Artículo de método

Panel LC-MS/MS validado para cuantificar 11 medicamentos resistentes a la tuberculosis en muestras de pelo pequeño

DOI:

10.3791/60861

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19 de mayo de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, TB Hair Analysis Laboratory, University of California San Francisco, 2Department of Epidemiology and Biostatistics, University of California San Francisco, 3Department of Medicine, Division of HIV, Infectious Diseases, and Global Medicine, University of California San Francisco, 4Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, University of California San Francisco

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos actuales para analizar la adherencia de los pacientes a regímenes complejos de tuberculosis farmacorresistente (DR-TB) pueden ser inexactos e intensivos en recursos. Nuestro método analiza el cabello, una matriz fácilde de recoger y almacenar, para concentraciones de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar los niveles de fármacos subnanogramos que se pueden utilizar para entender mejor la adherencia a los medicamentos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una amenaza creciente para la salud pública, y la evaluación de los niveles de medicamentos terapéuticos puede tener importantes beneficios clínicos. Los niveles de fármacos plasmáticos son la evaluación estándar de oro actual, pero requieren flebotomía y una cadena de frío, y capturan sólo una adherencia muy reciente. Nuestro método utiliza el cabello, una matriz que se recoge fácilmente y refleja la adherencia a largo plazo, para probar 11 medicamentos antituberculosos. El trabajo previo de nuestro grupo muestra que los niveles de medicamentos antirretrovirales en el cabello están asociados con los resultados del VIH. Nuestro método para fármacos DR-TB utiliza 2 mg de cabello (3 cm proximal a la raíz), que se pulveriza y se extrae en metanol. Las muestras se analizan con un único método LC-MS/MS, cuantificando 11 fármacos en una carrera de 16 minutos. Los límites más bajos de cuantificación (LLOQ) para los 11 fármacos oscilan entre 0,01 ng/mg y 1 ng/mg. La presencia de fármacos se confirma comparando las relaciones de dos transiciones de espectrometría de masas. Las muestras se cuantifican utilizando la relación de área del fármaco con la isotopotopopotopopoca delaterated, 15N-, o 13Con etiqueta C. Utilizamos una curva de calibración que va desde 0.001-100 ng/mg. La aplicación del método a una muestra de conveniencia de muestras capilares recogidas de pacientes con TB-DR en terapia observada directamente (DOT) indicó niveles de fármacos en el cabello dentro del rango dinámico lineal de nueve de los once fármacos (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacino, moxifloxacino, clofazimine, bedaquilina, pretomanide). Ningún paciente estaba tocando protionamida, y los niveles medidos de etionamida estaban cerca de su LLOQ (con trabajo adicional en lugar de examinar la idoneidad del metabolito de etionamida para monitorear la exposición). En resumen, describimos el desarrollo de un panel multianálisis para fármacos contra la TUBERCULOSIS en el cabello como una técnica para el monitoreo terapéutico de fármacos durante el tratamiento de la tuberculosis farmacorresistente.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En el siglo XXI, la tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una catástrofe en evolución para los ya débiles programas nacionales de control de la tuberculosis, con casos confirmados que se duplican solo en los últimos 5 años, lo que representa casi un tercio de todas las muertes relacionadas con la resistencia a los antimicrobianos en todo el mundo1,2. El tratamiento exitoso de la TB-DR ha requerido convencionalmente regímenes de segunda línea más largos y tóxicos que el tratamiento para la tuberculosis sensible a los medicamentos. Además, los pacientes con TB-DR a menudo tienen importantes desafíos preexistentes a la adherencia, lo que contribuyó a la aparición de resistencia inicialmente3.

