Artículo de método

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

DOI:

10.3791/60829

⸱

27 de abril de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Targeted Drug Delivery and Personalized Medicine Technologies, Department of Chemical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology, 2The Norman Seiden Multidisciplinary Program for Nanoscience and Nanotechnology, Technion - Israel Institute of Technology, 3The Interdisciplinary Program for Biotechnology, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El enfoque de montaje ascendente para la construcción de células sintéticas es una herramienta eficaz para aislar e investigar procesos celulares en un entorno de imitación celular. Además, el desarrollo de sistemas de expresión sin células ha demostrado la capacidad de reconstituir los procesos de producción, transcripción y traducción de proteínas (ADN-ARN-proteína) de manera controlada, aprovechando la biología sintética. Aquí describimos un protocolo para preparar un sistema de expresión libre de células, incluyendo la producción de un potente lisado bacteriano y encapsular este liso dentro de vesículas unilamelares gigantes a base de lípidos ricos en colesterol (GUVs) (es decir, liposomas estables), para formar células sintéticas. El protocolo describe los métodos para preparar los componentes de las células sintéticas, incluida la producción de lisatos bacterianos activos, seguido de una preparación detallada paso a paso de las células sintéticas basada en un método de transferencia de emulsión de agua en aceite. Estos facilitan la producción de millones de células sintéticas de una manera sencilla y asequible con una alta versatilidad para producir diferentes tipos de proteínas. Las células sintéticas obtenidas se pueden utilizar para investigar la producción de proteínas/ARN y la actividad en un entorno aislado, en evolución dirigida, y también como una plataforma de administración controlada de fármacos para la producción bajo demanda de proteínas terapéuticas dentro del cuerpo.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células sintéticas son partículas similares a células artificiales, imitando una o varias funciones de una célula viva, como la capacidad de dividir, formar interacciones de membrana y sintetizar proteínas basadas en un código genético1,,2,3. Las células sintéticas que encierran sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) poseen una alta modularidad debido a su capacidad para producir varias proteínas y secuencias de ARN después de alteraciones en la plantilla de ADN. Presentando una alternativa atractiva a los enfoques actuales de la producción de proteínas, los sistemas CFPS se basan en lisato celular, componentes purificados o componentes sintéticos e incluyen toda la maquinaria de transcripción y traducción necesaria para la síntesis de proteínas como ribosomas, ARN polimerasa, aminoácidos y fuentes de energía (por ejemplo, 3-fosfoglicérido y trifosfato de adenina)4,5,6,7,8,9. La encapsulación de un sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite la producción simple y eficiente de proteínas sin depender de una célula viva10. Además, esta plataforma permite la síntesis de péptidos que pueden degradarse dentro de las células naturales, la producción de proteínas tóxicas para las células vivas, y modificar las proteínas con aminoácidos no naturales11,,12. Las células sintéticas se han utilizado como modelo para fines de investigación que investigan los componentes celulares mínimos necesarios para permitir la vida celular desde una perspectiva evolutiva1,,13. Las células sintéticas también se han utilizado para construir e implementar circuitos genéticos y como modelos para la evolución dirigida14,,15,,16. Otros estudios se han centrado en la capacidad de las células sintéticas para imitar la actividad biológica de las células naturales, con el objetivo de reemplazar las células naturales dañadas, como las células beta en pacientes con diabetes17. Además, la capacidad de estas células sintéticas encapsulantes CFPS para producir una variedad de proteínas terapéuticas ilustra su potencial para ser incorporadas en el uso clínico18.

