Artículo de método

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

DOI:

10.3791/60939

⸱

12 de abril de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Neurosurgery, University of Michigan Medical School, 2Dept. of Cell and Developmental Biology, University of Michigan Medical School, 3Dept. of Ophthalmology & Visual Science, University of Michigan Medical School, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical School

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los gliomas son tumores cerebrales primarios caracterizados por su invasividad y heterogeneidad. Patrones histológicos específicos como pseudopalisades, proliferación microvascular, transformación mesenquimal y necrosis caracterizan la heterogeneidad histológica de los gliomas de alto grado. Nuestro laboratorio ha demostrado que la presencia de altas densidades de células mesenquimales, llamadas oncostreams, se correlacionan con la neoplasia tumoral. Hemos desarrollado un enfoque único para entender los mecanismos que subyacen al crecimiento y la invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo integral que utiliza microdisección de captura láser (LMD) y secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de estructuras multicelulares heterogéneas intratumorales (es decir, áreas mesenquimales o áreas de invasión tumoral). Este método mantiene una buena histología tisular y la integridad del ARN. La perfusión, la congelación, la incrustación, la seccionamiento y la tinción se optimizaron para preservar la morfología y obtener muestras de microdisección láser de alta calidad. Los resultados indican que la perfusión de ratones portadores de glioma utilizando 30% de sacarosa proporciona una buena morfología y calidad de ARN. Además, la tinción de secciones tumorales con un 4% de cresyl violeta y 0,5% de eosina da como resultado una buena tinción nuclear y celular, preservando al mismo tiempo la integridad del ARN. El método descrito es sensible y altamente reproducible y se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral en varios modelos tumorales. En resumen, describimos un método completo para realizar LMD que preserva la morfología y la calidad del ARN para la secuenciación para estudiar las características moleculares de las estructuras multicelulares heterogéneas dentro de tumores sólidos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los gliomas son los tumores primarios más agresivos del sistema nervioso central. Son altamente invasivos y heterogéneos1. El análisis de los componentes celulares y moleculares del tumor revelará nuevas dianas terapéuticas.

Entre los diferentes métodos disponibles actualmente, la microdisección de captura láser (LMD) del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y fiable que permite el aislamiento de áreas anatómicas discretas o poblaciones celulares específicas de los tejidos tumorales para estudiar su perfil molecular2,,3. LMD permite el an....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los métodos descritos aquí que utilizan animales experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan.

NOTA: Las neuroesferas de Glioma generadas a partir de un GEMM o líneas estables se pueden utilizar para el injerto de tumor intracraneal en ratones10 y procesarse para la secuenciación de LMD y ARN. Estas células expresan constitutivamente la luciferasa de la luciérnaga y las proteínas GFP, que se utilizarán aún más para el análisis del crecimiento tumoral y la localización.

1. Generación de modelo de glioma ....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nuestro laboratorio ha generado modelos de ratón genéticamente diseñados (GEMM) utilizando el sistema de transposasa de belleza durmiente(Figura 1A). Este sistema incorpora alteraciones genéticas específicas en el genoma de las células progenitoras neuronales en ratones neonatales. Estas células progenitoras alteradas forman tumores glioma endógenos. Las secuencias de plásmidos utilizadas para generar los tumores fueron: (1) pT2C-LucPGK-SB100.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la heterogeneidad e invasión del glioma es de vital importancia para descubrir nuevas dianas terapéuticas13. En este manuscrito, describimos un método detallado y optimizado para analizar el paisaje molecular de la heterogeneidad e invasión del glioma utilizando microdisección de captura láser (LMD) seguida de análisis transcriptomico.

La microdisección de captura láser (LMD) se puede utilizar para identificar diferent.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los autores de este artículo no declaran posibles conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, (NIH/NINDS) Subvenciones: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subvenciones R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; el Departamento de Neurocirugía, Rogel Cancer Center en la Universidad de Michigan, ChadTough Foundation, y Leah's Happy Hearts Foundation to M.G.C. and P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 to M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Proyecto F049768 a A.C. University of Michigan Forb....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Accutase Solución de Desprendimiento de Células Biolegend423201
EGF humano recombinante sin animalesPeprotechAF-100-15
Antibiótico-Antimicótico (100X)Gibco15240062
B-27 Suplemento (50X), sin sueroGibco
Tampón RLT Qiagen79216
Corning Tubos de PCRSigma AldrichCLS6530
Cresyl Acetato VioletaSigma AldrichC5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mezcla de nutrientes F-12Gibco11330057
Eosin ySigma AldrichE4009
HiSeq 4000IlluminaN/A
Sistema de Microdisección Láser (LMD)LeicaLMD7000
N-2 Suplemento (100X)Gibco17502048
Normocin - Reactivo antimicrobianoInvivogenant-nr-1
Moldes de inclusión desechables despegables ElectrónicaMicroscopy Sciences70182
PEN Portaobjetos de vidrio de membrana (2 µ m)Lieca1150518
Solución PuntualZymo ResearchD3001-1
FGF humano recombinante-básicoPeprotech100-18B-1MG
Criostato de investigaciónLeicaCM3050s
RNaseZap Solución de descontaminación de ARNasaFisher ScientificAM9780
RNeasy Plus Micro KitQiagen74034
SMARTer Kit de secuenciación de ARN total trenzado v2 - Pico Input Mammalian TakaraBio634411
Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571
17504044

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).
  2. Espina, V., et al. Laser-capture microdisse....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Secuenciaci n de ARNheterogeneidad del gliomaperfusi n tisularcrioseccionamientotinci n con violeta de cresilotinci n con eosina Ymorfolog a tumoralperfil molecular

Artículos relacionados