A diferencia de la infección por VIH, en la que se pueden utilizar cargas virales para controlar el tratamiento, las variables sustitutas de la respuesta al tratamiento en la tuberculosis se retrasan y no son fiables en un nivel individual4. El control de la adherencia de los pacientes, un importante predictor de la concentración de fármacos antituberculosos y la insuficiencia del tratamiento, también es un desafío. La adherencia autoinformada sufre de sesgo de recuerdo y el deseo de complacer a los proveedores5,,6. Los recuentos de píldoras y los sistemas de monitoreo de eventos de medicamentos (MEMS) pueden ser más objetivo7 pero no miden el consumo real de drogas8,9,10. Los niveles de fármacos en las biomatrices pueden proporcionar datos de adherencia y farmacocinéticos. Por lo tanto, los niveles plasmáticos de fármacos se utilizan comúnmente en la monitorización terapéutica de fármacos11,12. Sin embargo, en el contexto de la monitorización de la adherencia a los medicamentos, los niveles plasmáticos representan una exposición a corto plazo y están limitados por una variabilidad significativa dentro e interpaciente al determinar el rango de referencia de adherencia adecuado. Efectos de "capa blanca", donde la adherencia mejora antes de las visitas a la clínica o al estudio, complica aún más la capacidad de los niveles plasmáticos para proporcionar patrones precisos de adherencia a los medicamentos13.

El cabello es una biomatriz alternativa que puede medir la exposición a largo plazo a fármacos14,,15. Muchos fármacos y metabolitos endógenos se incorporan a la matriz de proteína capilar de la circulación sistémica a medida que crece el cabello. A medida que este proceso dinámico continúa durante el crecimiento del cabello, la cantidad de droga depositada en la matriz capilar depende de la presencia continua de la droga en circulación, haciendo del cabello una excelente lectura temporal de la ingesta de drogas. El cabello como biomatriz tiene la ventaja adicional de ser fácilmente recogido sin la necesidad de cadena de frío para el almacenamiento y el envío en comparación con la sangre. Además, el cabello no es biopeligroso, lo que proporciona ventajas de viabilidad adicionales en el campo.

Los niveles de drogas capilares se han utilizado durante mucho tiempo en aplicaciones forenses16. Durante la última década, los niveles de antirretroviral del cabello han demostrado utilidad en la evaluación de la adherencia a las drogas en el tratamiento y la prevención del VIH, a lo que nuestro grupo contribuyó. Se ha demostrado que los niveles de ARV en el cabello son los predictores independientes más fuertes de los resultados del tratamiento en la infección por VIH17,18,19,20,21. Para determinar si los niveles capilares de pacientes con TB-DR tendrán la misma utilidad para predecir el resultado del tratamiento, utilizamos LC-MS/MS para desarrollar y validar un método para analizar 11 medicamentos de TB-DR en muestras de cabello pequeño. Como evaluación inicial del rendimiento del ensayo, medimos los niveles de fármacos contra la tuberculosis retro en una muestra de conveniencia de pacientes con TB-DR que reciben terapia observada directamente (DOT) en el Cabo Occidental, Sudáfrica22.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito antes de la recolección de muestras de cabello. Obtuvimos la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Ciudad del Cabo y la Universidad de California, San Francisco.

1. Muestreo capilar

  1. Obtener consentimiento informado por escrito.
  2. Use tijeras limpias para cortar aproximadamente 20-30 hebras de cabello del cuero cabelludo de la región occipital lo más cerca posible del cuero cabelludo.
  3. Coloque la cinta alrededor del lado distal del cabello para indicar la direccionalidad. Doble la muestra de cabello en un cuadrado de papel de aluminio y guárdelo a temperatura ambiente. Etiquetar el extremo distal del cabello para evitar una posible contaminación por manipulación adicional del extremo proximal.
  4. Además de las muestras de pacientes, recoja "pelo en blanco": una muestra de cabello del cuero cabelludo de alguien que no ha tomado medicamentos para la tuberculosis. Recoger una gran cantidad (>30 mg de pelo en blanco por cada 20 muestras de pacientes).