Aquí describimos un protocolo de abajo hacia arriba a escala de laboratorio(Figura 1) para la producción de ARN y células sintéticas productoras de proteínas basadas en un sistema CFPS encapsulado en una vesícula lipídica. Esto muestra el uso potencial de plataformas celulares sintéticas como nuevos sistemas de administración de fármacos para la producción in situ de un fármaco de proteína terapéutica in vivo19. Estudios anteriores han investigado la optimización de la reacción CFPS y los procesos de preparación de lisato celular4,8,20. Además, se han aplicado varias técnicas para la preparación de liposomas del tamaño de una célula, como los métodos de estabilización de gotas microfluídicas y a base de polímeros21,22,23, que también difieren en la composición lipídica de los liposomas24,25,26. En el protocolo presentado, las células sintéticas se producen utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite y el proceso de encapsulación se lleva a cabo a bajas temperaturas (<4 oC)5,10,24,27,28. Se ha constatado que estas condiciones leves son favorables para conservar la integridad biofuncional de la maquinaria molecular, a saber, ribosomas y proteínas27,,29,,30. La composición lipídica de las partículas consiste en colesterol y 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (POPC). La primera se encuentra en todas las membranas celulares de los mamíferos y es esencial para la estabilidad, rigidez y reducción de la permeabilidad de la membrana, y la segunda imita la composición de fosfolípidos de mamíferos11,,13. La transcripción celular y la maquinaria molecular de traducción se extraen de la cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que se transforma con plásmido pAR1219 sobreexpresando la polimerasa de ARN T7 para aumentar la potencia de CFPS y la síntesis de proteínas. Este sistema se ha utilizado para producir proteínas diagnósticas y terapéuticas, con pesos moleculares de hasta 66 kDa in vitro e in vivo19,,31. El siguiente protocolo proporciona un método simple y eficaz para la producción del sistema celular sintético, que puede abordar una amplia gama de cuestiones fundamentales asociadas con la síntesis de proteínas en la naturaleza y también se puede utilizar para aplicaciones de administración de fármacos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: La ilustración del protocolo de producción de las células sintéticas completas se presenta en la Figura 1. Según las necesidades del usuario, la expresión proteica (sección 3.2) y la formación de células sintéticas (sección 4) partes del protocolo también se pueden llevar a cabo de forma independiente (con algunas adaptaciones).

1. Preparación del lisado S30-T7

  1. Placa de raya de la bacteria E. coli BL21(DE3) transformada con el ARN T7 polimerasa que expresa pAR1219 plásmido en una placa de agar LB complementado con 50 g/ml de ampicilina para obtener colonias individuales.
  2. Preparar una solución de arranque: Inocular una sola colonia en 5 ml de LB-media suplementado con 50 g/ml de ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 100 ml y crezca durante la noche utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm y 37 oC. Preparar duplicados.
  3. Inocular cada arrancador de 5 ml por separado en 500 ml de medios de tuberculosis suplementados con ampicilina de 50 g/ml en un matraz Erlenmeyer de 2 L con deflectores y cultivarlo utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm y 37 oC hasta que alcance la OD600 de 0,8-1. Supervise periódicamente utilizando un espectrofotómetro.
  4. Añadir 2-3 mL de 100 mM de stock de IPTG (para llegar a 0.4 - 0.6 mM) para la inducción de la expresión de la polimerasa de ARN T7 y continuar creciendo el cultivo hasta que alcance OD600.4.
  5. Transfiera la solución de cada matraz Erlenmeyer a dos tubos de centrífuga esterilizados de 250 ml.
  6. Centrifugar cada uno a 7.000 x g durante 10 min a 4oC. Descarta el sobrenadante.
    NOTA: En esta etapa, el pellet bacteriano se puede almacenar a -20 oC durante unos días antes de pasar a los siguientes pasos.
  7. Vuelva a suspender cada pellet en 250 ml de tampón de lisado s30 frío (4 oC) y centrífuga a 7.000 x g durante 10 min a 4 oC.
    NOTA: El tampón de lisato S30 se utiliza para mantener la estabilidad de las proteínas después de que la lisis celular se realiza utilizando el homogeneizador en el paso 1.9. A partir de este paso adelante, todos los pasos hasta la 1.12 deben llevarse a cabo de forma consecutiva y rápida.
    NOTA: Antes de continuar con el siguiente paso, enfríe previamente las puntas y los viales de 1,5 mililitros que serán necesarios para almacenar el lisado
  8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender todos los pellets juntos en 15 ml de tampón de lisado frío S30. Filtrar la suspensión con una almohadilla de gasa.
    NOTA: 15 ml de solución se debe al volumen mínimo homogeneizador. Debe tenerse en cuenta que la concentración de bacterias también es importante.
  9. Homogeneizar a una presión de trabajo de 15.000 psi, con una presión de aire de 4 bar (dos pasadas) para rotura celular. Evite la dilución de la solución para un lisado más concentrado y activo.
  10. Añadir 100 ml de TDT de 0,1 M (CAUTION) por 10 ml de la suspensión homogeneizada.
  11. Centrifugar la suspensión a 24.700 x g durante 30 min a 4oC.
  12. Realice el siguiente paso rápidamente para preservar la actividad de lisado: divida el sobrenadante uno por uno en alícuotas de 200 ml en viales preenfriados de 1,5 ml e inmediatamente congele con nitrógeno líquido. Conservar a -80oC para su uso posterior.
    ADVERTENCIA: La TDT se clasifica como Irritante y Harmful y, por lo tanto, debe tratarse con cuidado.

