Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

Resumen

Este protocolo describe el método, los materiales, el equipo y los pasos para la preparación ascendente de ARN y células sintéticas productoras de proteínas. El compartimento acuoso interno de las células sintéticas contenía el lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de una bicapa lipídica (es decir, liposomas estables), utilizando un método de transferencia de emulsión de agua en aceite.

Resumen

El enfoque de montaje ascendente para la construcción de células sintéticas es una herramienta eficaz para aislar e investigar procesos celulares en un entorno de imitación celular. Además, el desarrollo de sistemas de expresión sin células ha demostrado la capacidad de reconstituir los procesos de producción, transcripción y traducción de proteínas (ADN-ARN-proteína) de manera controlada, aprovechando la biología sintética. Aquí describimos un protocolo para preparar un sistema de expresión libre de células, incluyendo la producción de un potente lisado bacteriano y encapsular este liso dentro de vesículas unilamelares gigantes a base de lípidos ricos en colesterol (GUVs) (es decir, liposomas estables), para formar células sintéticas. El protocolo describe los métodos para preparar los componentes de las células sintéticas, incluida la producción de lisatos bacterianos activos, seguido de una preparación detallada paso a paso de las células sintéticas basada en un método de transferencia de emulsión de agua en aceite. Estos facilitan la producción de millones de células sintéticas de una manera sencilla y asequible con una alta versatilidad para producir diferentes tipos de proteínas. Las células sintéticas obtenidas se pueden utilizar para investigar la producción de proteínas/ARN y la actividad en un entorno aislado, en evolución dirigida, y también como una plataforma de administración controlada de fármacos para la producción bajo demanda de proteínas terapéuticas dentro del cuerpo.

Introducción

Las células sintéticas son partículas similares a células artificiales, imitando una o varias funciones de una célula viva, como la capacidad de dividir, formar interacciones de membrana y sintetizar proteínas basadas en un código genético^1,,2,3. Las células sintéticas que encierran sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) poseen una alta modularidad debido a su capacidad para producir varias proteínas y secuencias de ARN después de alteraciones en la plantilla de ADN. Presentando una alternativa atractiva a los enfoques actuales de la producción de proteína....

Protocolo

NOTA: La ilustración del protocolo de producción de las células sintéticas completas se presenta en la Figura 1. Según las necesidades del usuario, la expresión proteica (sección 3.2) y la formación de células sintéticas (sección 4) partes del protocolo también se pueden llevar a cabo de forma independiente (con algunas adaptaciones).

1. Preparación del lisado S30-T7

1. Placa de raya de la bacteria E. coli BL21(DE3) transformada con el ARN T7 polimerasa que expresa pAR1219 plásmido en una placa de agar LB complementado con 50 g/ml de ampicilina para obtener colonias individuales.
2. Prepa....

Resultados

Presentamos un protocolo para la preparación de células sintéticas encapsulando un sistema S30-T7 CFPS basado en BL21 E. coli dentro de las vesículas lipídicas. En la Figura 2se presenta una descripción esquemática del proceso de preparación que incluye una imagen de cada etapa. El éxito del proceso de preparación de células sintéticas depende del rendimiento adecuado de cada etapa y se realiza mediante diferentes parámetros. El protocolo debe ajustarse para adaptarse a la producció.......