2. Extracción de drogas

  1. Tubos de cuentas de etiquetas. Cada muestra de paciente requiere un tubo. Etiquete 12 tubos de "C0" a "C11", uno para cada uno de los 12 puntos de calibración. Etiquete un tubo para control de baja calidad, un tubo para control de calidad media y un tubo para control de alta calidad. Por último, etiquete un tubo para Matrix Blank.
  2. Abra el cuadrado de papel de aluminio que contiene la muestra de cabello. Si la muestra de pelo es de más de 3 cm, corte el cabello a 3 cm del extremo proximal y use esa porción proximal para el análisis.
  3. Pesar 2 mg de la muestra de cabello en un tubo de cuentas.
  4. Pesar 2 mg de pelo en blanco en 16 tubos de cuentas adicionales. Estos se utilizarán como puntos de calibración, controles de calidad y matriz en blanco. Los tubos seguirán el mismo procedimiento de extracción que las muestras del paciente, además de ser pinchados con normas de referencia de fármacos en los niveles indicados en los pasos 2.8 y 2.9.
  5. Coloque todos los tubos de cuentas en el homogeneizador. Ejecute el homogeneizador a velocidad de 6,95 m/s. Ejecute dos ciclos de 30 s cada uno, con un período de descanso de 15 s entre los dos ciclos.
  6. Haga una mezcla estándar interna y agréguela a las muestras.
    1. Añadir 40 ml de metanol a un matraz volumétrico de 50 ml.
    2. En viales de vidrio ámbar, realice las mezclas de las normas internas que se muestran en la Tabla 1,utilizando el metanol como disolvente.
      NOTA: El metanol es muy volátil. Deje todos los viales tapados durante este proceso para evitar la pérdida debida a la evaporación.
    3. A partir de esas mezclas, añada el volumen mostrado en la Tabla 1 al matraz volumétrico de 50 ml. A continuación, llene el matraz a 50 ml con metanol.
    4. Tapar y mezclar el matraz volumétrico. Añadir 500 l de la mezcla a cada uno de los tubos de pelo pulverizados, excepto para el tubo en blanco de matriz. Añadir metanol de 500 ml al tubo en blanco de la matriz.
  7. Haga mezclas estándar de referencia.
    1. Constituir normas de referencia ordenadas de los siguientes fármacos con metanol para obtener la concentración que se muestra en la tabla en el paso 2.7.2. Sólo se requiere 1 ml de las siguientes concentraciones.
    2. Añadir 1768 l de metanol a un vial y, a continuación, añadir las cantidades de estándar de referencia enumeradas en la Tabla 2 al mismo vial para obtener un volumen final de 2 ml. Etiquete este vial "Ref Std Mix 1x". Vórtice.
    3. Espiga de 100 ml de "Ref Std Mix 1x" a 900 l de metanol en un vial nuevo. Etiquete este vial "Ref Std Mix 10x". Vórtice.
    4. Espiga de 100 ml de "Ref Std Mix 10x" a metanol de 900 ml en un vial nuevo. Etiquete este vial "Ref Std Mix 100x". Vórtice.
    5. Espiga de 100 ml de "Ref Std Mix 100x" a metanol de 900 ml en un vial nuevo. Etiquete este vial "Ref Std Mix 1000x". Vórtice.
  8. Espelibre los tubos de curva de calibración añadiendo la cantidad de Ref Std Mix descrita en la Tabla 3.
  9. Cree mezclas de control de calidad y tubos de control de calidad de picos.
    1. Etiqueta 5 viales "QC-A" a "QC-E".
    2. Añada las siguientes cantidades de metanol a los cinco viales etiquetados:
      QC-A: 990 ?L
      QC-B: 940 l
      QC-C: 950 sL
      QC-D: 980 sL
      QC-E: 950 l
       
    3. Usando las existencias de medicamentos de 1 mg/ml creadas en el paso 2.7.1, añada 10 l a los viales específicos que se enumeran a continuación. Para las existencias de BDQ y CLF, que se encuentran a 0,5 mg/ml, añada 20 ml a los viales que se enumeran a continuación.
      QC-A: PTH
      QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM
      QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA
      QC-D: PTH, EMB
      QC-E: CLF, BDQ, PTM