2. Preparación de lípidos en solución de aceite

  1. Disolver el POPC y el colesterol en cloroformo (CAUTION) por separado, cada uno a una concentración final de 100 mg/ml. Vórtice cada vial por separado.
    1. Combinar los componentes en un vial de vidrio de 2 ml: añadir 50 ml de POPC en cloroformo, 50 ml de colesterol en cloroformo y 500 ml de aceite mineral. Para 100 l de células sintéticas, se requieren 2 viales de lípidos en aceite.
    2. Vórtice, y luego calentar durante aproximadamente 1 h a 80 oC en una campana química para evaporar el cloroformo. Asegúrese de que se ha producido una evaporación completa siguiendo el tiempo/condiciones especificados y supervisando el volumen de la solución.
      NOTA: La solución resultante de lípidos en aceite se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de dos semanas. Para mejorar los resultados, se recomienda utilizar una preparación fresca antes de cada experimento. Las relaciones de lípidos y colesterol se pueden alterar de acuerdo con la composición de membrana deseada. Una alta concentración de colesterol puede conducir a la formación de agregados en la solución celular sintética final.
      ADVERTENCIA: El cloroformo se clasifica como irritante y dañino y, por lo tanto, debe tratarse con cuidado y en zonas con extracción de humos.

3. Preparaciones de soluciones externas, preinternas y de alimentación

  1. Preparación de soluciones de stock
    1. Prepare las soluciones de stock enumeradas en la Tabla 2 utilizando agua ultrapura (UPW).
      NOTA: Las soluciones de stock deben prepararse con antelación y almacenarse a -20 oC hasta su uso posterior. El reactivo 7 tiende a formar agregados. La calefacción a 37 oC reducirá la agregación. La agregación leve no afectará significativamente a la reacción. La solución del reactivo 8 es lechosa y turbia.
  2. Solución exterior
    1. Disolver la glucosa en DNase/RNase-free H2O a una concentración final de 200 mM.
    2. Para 100 ml de solución interna, prepare 1,6 ml de solución externa.
  3. Solución preinterna
    1. Añadir reactivos 1-14 según las cantidades y la concentración enumeradas en el Cuadro 2. Por ejemplo, para un volumen de celda sintética final de 100 ml, prepare 100 ml de solución interna.
      NOTA: UPW debe añadirse para completar el volumen final requerido. En esta etapa, la mezcla se puede almacenar a 4oC durante unas horas.
  4. Solución de alimentación
    1. Añada todos los reactivos de acuerdo con las cantidades y la concentración enumeradas en la Tabla 3.
      NOTA: Utilice la relación 1:1 de la solución de alimentación: solución interna. Para un volumen de células sintéticas final de 100 ml, prepare 100 ml de solución de alimentación. Se recomienda preparar un pequeño exceso de volumen de solución externa, interior y de alimentación.

4. Preparación de células sintéticas

NOTA: Los siguientes volúmenes se ajustan para la preparación de 100 l de células sintéticas.