Discusión

Este protocolo introduce un método simple y asequible para la producción de grandes cantidades de células sintéticas productoras de proteínas. El rendimiento de las células activas depende de una ejecución cuidadosa y precisa del protocolo con énfasis en varios pasos críticos. En la sección de preparación de lisados de este método, es esencial alcanzar la densidad bacteriana adecuada antes de la lisis celular para lograr una cantidad suficiente de proteínas en el lisato bacteriano. En segundo lugar, el proceso de lisis d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
A. Reactivos necesarios para el paso 1 (preparación del lisado S30-T7)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	Vector TargeTron para transformación.
Solución madre de 50 mg/mL de ampicilina	Sigma	A9518	almacenada a -20 °C.
10 g/L de bacto-triptona	BD Bioscience	211705	Para la preparación de la placa de agar Luria Bertani (LB) (1,5%).
10 g/L Cloruro de sodio (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Extracto de Betato-Levadura	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purificado	Merck	1.01614.5007
50 µ g/mL Ampicilina	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-triptona	BD Bioscience	211705	Para la preparación de medios Luria Bertani (LB) (20 mL).
10 g/L Cloruro de sodio (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Extracto de Betato-Levadura	BD Bioscience	212750
50 y micro; g/mL Ampicilina	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-triptona	BD Bioscience	211705	Para la preparación de caldo estupendo (TB) medio (1 L).
24 g/L de extracto de Betato-Levadura	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glicerol anhidro	Bio-Lab	7120501
2,32 g/L K2HPO4	Espectro químico	P1383
12,54 g/L KH2PO4	Espectro químico	P1380
50 y micro; g/mL de ampicilina	Sigma	A9518
Solución madre de 100 mM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtrado usando 0.2 y micro; m Filtro de jeringa de PVDF hidrófilo.
Solución madre de 0,1 M de ditiotreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtrado usando 0.2 y micro; m Filtro de jeringa de PVDF hidrófilo.
10 mM Tris-acetato a pH = 7,4	Sigma	T1503	Tampón de lisado S30 (1,5 L)
14 mM acetato de magnesio	Merck	1.05819.0250
60 mM acetato de potasio	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0,5 mL/L 2-mercaptoetanol	Sigma	M6250
Equipo necesario para el paso 1
100 mL matraces Erlenmeyer esterilizados	Thermo Scientific	50-154-2846	2 matraces
Erlenmeyer esterilizados de 2 L con deflectores	KIMAX-KIMBLE	25630	2 matraces
Incubadora de suelo	MRC	TOU-120-2	Incubadora agitadora de laboratorio 450x450mm, 400rpm, 70 °
Centrífuga	Thermo Scientific	75004270	(75003340) - Rotor de ángulo fijo Fiberlite F10-6 x 100 LEX. Debe permitir al menos 13,000 x g.        * Preenfriado a 4 °C.
Homogeneizador de alta presión	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Preenfriado a 4 °C.
-80oC congelador	SO-LOW	U85-18
Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mL	Eppendorf		30120086 Preferiblemente preenfriado a -20 °C.
Espectrofotómetro	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
Placa transparente de 96 pocillos	Thermo Scientific	167008
Cilindro graduado	esterilizado Corning
Tubos de centrífuga esterilizados	Eppendorf	30120086	Preferiblemente preenfriado a -20 °C.
Puntas de pipeta esterilizadas	Corning		Preferiblemente preenfriadas a -20 °C.
Cubita de hielo picado	Bel-Art	M18848-4001
Pequeño tanque de nitrógeno líquido	NALGENE	4150-4000
B. Reactivos necesarios para la etapa 3 (lípidos en la preparación de la solución de aceite):
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)	Lipoid	556400
Polvo Colesterol Sigma		C8667
Cloroformo	Bio-Lab 3082301
Aceite mineral	Sigma	M5904	Aceite ligero
Equipo necesario para el paso 2
			Precalentado a 80 °C. Debería permitir una temperatura controlada.
Viales de vidrio con cuello de rosca de 2 mL	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	Para una escala mayor, use halcones de 50 mL y evapore el cloroformo usando un evaporador rotativo.
Tapón de rosca de 9 mm	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
strong>C. Reactivos necesarios para el paso 3 (mezclas de reacción internas y de alimentación):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) - Tampón
de pH Hidróxido de potasio (KOH)	Frutarom	55290
1 M Acetato de magnesio	Merck	1.05819.0250	Cofactor y estabilizador de carga negativa.
1 M Acetato de potasio	Carlo Erba 470147		Estabilizador de carga negativa.
5.2 M Acetato de amonio	Merck	1.01116.1000	Estabiliza la carga negativa.
50% (p/v) Polietilenglicol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Aumenta la concentración de las macromoléculas.
0,5 M 3-fosfoglicerato (3-PGA)	Sigma	P8877	Fuente de energía secundaria.
50 mM Mezcla de aminoácidos I	Sigma	LAA21-1KT	Aditivo de aminoácidos. Contiene: 50 mM de cada uno de los siguientes 17 aminoácidos naturales: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina y valina.
50 mM Mezcla de aminoácidos II	Sigma	LAA21-1KT	Aditivo de aminoácidos. Contiene: 50 mM de cada uno de los siguientes 3 aminoácidos naturales: triptófano, fenilalanina y tirosina.
100 mM Trifosfato de adenina (ATP)	Sigma	A3377	Nucleótidos y fuente de energía.
50 mM Trifosfato de guanidina (GTP)	Sigma	G8877	Nucleótidos y fuente de energía.
100 mM Trifosfato de uridina (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Aditivo de nucleótidos.
100 mM Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Inducción de la expresión de genes.
2 M Sacarosa	J.T. Baker 1933078		Generación de un gradiente de densidad.
2 M Glucosa	Sigma	16301	Generando un gradiente de densidad.
H2O Agua ultrapura (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNasa &
Lisado de S30-T7 libre de	_	_	Preparado en el paso 1.                                                                                                                                              Fuente de transcripción & translation components. Almacenar en -80 ° C, descongele sobre el hielo estrellado justo antes de usarlo.
Stock de plásmido de ADN de elección	_	_	Contiene la secuencia de la proteína solicitada. Bajo T7 promotor
D. Equipo necesario para el paso 4 (preparación de células sintéticas)
incubadora de suelo o Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Incubadora agitadora de laboratorio 450x450mm, 400rpm, 70 ° C
Beca PHMT Bio	PSC18	Centrífuga Thermo Mixer
	Thermo Scientific	75004270	(75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotor de cubeta oscilante. Adecuado para tubos de 15 mL. Preferiblemente cubos oscilantes. Debe permitir al menos 1000 x g. Preenfriado a 4 °C.
Centrífuga de mesa	Thermo Scientific	75002420	(75003424) - 24 x 1,5/2,0 ml de rotor con ClickSeal. Adecuado para viales Eppendorf. Preenfriado a 4 °C.
Mezclador de vórtice	Scientific industries	SI-0256
Cubo de hielo picado	Bel-Art	M18848-4001
2 mL viales de vidrio con cuello de rosca	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Tubos de plástico estériles de 15 mL	Thermo Scientific	339651
Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Puntas de pipeta	esterilizadas Corning		Esterilizadas en autoclave.