      NOTA: Algunos medicamentos están presentes en múltiples mezclas.
    4. Etiquete un vial como "QC-A df100". Diluir 10 l de QC-A en metanol de 990 ml.
    5. Etiquete un vial como "Stock de bajo control de calidad". Añadir 1832 l de metanol a este vial. Agregue las cantidades de mezclas de control de calidad que se detallan a continuación:
      QC-A df100: 80 l
      QC-B: 8 l
      QC-C: 80 sL
       
    6. Etiquete un vial como "Stock de control de calidad medio". Añadir 760 l de metanol a este vial. Agregue las cantidades de mezclas de control de calidad que se detallan a continuación:
      QC-A df100: 800 ?L
      QC-B: 40 sL
      QC-C: 400 sL
       
    7. Etiquete un vial como "Alto stock de control de calidad". Añadir 1376 l de metanol a este vial. Agregue las cantidades de mezclas de control de calidad que se detallan a continuación:
      QC-D: 160 l
      QC-E: 320 l
      MFX, 1mg/ml stock: 16 ?L
      InH, 1mg/ml stock: 32 ?L
      LFX, 1mg/mL stock: 32 ?L
      LZD, 1mg/ml stock: 32 ?L
      PZA, 1mg/ml: 32 ?L
       
    8. Espiga de 10 l de bajo qc en el tubo de abalorios de bajo control de calidad.
    9. Espiga de 10 l de control medio qc en el tubo de cuentas Mid QC.
    10. Espiga de 10 l de alto control de calidad en el tubo de cuentas de alto control de calidad.
  10. Colocar todos los tubos en una coctelera caliente durante 2 h a 37 oC. El temblor debe ser lo suficientemente lento como para que el agua no salpique sobre los tubos.
  11. Retire los tubos de la coctelera. Transfiera el líquido de los tubos de perla a nuevos tubos de microcentrífuga. Etiquete estos tubos de microcentrífuga de la misma manera.
  12. Añadir metanol de 500 ml a los tubos antiguos. Gorra y vórtice.
  13. Por segunda vez, transfiera el líquido de los tubos de perla al tubo de microcentrífuga correspondiente. Está bien transferir el cabello pulverizado. Esto eventualmente será centrifugado.
  14. Centrifugar los tubos de microcentrífuga durante 10 min a 2.800 x g.
  15. Retire cuidadosamente el líquido y transfieralo a nuevos tubos centrífugos con las etiquetas correspondientes. Tenga cuidado de no molestar o transferir el pellet para el cabello.
  16. Evaporar el líquido en los tubos centrífugos hasta sequerlo a 32 oC.
  17. Reconstituir las muestras añadiendo 200 l de fase móvil A (agua de grado HPLC con 1% de ácido fórmico) a los tubos secos. Vórtice.
  18. Transfiera el líquido a viales de ámbar con inserciones de 250 ml.