  1. Células sintéticas que producen proteínas
    1. En un tubo de 15 ml, coloque 12 ml de la solución externa y agregue lentamente, encima una capa, de 500 ml de lípidos en solución de aceite. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
    2. Para finalizar la preparación interna de la solución: mezclar los ingredientes internos de la solución en hielo triturado a un volumen final de 100 l descongelando y añadiendo S30-T7 Lysate (reactivo 15) y plásmido de ADN (reactivo 16) a la mezcla almacenada.
    3. Al segundo vial de vidrio de 2 ml con 500 ml de lípidos en solución de aceite, añadir 100 ml de la solución interna. Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante 1 minuto y vórtice por otro minuto en el nivel cinco.
      1. Incubar durante 10 minutos sobre hielo triturado y añadir lentamente la emulsión resultante en la parte superior de la fase de aceite en el tubo de 15 ml (a partir de 4.1.1).
    4. Centrífuga durante 10 min a 100 x g y 4oC y luego centrífuga durante 10 min a 400 x g y 4oC. Al final de la centrifugación, se debe observar un pellet en la parte inferior del tubo.
      NOTA: El uso de un rotor de centrífuga de cubo oscilante se prefiere aquí para adquirir una mejor cobertura de una segunda capa de lípidos durante el paso de las gotas de agua en aceite a través de la interfase. En caso de que no haya pellet observable, la velocidad de centrifugación se puede aumentar a 1000 x g. De lo contrario, consulte la sección Discusión que hace referencia a la gravedad específica de la solución externa.
    5. Extraiga el pellet.
      1. Retire el exceso de capa de aceite.
      2. Utilice una punta de pipeta recortada cargada con aproximadamente 400 ml de solución externa para extraer el pellet. Liberar la solución externa mientras pasa a través de la fase de aceite con el fin de recoger sólo el pellet en la fase acuosa.
        1. Limpie la punta después de la extracción del pellet para evitar la transferencia de restos de aceite y transfiera el pellet a un tubo limpio de 1,5 ml.
    6. Centrífuga durante 10 min a 1.000 x g y 4oC, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 ml de solución de alimentación (1:1 relación de soluciones internas: de alimentación).
      NOTA: Aquí también se puede utilizar un rotor de centrífuga de ángulo fijo.
    7. Para la expresión proteica, incubar durante 2 horas a 37 oC sin agitar.
      NOTA: El tiempo óptimo de incubación varía entre diferentes proteínas.
    8. Evaluar la cantidad de proteína producida utilizando un método adecuado de acuerdo con las propiedades de la proteína objetivo.
  2. Grupos de control recomendados
    1. Solución interna y confirmación de actividad de lisado
      1. Preparar una solución interna completa (con ADN y lisato S30-T7).
      2. Incubar inmediatamente la reacción anterior utilizando una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm o un termomezclador a 1200 rpm, a una temperatura constante de 37oC durante 2 h.
        NOTA: Ajuste el tiempo de incubación para que coincida con el tiempo de incubación de las células sintéticas.
    2. Células sintéticas
      1. Grupo de control negativo: Preparar el protocolo presentado en 4.1 con solución interna sin ADN.
      2. Control positivo: Prepare el protocolo presentado en 4.1 con una solución interna que contenga una codificación de plásmido T7 para un gen reportero.
        NOTA: Agregue un grupo de control positivo compuesto por un gen de reportero, como sfGFP, junto con los grupos de prueba para garantizar el paso de eficiencia de encapsulación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo para la preparación de células sintéticas encapsulando un sistema S30-T7 CFPS basado en BL21 E. coli dentro de las vesículas lipídicas. En la Figura 2se presenta una descripción esquemática del proceso de preparación que incluye una imagen de cada etapa. El éxito del proceso de preparación de células sintéticas depende del rendimiento adecuado de cada etapa y se realiza mediante diferentes parámetros. El protocolo debe ajustarse para adaptarse a la producció...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo introduce un método simple y asequible para la producción de grandes cantidades de células sintéticas productoras de proteínas. El rendimiento de las células activas depende de una ejecución cuidadosa y precisa del protocolo con énfasis en varios pasos críticos. En la sección de preparación de lisados de este método, es esencial alcanzar la densidad bacteriana adecuada antes de la lisis celular para lograr una cantidad suficiente de proteínas en el lisato bacteriano. En segundo lugar, el proceso de lisis d...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por ERC-STG-2015-680242.

