Esterilización de semillas de tuberculosis
    1. Coloque entre 100 y 200 semillas peladas en un matraz cónico esterilizado de 100 ml.
    2. Desinfectar las semillas con 75% de etanol durante 30 s.
    3. Sustituya el etanol por un 5% de hipoclorito sódico y desinfecte durante 15 min.
      NOTA: La desinfección con bicloruro de mercurio a una concentración de 1 g/L durante 8 min puede utilizarse como esterilizador alternativo para reemplazar el hipoclorito de sodio en cualquier caso de esterilización inadecuada.
      ADVERTENCIA: El bicloruro de mercurio es peligroso y no es un material respetuoso con el medio ambiente. Operarlo en el armario de fumcoración y depositarlo en el contenedor de residuos peligrosos, si se utiliza bicloruro de mercurio en cualquier caso.
    4. Vierta el hipoclorito de sodio.
    5. Lave las semillas con agua desionizada estéril 5 veces.
    6. Seque las semillas con un papel bibuoso estéril.
  3. Preparación de plántulas de tuberculosis
    1. Preparar 50 ml de Murashige y Skoog (MS) medio basal (1962) complementado con 30 g/L de sacarosa y 7 g/L de agar en polvo (MSSA)(Tabla 1) en una botella de cultivo de tejido vegetal de 300 ml.
    2. Ajuste el pH a 5,8 antes de autoclave.
    3. Distribuya 10 semillas uniformemente por botella de medio MSSA.
    4. Germinar las semillas en una sala de cultivo a 25 oC a 1 oC bajo la condición de luz durante 7-10 días.
  4. Preparación de explantes estériles
    1. Seleccione plántulas robustas de TB(Figura 1C),cuando se desdoblen las 2 piezas de cotiledón.
    2. Cortar las plántulas de las raíces(Figura 1C puntasde flecha de color rojo),evitando el contacto con el medio.
    3. Colócalos en un plato estéril de Petri.
    4. Corta los hipococotílos en segmentos de 0,8-1 cm y corta los cotiledons en trozos de aproximadamente 0,5 cm.
    5. Precultivo de estos explantes en medio MSSA bajo la condición de luz durante 24 h.
    6. Transfiera a un matraz cónico esterilizado de 100 ml, que ahora está listo para la infección.

2. Preparación de A. rizogenes para la transformación

NOTA: La cepa A. rhizogenes ACCC10060 fue proporcionada amablemente por el Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales y conservada a 80oC. A. rhizogenes se transformó con el vector binario pK7GWIWG2D (II) que alberga un ADN-T que lleva el gen b4 que acompaña a un GFP como gen indicador y el gen de resistencia Kan como marcador seleccionable. El gen b4 es un miembro de la familia bHLH del factor de transcripción, que aún no se ha publicado. Para evaluar el potencial de las raíces peludas de tuberculosis, A. rhizogenes se transformó con el vector binario pK7WG2D que contiene el gen MYB116 para investigar su efecto en la producción de metabolitos secundarios como flavonoides a nivel de expresión génica y por análisis metabólicos. Activado A. rizogenes debe estar bien preparado al mismo tiempo con los explantes.

  1. Activación de A. rhizogenes
    1. Deshielo A. rizogenes sobre hielo
    2. Sumerja las bacterias y alinee uniformemente sobre el medio de manitol de levadura (YEB) suplementado con 15 g/L de agar en polvo, 50 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de espectinomicina (YEBARS, pH 7.0).
    3. Incubar las bacterias a 28oC durante 12–16 h.
    4. Escoge una colonia monoclonal y enmócelala en otro plato de Petri de la misma manera descrita anteriormente.
    5. Seleccione colonias monoclonales y clasifique en un matraz cónico esterilizado de 100 ml que contenga 20 ml de medio YEB complementado con 50 mg/L de rifampicina y 50 mg/L de espectinomicina (YEBRS, pH 7.0) a 28 oC y 200 rpm durante 16-18 h hasta que el valor de OD600 alcance 2.0.
    6. Incubar entre 2%y 4% del cultivo antes mencionado en otro matraz cónico de 100 ml que contenga 20 ml de medio YEBRS a 28 oC y 200 rpm para 4-5 h hasta que el valor de OD600 alcance aproximadamente 0,5(Figura 1D).