3. Preparación de LC-MS/MS

  1. Haga un litro de fase móvil A (agua de grado HPLC con 1% de ácido fórmico) añadiendo un poco de agua de grado HPLC a un matraz volumétrico de un litro. Luego agregue 10 ml de ácido fórmico >95% a ese matraz, y luego llene a la línea con agua de grado HPLC.
    1. Hacer un litro de fase móvil B (acetonitrilo con 0,1% ácido fórmico) añadiendo un poco de acetonitrilo a un matraz volumétrico de un litro. Luego agrega 1 ml de >95% de ácido fórmico a ese matraz, y luego llene la línea con acetonitrilo.
  2. Instale una columna de 2 x 100 mm con un tamaño de partícula de 2,5 mm y un tamaño de poro de 100 o con perlas de fenilo ligadas al éter con punta polar, totalmente hechas de sílice porosa en el compartimiento de la columna. Asegúrese de que la columna también tenga instalado el cartucho de protección recomendado por el fabricante.
  3. Abra el software de adquisición de datos y haga doble clic en Configuración de hardware. Resalte LCMS y haga clic en Activar perfil.
    1. Haga clic en Nuevo subproyectoo, si ya existen otros subproyectos, haga clic en Copiar subproyecto. Asigne un nombre al subproyecto.
    2. Haga clic en Nuevo documento. Haga doble clic en Método de adquisición. Haga clic en Especificación física en la ventana Método de adquisición.
    3. Cambie el menú desplegable Tipo de análisis a MRM (MRM). Asegúrese de que Polarity esté establecido en Positivo.
    4. Haga clic en Importar lista y seleccione el método transitions.csv del archivo .csv MDR-TB que se incluye en Materiales suplementarios.
    5. Desplácese hacia abajo y establezca la Duración en 16.751 min. El tiempo de ciclo y el número de ciclos adecuados se rellenarán automáticamente.
    6. En la barra lateral izquierda, haga clic en Válvula Valco integrada. Asegúrese de que el nombre de la posición del paso 0 es A. En la columna Tiempo total (min), escriba 0,4 en la primera fila y 13 en la segunda fila.
    7. En la columna Posición, establezca la fila uno en B y la fila dos en A.
    8. En la barra lateral izquierda, haga clic en Bomba binaria. Establezca la tabla de gradiente y caudal de acuerdo con la Tabla 4.
    9. En la barra lateral izquierda, haga clic en Autosampler. Cambie el volumen de la inyección a 10 s. Haga clic en Control de temperatura activado y, a 4 oC.
    10. En la barra lateral izquierda, haga clic en Compartimiento de columnas. Establezca las temperaturas derecha e izquierda a 50 oC.
    11. Método de cierre y guardado.
  4. Cree lote haciendo clic en Nuevo documento y seleccionando Adquisición de lote. Escriba un nombre de conjunto y seleccione el método recién creado en la barra desplegable.
    1. En una hoja de cálculo, cree un lote que siga este orden: curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad. Añada inyecciones en blanco solventes al inicio y al final de la carrera, así como antes y después de la curva de calibración, los controles de calidad y las muestras de pacientes. Coloque al menos ocho inyecciones de disolvente en blanco después de las inyecciones de la curva de calibración y del vial de control de alta calidad para reducir el arrastre de analitos.
      NOTA: Es posible que sea necesario añadir más inyecciones en blanco con disolventes en función de la edad de la columna.
    2. En la columna adyacente a los nombres de muestra, escriba la posición del muestreador automático correspondiente para el vial correspondiente.
    3. Haga clic en Agregar conjunto. En la ventana emergente, escriba el número de muestras del lote.
    4. Copie y pegue nombres de muestra y ubicaciones de viales de la hoja de cálculo en el lote recién creado.
    5. Vaya a la pestaña Submit Enviar.
  5. Sistema de equilibrio mediante la inserción de la línea de disolvente A en la fase móvil A y la línea de disolvente B en la fase móvil B. Abra la válvula de purga en la bomba binaria.
    1. Ajuste la composición del disolvente a 50% B a un caudal de 4 ml/min. Encienda la bomba binaria.
    2. Después de 5 min, disminuya el flujo a 0,3 ml/min. Cierre la válvula de purga. Compruebe si hay fugas.
    3. En el software, pulse Equilibrate en la barra de herramientas superior. Ajuste el tiempo a >5 min, pulse OK.
    4. Después de que el instrumento se haya equilibrado, los módulos en la parte inferior derecha de la ventana aparecerán en verde. Compruebe que la presión se ha estabilizado y, a continuación, inicie el lote haciendo clic en Iniciar muestra.