Los autores también reconocen el apoyo del Technion Integrated Cancer Center (TICC); el Russell Berrie Nanotechnology Institute; el Lorry I. Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering; el Ministerio de Economía de Israel para una beca Kamin (52752); el Ministerio de Tecnología Científica y Espacio de Israel – Oficina del Científico Jefe (3-11878); la Fundación para la Ciencia de Israel (1778/13, 1421/17); la Asociación israelí contra el cáncer (2015-0116); la Fundación Alemán-Israelí para la Investigación y el Desarrollo Científico para una beca GIF Young (I-2328-1139.10/2012); el Programa FP-7 del IRG de la Unión Europea para una Beca de Integración Profesional (908049); la Beca del Centro de Investigación de Fosfolípidos; una Fundación Rosenblatt para la investigación del cáncer, una beca de la Fundación de la Familia Mallat; y la Fundación unger de la familia. A. Schroeder reconoce las becas Alon y Taub. O. Adir reconoce las becas Sherman y Gutwirth. G. Chen reconoce la Comunidad Sherman. N. Krinsky reconoce el Programa de Doctorado de Mujeres Baronesa Ariane de Rothschild de la Fundación Rothschild Cesarea.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
A. Reactivos necesarios para el paso 1 (preparación del lisado S30-T7)
E.coli BL21 (DE3) NEBC2527E.coli BL21 (DE3).
pAR1219SigmaT2076Vector TargeTron para transformación.
Solución madre de 50 mg/mL de ampicilinaSigmaA9518almacenada a -20 °C.
10 g/L de bacto-triptonaBD Bioscience 211705Para la preparación de la placa de agar Luria Bertani (LB) (1,5%).
10 g/L Cloruro de sodio (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Extracto de Betato-LevaduraBD Bioscience 212750
15 g/L Agar agar purificadoMerck1.01614.5007
50 µ g/mL AmpicilinaSigmaA9518
10 g/L Bacto-triptonaBD Bioscience 211705Para la preparación de medios Luria Bertani (LB) (20 mL).
10 g/L Cloruro de sodio (NaCl)Bio-Lab19030591
5 g/L Extracto de Betato-LevaduraBD Bioscience 212750
50 y micro; g/mL AmpicilinaSigmaA9518
12 g/L Bacto-triptonaBD Bioscience 211705Para la preparación de caldo estupendo (TB) medio (1 L).
24 g/L de extracto de Betato-LevaduraBD Bioscience 212750
4% (v/v) Glicerol anhidroBio-Lab7120501
2,32 g/L K2HPO4Espectro químicoP1383
12,54 g/L KH2PO4Espectro químicoP1380
  50 y micro; g/mL de ampicilinaSigmaA9518
Solución madre de 100 mM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) INALCOINA-1758-1400Filtrado usando 0.2 y micro; m Filtro de jeringa de PVDF hidrófilo.
Solución madre de 0,1 M de ditiotreitol (DTT) TCID1071Filtrado usando 0.2 y micro; m Filtro de jeringa de PVDF hidrófilo.
10 mM Tris-acetato a pH = 7,4SigmaT1503Tampón de lisado S30 (1,5 L)
14 mM acetato de magnesioMerck1.05819.0250
60 mM acetato de potasioCarlo Erba470147
1 mM DTTTCID1071
0,5 mL/L 2-mercaptoetanolSigmaM6250
Equipo necesario para el paso 1
100 mL matraces Erlenmeyer esterilizadosThermo Scientific50-154-28462 matraces
Erlenmeyer esterilizados de 2 L con deflectoresKIMAX-KIMBLE256302 matraces
Incubadora de sueloMRCTOU-120-2Incubadora agitadora de laboratorio 450x450mm, 400rpm, 70 °
CentrífugaThermo Scientific75004270(75003340) - Rotor de ángulo fijo Fiberlite F10-6 x 100 LEX.
Debe permitir al menos 13,000 x g.        * Preenfriado a 4 °C.
Homogeneizador de alta presiónAVESTINEmulsiFlex-C3Preenfriado a 4 °C.
-80oC congeladorSO-LOWU85-18
Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mLEppendorf30120086 Preferiblemente preenfriado a -20 °C.
EspectrofotómetroTECANIN-MNANOInfinite M200 pro
Placa transparente de 96 pocillosThermo Scientific167008
Cilindro graduadoesterilizado Corning
Tubos de centrífuga esterilizadosEppendorf30120086Preferiblemente preenfriado a -20 °C.
Puntas de pipeta esterilizadasCorningPreferiblemente preenfriadas a -20 °C.
Cubita de hielo picadoBel-ArtM18848-4001
Pequeño tanque de nitrógeno líquidoNALGENE4150-4000
B. Reactivos necesarios para la etapa 3 (lípidos en la preparación de la solución de aceite):