3. Infección y detección de explantes de tuberculosis

NOTA: El objetivo de este protocolo es obtener raíces peludas transformadas genéticamente. Las raíces de tipo silvestre se utilizaron como el control negativo para evaluar la expresión transgénica. En este protocolo, A. rhizogenes se transformó con vector binario pK7WG2D que llevaba el gen de FtMYB116 o pK7GWIWG2D (II) llevando el gen de b4 de antemano.

  1. Resuspensión de A. rhizogenes
    1. Transfiera el cultivo obtenido en el paso 2.1.6 a un tubo centrífugo esterilizado de 50 ml.
    2. Girar a 4.000 x g durante 10 min a 20oC.
    3. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano con un medio de EP complementado con 30 g/L de sacarosa y 300 oM de acetosyringona (AS) (MSSAS, pH 5.8) a OD600 0.2.
  2. Infección de explantes
    1. Infundir la suspensión bacteriana obtenida en el paso 3.1.3 en un matraz cónico que contenga los explantas preparadas en el paso 1.4.6 durante 10 min(Figura 1E).
    2. Saque los explantes y seque con un papel bibuloso estéril.

4. Cocultura de explantes con A. rhizogenes

  1. Coloque un papel de filtro estéril de 9 cm de diámetro en el medio MS, que se solidifica con polvo de agar de 7 g/L complementado con sacarosa de 30 g/L y AS de 100 m (medio MSSAAS, pH 5.2).
  2. Superponga los explantes en el papel del filtro a 25 oC durante 3 días en la oscuridad(Figura 1F).

5. Inducción y cultura selectiva

  1. Coloque aproximadamente 20 explantes infectados en el medio MSSA complementado con 500 mg/L de cefotaxime y 50 mg/l de kanamicina (Kan) (MSSACK, pH 5.8)(Figura 1G).
  2. Incubarlos verticalmente bajo la condición de luz a 25 oC a 1 oC. Las raíces peludas ocurren aproximadamente 1 semana después de la incubación(Figura 1H puntas de flecha de tablero negro indican la aparición de raíces peludas).
    NOTA: Reemplace el medio MSSACK cada 15 días si es necesario.

6. Sucultura de las raíces peludas de LA Tuberculosis

NOTA: Este procedimiento tiene como objetivo cosechar raíces peludas vigorosas. Observar regularmente el crecimiento de raíces peludas durante la propagación, y eliminar las contaminadas e inactivadas de manera oportuna. Si es necesario, repita los siguientes pasos para propagar más raíces peludas. Se tarda aproximadamente 10-14 días desde la subcultura hasta la cosecha.

  1. Seleccione las raíces peludas que muestran aspecto blanco y crecimiento rápido.
  2. Cortarlos en trozos de 2-3 cm.
  3. Conténlos claramente en un banco limpio.
  4. Sumercelos en un matraz cónico esterilizado de 100 ml que contiene 5 ml de medio MS complementado con 30 g/l de sacarosa y 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) a una velocidad giratoria de 80 rpm a 25 oC en la oscuridad hasta que se sobresevan hasta el fondo del matraz(Figura 1I).

7. Identificación de raíces peludas transformadas y conservación

NOTA: Las raíces peludas transformadas se pueden identificar en función de los aspectos de morfología y nivel genético. La identificación también se puede llevar a cabo de acuerdo con el genoma de la raíz peluda y la resistencia, que no están cubiertos en este protocolo. Este procedimiento se centra principalmente en el gen del reportero y la identificación del gen objetivo.

