El protocolo presentado describe un método para un ensayo de crecimiento de neurito y la evaluación de la neurotoxicidad de compuestos de moléculas pequeñas.
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Artículo de método
Un ensayo de crecimiento de neurita y evaluación de neurotoxicidad con neuronas derivadas de células de progenitor neuronales humanos
En este artículo
Resumen
Resumen
El ensayo de crecimiento de la neurita y la evaluación de la neurotoxicidad son dos estudios principales que se pueden realizar utilizando el método presentado en el presente documento. Este protocolo proporciona un análisis fiable de la morfología neuronal junto con mediciones cuantitativas de modificaciones en la longitud de la neurita y la localización de proteínas sinápticas y abundancia en el tratamiento con compuestos de moléculas pequeñas. Además de la aplicación del método presentado en estudios de crecimiento de neuritas, se puede realizar una evaluación de la neurotoxicidad para evaluar, distinguir y clasificar los compuestos químicos comerciales en función de su posible efecto de neurotoxicidad del desarrollo.
A pesar de que las líneas celulares se utilizan hoy en día en ensayos de cribado compuestos en neurociencia, a menudo difieren genética y fenotípicamente de su origen tisular. Las células primarias, por otro lado, mantienen marcadores y funciones importantes observados in vivo. Por lo tanto, debido al potencial de traducción y la relevancia fisiológica que estas células podrían ofrecer un ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad puede beneficiarse considerablemente del uso de células progenitoras neuronales humanas (hNPC) como el modelo de células humanas primarias.
El método presentado aquí se puede utilizar para detectar la capacidad de los compuestos para inducir el crecimiento de la neurita y la neurotoxicidad aprovechando las neuronas derivadas de células progenitoras neuronales humanas, un modelo celular que representa estrechamente la biología humana."
Introducción
El crecimiento de la neurita es un proceso fundamental para la formación de la red neuronal y la regeneración nerviosa1,2. Después de una lesión, el crecimiento de la neurita juega un papel clave en la regeneración del sistema nervioso. El crecimiento de la neurita es también un elemento importante de la señalización extracelular en la inducción de actividades regenerativas neuronales para mejorar los resultados de los trastornos neurodegenerativos y lesiones neuronales3,,4,5,6.
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Protocolo
Declaración de ética: Los especímenes fetales fueron recibidos del Laboratorio de Investigación de Defectos de Nacimiento de la Universidad de Washington en Seattle a través de un programa de distribución de tejidos apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH). El Laboratorio de Investigación de Defectos De Nacimiento obtuvo el consentimiento fundamentado por escrito apropiado de los padres y la adquisición de tejidos fue monitoreada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington. Todo el trabajo se realizó con la aprobación de la Oficina de Investigación de Sujetos Humanos de la Universidad de Miami8.
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Resultados
El protocolo presentado en el manuscrito se ha utilizado con éxito en dos artículos publicados recientemente22,,23. La Figura 3 demuestra el uso de neuronas derivadas de hNPCs en el examen del efecto de los inhibidores de la HDAC como compuestos epigenéticos en la extensión de las neuritas como marcador para el crecimiento de la neurita y la posterior capacidad neurogénica de compuestos de moléculas pequeñas.
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Discusión
Este protocolo es uno de los pocos artículos publicados que describen la prueba de la longitud de la neurita tras el tratamiento con compuestos de prueba. Además, describimos cómo utilizar hNPCs para un ensayo de crecimiento de neurita y una evaluación de neurotoxicidad. Mediante la utilización de este ensayo de crecimiento de neurita y la evaluación de la neurotoxicidad en las neuronas derivadas de hNPCs, se demuestra el potencial neurogénico de una categoría de compuestos epigenéticos de moléculas pequeñas, inhibidores.......
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Divulgaciones
Todos los autores no indican posibles conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la beca de investigación NIMAD (940714) otorgada a MAF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaobjetos de cámara de vidrio de 4 pocillos | Sigma | PEZGS0816 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | R37117 | |
| Antibiótico-Antimicótico | Gibco | 15240062 | |
| Anti-β-Tubulina III | Thermo | MA1-118X | |
| B27 | Thermo | ||
| B27 - menos vitamina A | Thermo | 12587010 | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | |
| BSA | Sigma | A8531 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7572 | |
| CoolCell | Corning | 432000 | Contenedores de congelación de celdas que garantizan una tasa controlada estandarizada -1° Congelación de celdas C/minuto en un -80° C congelador |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | Medio de criopreservación que contiene 10% DMSO |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO | Sigma | 34869-100ML | |
| EGF Gibco | PHG0311 | ||
| FGF | Gibco | PHG6015 | |
| Formaldehído | Thermo | FB002 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Glutamax | Gibco 35050061 Suplemento | de L-alanil-L-glutamina | |
| Suero de cabra | Thermo | 50062Z | |
| Heparina | Calbiochem | 375095 | |
| Laminina | Sigma | L2020-1MG | |
| Ácido L-Ascórbico | Sigma | A92902-25G | |
| L-lisina | Sigma | L5501 | |
| MEM aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140050 | |
| mFreSR | StemCell Technologies | 5854 | Medio de criopreservación sin suero diseñado para la criopreservación de células madre pluripotentes embrionarias humanas |
| N2 | Gibco | 17502048 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| Medio Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Nunc 384-Pocillos Microplacas de poliestireno blanco | Thermo | 164610 | |
| PBS | Thermo | 10010-049 | |
| Poly-L-lisina | Sigma | P5899-5MG | |
| ProLong Gold Mountant Antidecoloración | Thermo | P10144 | |
| Ácido retinoico | Sigma | R2625 | |
| Azida sódica | Sigma | S2002 | |
| StemPro Accutase | Gibco | A1110501 | Reactivo de disociación celular que contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas |
| Sinaptofisina | Thermo | MA5-14532 | |
| Tris Base | Sigma | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML |
Referencias
- Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
- Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P.
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Reimpresiones y permisos
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