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)Lipoid556400
Polvo Colesterol SigmaC8667
CloroformoBio-Lab 3082301
Aceite mineralSigmaM5904Aceite ligero
Equipo necesario para el paso 2
Precalentado a 80 °C.
Debería permitir una temperatura controlada. 
Viales de vidrio con cuello de rosca de 2 mLCSI Analytical InnovationsVT009M-1232Para una escala mayor, use halcones de 50 mL y evapore el cloroformo usando un evaporador rotativo.
Tapón de rosca de 9 mmCSI Analytical InnovationsC395R-09LC
strong>C. Reactivos necesarios para el paso 3 (mezclas de reacción internas y de alimentación):
HEPESSpectrumH10891 M HEPES-KOH (pH = 8) - Tampón
de pH Hidróxido de potasio (KOH)Frutarom55290
1 M Acetato de magnesioMerck1.05819.0250Cofactor y estabilizador de carga negativa.
1 M Acetato de potasioCarlo Erba 470147Estabilizador de carga negativa.
5.2 M Acetato de amonioMerck1.01116.1000Estabiliza la carga negativa.
50% (p/v) Polietilenglicol 6000 (PEG)Merck8.07491.1000Aumenta la concentración de las macromoléculas.
0,5 M 3-fosfoglicerato (3-PGA)SigmaP8877Fuente de energía secundaria.
50 mM Mezcla de aminoácidos ISigmaLAA21-1KTAditivo de aminoácidos.
Contiene: 50 mM de cada uno de los siguientes 17 aminoácidos naturales: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina y valina.
50 mM Mezcla de aminoácidos IISigmaLAA21-1KTAditivo de aminoácidos.
Contiene: 50 mM de cada uno de los siguientes 3 aminoácidos naturales: triptófano, fenilalanina y tirosina.
100 mM Trifosfato de adenina (ATP)SigmaA3377Nucleótidos y fuente de energía.
50 mM Trifosfato de guanidina (GTP)SigmaG8877Nucleótidos y fuente de energía.
100 mM Trifosfato de uridina (UTP)ACROS ORGANICS226310010Aditivo de nucleótidos.
100 mM Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)INALCOINA-1758-1400Inducción de la expresión de genes.
2 M SacarosaJ.T. Baker 1933078Generación de un gradiente de densidad.
2 M GlucosaSigma16301Generando un gradiente de densidad.
H2O Agua ultrapura (UPW)Bio-Lab2321777500DNasa &
Lisado de S30-T7 libre de__Preparado en el paso 1.                                                                                                                                              Fuente de transcripción & translation components.
Almacenar en -80 ° C, descongele sobre el hielo estrellado justo antes de usarlo. 
Stock de plásmido de ADN de elección__Contiene la secuencia de la proteína solicitada.
Bajo T7 promotor
D. Equipo necesario para el paso 4 (preparación de células sintéticas)
incubadora de suelo o ThermomixerMRCTOU-120-2Incubadora agitadora de laboratorio 450x450mm, 400rpm, 70 ° C
Beca PHMT Bio PSC18Centrífuga Thermo Mixer
Thermo Scientific75004270(75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotor de cubeta oscilante.
Adecuado para tubos de 15 mL.
Preferiblemente cubos oscilantes.
Debe permitir al menos 1000 x g.
Preenfriado a 4 °C.
Centrífuga de mesaThermo Scientific75002420(75003424) - 24 x 1,5/2,0 ml de rotor con ClickSeal.
Adecuado para viales Eppendorf.
Preenfriado a 4 °C.
Mezclador de vórticeScientific industriesSI-0256
Cubo de hielo picadoBel-ArtM18848-4001
2 mL viales de vidrio con cuello de roscaCSI Analytical InnovationsVT009M-1232
Tubos de plástico estériles de 15 mLThermo Scientific339651
Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mLEppendorf30120086
Puntas de pipetaesterilizadas CorningEsterilizadas en autoclave.
C en polvo Mezclador de vórtice Industrias científicas SI-0256 Bloque calefactor TECHNE FDB03AD < RNasaAgitador de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
  2. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (23), 9431-9436 (2011).
  3. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  4. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  5. Stano, P. Gene Expression Inside Liposomes: From Early Studies to Current Protocols. Chemistry-A European Journal. , (2019).
  6. Lewandowski, B., et al. Sequence-specific peptide synthesis by an artificial small-molecule machine. Science. 339 (6116), 189-193 (2013).