  1. Retire las raíces peludas leonadas y contaminadas y selecciónelas con aspecto blanco.
  2. Evalúe si hay fluorescencia verde bajo un transiluminador ultravioleta doble azul/ligero.
  3. Seleccione las raíces peludas que presentan una fuerte señal de fluorescencia en los tubos numerados o envuelta sin un papel de aluminio marcado después de secarlas con un papel absorbente.
  4. Liofilizarlos en nitrógeno líquido, seguido de almacenar toda la cosecha a 80 oC para una investigación posterior.
  5. Identificación genética
    1. Triturar 0,1 g de las raíces peludas en polvo fino en nitrógeno líquido.
    2. Preparar el ADN genómico de las líneas transgénicas independientes de la tuberculosis utilizando el método modificado del bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)25 de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de ADN genómico vegetal.
    3. Realizar reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando 100 ng de plantilla de ADN genómico y imprimaciones enumeradas en la Tabla 2.
    4. Realizar el ciclo de amplificación de la siguiente manera: predesnaturalización a 94oC durante 5 min, desnaturalización a 94oC durante 30s, recocido de imprimación a 55oC para 30s y extensión de imprimación a 72oC para 30 s. Después de 36 ciclos y un paso de extensión final a 72 oC durante 10 min, analizar los productos de amplificación en geles de agarosa al 1%.
    5. Mancha los geles con tinción de ácido nucleico y visualícelos bajo luz UV.

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Resultados

Agrobacterium rhizogenes-mediación de la transformación de la raíz peluda de la tuberculosis
Este estudio describe el protocolo paso a paso que se estableció para obtener raíces peludas transformadas genéticamente utilizando A. rhizogenes. Tomó aproximadamente 5-6 semanas desde la inoculación de semillas de tuberculosis hasta la cosecha de las raíces peludas identificadas, y algunos pasos clave se representan en la Figura 1 (A-H). Brevem...

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Discusión

La tuberculosis se ha utilizado en varios estudios relacionados con metabolitos secundarios a niveles genéticos y metabólicos1,2,5,27,28. El cultivo de raíces peludas, como fuente única para la producción de metabolitos, desempeña un papel fundamental en la ingeniería metabólica29 y se puede utilizar para alterar las vías metabólicas me...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por los Fondos Fundamentales de Investigación para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público ZXKT17002.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2 * Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
Polvo de agarSolarbio Life Science, Pekín, ChinaA8190
Termociclador 2720 de Applied BiosystemsThermoFisher Scientific, EE. UU.A37834
ASSolarbio Life Science, Pekín, ChinaA8110Diluido en DMSO, vectores binarios de 100
mM ThermoFisher Científico (invitrogen), US/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxima, sodioSolarbio Life Science, Pekín, ChinaC8240Diluido en agua, 200 mg/mL
Hitachide alta velocidadNo. 90560201
Placa de Petri desechable Fábrica deinstrumentos médicos de Guanghua, Yangzhou, China/
Aparato de electroforesis DYY-6CBjliuyi, Pekín ChinaECS002301
EASYspin Plus Kit de ARN VegetalAidlab, ChinaRN38
ELGA purelab untra bioscienceELGA LabWater, Reino Unido82665JK1819
Epoch Espectrofotómetro de microplacasbiotek, EE. UU.
/ Gateway Enzima de reacción BP / LRThermoFisher Scientific (invitrogen), EE. UU.11789100/11791110
Agitador multifunción HYG-CSuzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China/
KanSolarbio Life Science, Pekín, ChinaK8020Diluido en agua, 100 mg/mL
MLS-3750 Esterilizador de autoclaveSanyo, Japón/
MS sales con vitaminasSolarbio Life Science, Pekín, ChinaM8521
NaClSolarbio Life Ciencia, Pekín, ChinaS8210
Otros productos químicos no declaradosBeijing Chemical Works, Chinaetanol, bicloruro de mercurio, etc.
Medidor de pH PHS-3CShanghái INESA Scientific Instrument Co., Ltd, Chinaa008
Kit de ADN genómico de plantasTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampicinaSolarbio Ciencias de la Vida, Pekín, ChinaR8010Diluido en DMSO, 50 mg/mL
EspectinomicinaSolarbio Ciencias de la Vida, Pekín, ChinaS8040Diluido en agua, 100 mg/mL
SacarosaSolarbio Life Science, Pekín, ChinaS8270
Trans2K Marcador de ADNTransGen Biotech, Pekín, ChinaBM101-01
TriptonaSolarbio Ciencias de la Vida, Pekín, ChinaLP0042
Whatman diámetro 9 cm Papel de filtroHangzhou wohua Papel de filtro Co., Ltd/
Polvo de extracto de levaduraSolarbio Life Science, Pekín, ChinaLP0021
CF15RXII micro , Japón

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