4. Análisis de datos

  1. Una vez completado el lote, abra el software de cuantificación. Haga clic en el icono de varita para crear una nueva tabla de resultados.
    1. Haga clic en Examinar para ir a la carpeta adecuada y, a continuación, resalte el archivo de datos y haga clic en la flecha hacia la derecha para mover los datos al área Seleccionado. Haga clic en Siguiente.
    2. Seleccione Crear nuevo método y haga clic en Nuevo. Introduzca el nuevo nombre del método de cuantificación y pulse Guardar y, a continuación, Siguiente.
    3. Seleccione la primera inyección del punto de calibración central. Pulse Siguiente.
    4. Marque todas las transiciones de las normas internas en la columna IS.
    5. Para las transiciones del cuantificador para las normas de referencia, seleccione el IS correspondiente en la columna Nombre IS. Haga clic en Siguiente.
    6. Desplácese por las transiciones para asegurarse de que el tiempo de retención seleccionado automáticamente es preciso. Asegúrese de que El suavizado gaussiano esté establecido en 1.5. Todos los demás ajustes predeterminados pueden permanecer tal está (es decir, Porcentaje de ruido 100%, Sub de línea base. Ventana 2.00 min, Peak Splitting 2 puntos).
      NOTA: Si lo desea, modifique los parámetros de integración automática en este punto. Dado que estos parámetros cambian en función de la configuración del instrumento, no hemos incluido el nuestro aquí.
    7. Haga clic en Finalizar para aplicar el método de cuantificación al lote.
  2. Haga clic en la parte superior izquierda Muestra el botón de revisión de picos para ver los cromatogramas. Navegue a través de las transiciones usando la barra lateral izquierda. Desplácese por cada inyección de cada transición de cuantificador e integre manualmente el pico correcto si es necesario.
    1. Para integrar manualmente un pico, haga clic en el botón Habilitar modo de integración manual, haga zoom en el cromatograma haciendo clic y arrastrando a lo largo del eje X o Y y, a continuación, dibuje una línea de una línea base a la otra línea base, definiendo el pico. La Figura 3 muestra dos cromatogramas: uno que tiene INH, y por lo tanto se ha integrado manualmente, y otro que no tiene INH.
      NOTA: Todas las inyecciones deben integrarse con los mismos parámetros. El ancho de pico puede proporcionar una guía para adherirse a estos parámetros, pero a veces el ancho de pico será diferente. Para cuantificar un pico, el tiempo de retención debe estar dentro de los 0,15 min del tiempo de retención previsto para ese analito (según lo definido por los picos estándar de referencia), se confirma cualitativamente como que tiene la relación cuantificador/calificador esperada (como se muestra en la Figura 2),y tener una relación señal-ruido superior a 10.
  3. En la columna Tipo de muestra, establezca las inyecciones de curva de calibración (con la excepción de las inyecciones de curva de calibración en blanco) en Estándar. Establezca las inyecciones de control de calidad en Control de calidad. Deje las inyecciones restantes como Desconocido.
    NOTA: Esto se establecerá en todas las transiciones.
  4. En la columna Concentración real, escriba las concentraciones que se encuentran en la Tabla 5 para todas las curvas de calibración y las inyecciones de control de calidad.
  5. Haga clic en el segundo desde la parte superior izquierda Muestra el botón de curva de calibración. Haga clic en el botón Regresión.
  6. Establezca Tipo de ponderación en 1/x y pulse OK.
  7. Valide la curva de calibración y las muestras de control de calidad para asegurarse de que el lote se ejecutó correctamente.
    1. Para cada transición de referencia del cuantificador (no transiciones estándar internas), mire la precisión de la inyección de cada curva de calibración (en la columna Precisión). Al menos dos tercios de los puntos de calibración deben tener una precisión dentro del 80-120%.
    2. Para puntos de calibración muy fuera de la precisión esperada, la inyección puede ser un valor atípico. Excluya los valores atípicos si su concentración calculada es superior a dos desviaciones estándar de las otras dos inyecciones de ese vial. Haciendo clic en el botón "et peak to 'not found above each each cromatogram.
    3. Compruebe que el valor R mostrado encima de la curva de calibración es >0,975.
    4. Compruebe que todas las inyecciones de control de calidad tienen una precisión dentro del 80-120%.
  8. Si se cumplen todas las condiciones anteriores, el lote ha pasado y las muestras se pueden cuantificar. Haga clic en Editar en la barra de herramientas y, a continuación, haga clic en Copiar tabla completa. Pegue la tabla en una hoja de cálculo.
  9. Tome el promedio de la concentración calculada de las dos inyecciones de muestra para determinar la concentración notificada de cada muestra.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la Figura 1se muestra una ilustración de un cromatograma con niveles confirmados de los 11 fármacos contra la tuberculosis antirretropara desastres. El tiempo de retención para cada analito puede cambiar cuando se utilizan diferentes instrumentos y columnas, por lo que el tiempo de retención exacto debe determinarse individualmente.