  7. Li, J., et al. Cogenerating synthetic parts toward a self-replicating system. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1327-1336 (2017).
  8. Kim, T. W., et al. An economical and highly productive cell-free protein synthesis system utilizing fructose-1,6-bisphosphate as an energy source. Journal of Biotechnology. 130 (4), 389-393 (2007).
  9. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  10. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  11. He, M., He, Y., Luo, Q., Wang, M. From DNA to protein: No living cells required. Process Biochemistry. 46 (3), 615-620 (2011).
  12. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  13. Luisi, P. L., Ferri, F., Stano, P. Approaches to semi-synthetic minimal cells: a review. Naturwissenschaften. 93 (1), 1-13 (2006).
  14. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  15. Ding, Y., Contreras-Llano, L. E., Morris, E., Mao, M., Tan, C. Minimizing Context Dependency of Gene Networks Using Artificial Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (36), 30137-30146 (2018).
  16. Arnold, F. H. Design by directed evolution. Accounts of Chemical Research. 31 (3), 125-131 (1998).
  17. Chen, Z., et al. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion. Nature Chemical Biology. 14 (1), 86-93 (2018).
  18. Mohr, B. P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. While-you-wait proteins? Producing biomolecules at the point of need. Expert Review of Proteomics. 13 (8), 707-709 (2016).
  19. Krinsky, N., et al. Synthetic Cells Synthesize Therapeutic Proteins inside Tumors. Advanced Healthcare Materials. 7 (9), 1701163(2018).
  20. Kim, T. W., Kim, D. M., Choi, C. Y. Rapid production of milligram quantities of proteins in a batch cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 124 (2), 373-380 (2006).
  21. Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. Journal of the American Chemical Society. 139 (2), 587-590 (2016).
  22. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  23. Göpfrich, K., et al. One-Pot Assembly of Complex Giant Unilamellar Vesicle-Based Synthetic Cells. ACS synthetic biology. , (2019).
  24. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578(2014).
  25. Periasamy, A., et al. Cell-free protein synthesis of membrane (1,3)-beta-d-glucan (curdlan) synthase: co-translational insertion in liposomes and reconstitution in nanodiscs. Biochim Biophys Acta. 1828 (2), 743-757 (2013).
  26. Kalmbach, R., et al. Functional cell-free synthesis of a seven helix membrane protein: in situ insertion of bacteriorhodopsin into liposomes. Journal of Molecular Biology. 371 (3), 639-648 (2007).
  27. Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
  28. Rampioni, G., et al. Synthetic cells produce a quorum sensing chemical signal perceived by Pseudomonas aeruginosa. Chemical Communications. 54 (17), 2090-2093 (2018).
  29. Stano, P., Kuruma, Y., de Souza, T. P., Luisi, P. L. Biosynthesis of proteins inside liposomes. , Humana Press. 127-145 (2010).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  31. Krinsky, N., et al. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS One. 11 (10), 0165137(2016).
  32. Pédelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79(2006).
  33. Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (27), 11000-11004 (2013).
  34. Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).
  35. Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets. Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).
  36. Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells. Scientific Reports. 7, 45167(2017).
  37. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Extractos libres de c lulasproducci n de prote nasencapsulaci n en liposomasm todo de transferencia de emulsionespreparaci n de lisado bacterianoan lisis de citometr a de flujodetecci n por Western blotmicroscop a de fluorescencialiposomas ricos en colesterol

Artículos relacionados