Los cromatógramas de iones extraídos (EICI) para un medicamento en particular (isoniazida, INH) en uno de los calibradores (muestr...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí informamos del protocolo para el método que desarrollamos y validamos para cuantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados en el tratamiento de la TB-DR en muestras de cabello pequeño utilizando LC-MS/MS. Ningún otro método para cuantificar estos 11 fármacos en el cabello ha sido previamente desarrollado, validado y publicado. Nuestro método puede cuantificar los niveles de subnanogramos de fármacos en sólo 20-30 hebras de cabello de aproximadamente 3 centímetros (cm) de longitud (2 mg) y ya ha sido validado

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas RO1 AI123024 (Co-PIs: John Metcalfe y Monica Gandhi).

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores quisieran dar las gracias al profesor Keertan Dheda, al Dr. Ali Esmail y Marietjie Pretorius en el Instituto de Pulmón de la Universidad de Ciudad del Cabo, quien facilitó la recolección de muestras de cabello para el estudio. Los autores agradecen además las contribuciones de los participantes de este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vials de inyección de 2 mLAgilent Technologies5182-0716
Insertos de vial de inyección de 250 uLAgilent Technologies5181-8872
Ruptor de talón 24OMNI International19001
Tubos de ruptor de perlas (kit de 2 mL de perlas, cerámica de 2,8 mm, microtubos de 2 mL)OMNI International19628
BedaquilinaToronto Research ChemicalsB119550
Bedaquilina-d6Toronto Research ChemicalsB119552
ClofaziminaToronto Research ChemicalsC324300
Clofazimina-d7Toronto Research ChemicalsC324302
Tubos desechables de cultivo de vidrio de calVWR60825-425
EtambutolToronto Research ChemicalsE889800
Ethambutol-d4Toronto Research ChemicalsE889802
EtionamidaToronto Research ChemicalsE890420
Etionamida-d5ClearSynthCS-O-06597
Ácido fórmicoSigma-AldrichF0507-100mL
Botellas de vidrioCorning1395-1L
Hot ShakerBellco Glass Inc7746-32110
HPLCAgilent TechnologiesInfinity 1260
Acetonitrilo de grado HPLCHoneywell015-4
Metanol de grado HPLCHoneywell230-1L
Agua de calidad HPLCAqua Solutions IncW1089-4L
IsoniacidaToronto Research ChemicalsI821450
Isoniazid-d4Toronto Research ChemicalsI821452
Columna LC, Synergi 2.5 mmm Polar RP 100 A 100 x 2 mmFenomeno00D-4371-B0
Cartucho de guardia LCFenomenoAJ0-8788
Portacartuchos de guardia LCFenomenoAJ0-9000
Software de cuantificación LC-MS/MSSciexMulticuantitivo 2.1
LevofloxacinaSigma-Aldrich1362103-200MG
Levofloxacina-d8Toronto Research ChemicalsL360002
LinezolidToronto Research ChemicalsL466500
Linezolid-d3Toronto Research ChemicalsL466502
Tubos microcentrífugasE& K Scientific695554
MoxifloxacinaToronto Research ChemicalsM745000
Moxifloxacina-13C, d3Toronto Research ChemicalsM745003
MS/MSSciexTriple Quad 5500
OPC 14714Toronto Research ChemicalsO667600
Pretomanida (PA-824)Toronto Research ChemicalsP122500
ProtionamidaToronto Research ChemicalsP839100
Protionamida-d5Toronto Research ChemicalsP839102
PirazinamidaToronto Research ChemicalsP840600
Pirazinamida-15N, d3Toronto Research ChemicalsP840602
Tapas de tabique para viales de inyecciónAgilent Technologies5185-5862
Evaporador Turbovap LVBiotage103198/11

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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