Summary
Descrevemos um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico em ratos, implicando modificações nas estratégias atuais, que levam a uma abordagem cirúrgica simplificada. Além disso, descrevemos um novo modelo de rejeição pela injeção in-ear de células musculares cardíacas vitais, permitindo novas análises imunológicas de transplante em ratos.
Abstract
O transplante de coração heterotópico em ratos tem sido um modelo comumente utilizado para diversos estudos imunológicos há mais de 50 anos. Várias modificações foram relatadas desde a primeira descrição em 1964. Após 30 anos realizando transplante de coração heterotópico em ratos, desenvolvemos uma abordagem cirúrgica simplificada, que pode ser facilmente ensinada e realizada sem maior treinamento cirúrgico ou antecedentes.
Após a dissecção da aorta ascendente e da artéria pulmonar e da ligadura de veias superiores e inferiores caval e pulmonar, o coração do doador é colhido e posteriormente perfundido com solução salina gelada suplementada com heparina. Após a fixação e incisamento dos vasos abdominais receptores, o doador ascendente de aorta e artéria pulmonar são anastomosados para a aorta abdominal receptora e veia cava inferior, respectivamente, usando suturas contínuas de corrida.
Dependendo de diferentes combinações doador-receptor, este modelo permite análises de rejeição aguda ou crônica de aloenxertos. O significado imunológico deste modelo é ainda mais aprimorado por uma nova abordagem da injeção intra-auricular de células musculares cardíacas vitais e posterior análise do tecido linfático cervical drenante.
Introduction
O transplante de coração heterotópico é um modelo experimental frequentemente utilizado para diferentes investigações sobre tolerância ao transplante, rejeição aguda e crônica de aloenxerto, lesão isquemia-reperfusão, perfusão de máquinas ou remodelagem cardíaca. Entre outras vantagens, a função do enxerto pode ser monitorada de forma não invasiva por palpação e a falha do enxerto não leva a um prejuízo vital do receptor em contraste com outros órgãos, como rins ou fígados.
Em 1964, Abbott et al. descreveram inicialmente transplante de coração abdominal heterotópico em ratos1. Mais tarde, em 1966, a técnica de ponta a ponta para anastomoses foi descrita por Tomita et al.2. As bases para o modelo atualmente usado foram relatadas por Ono e Lindsey em 19693. Durante as últimas décadas, várias modificações foram publicadas para criar diferentes tipos de enxertos cardíacos ventriculares esquerdos descarregados, parcialmente carregados ou carregados, incluindo transplante heterotópico heterotópico coração-pulmão4,5,6. Para análises imunológicas, é mais comumente realizado um transplante de enxerto cardíaco carregado sem volume. Neste caso, o fluxo sanguíneo entra retrógradamente na aorta ascendente do doador e, posteriormente, nas artérias coronárias. A drenagem venosa ocorre ao longo do seio coronário no átrio direito e ventrículo(Figura 1A-B). Portanto, o ventrículo esquerdo está excluído do fluxo sanguíneo, além de quantidades marginais de sangue das veias tesésias. Isso também o torna um modelo útil para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos durante a terapia do dispositivo de assistência ventricular esquerda7.
O transplante de coração heterotópico tem sido realizado em várias espécies, incluindo camundongos, coelhos, porcos e tem sido até usado como um dispositivo de assistência uniou ou biventricular em humanos8,,9,,10,11. O rato ainda representa um animal experimental popular para modelos de transplante, especialmente porque os tempos de sobrevivência do enxerto para diferentes combinações de cepas de ratos foram bem definidos no passado e um grande número de reagentes imunológicos são acessíveis12,13. Ao contrário dos camundongos, os ratos são maiores fazendo cirurgia e acesso ao tecido linfático para análises imunológicas mais viável12. Além disso, a introdução de tecnologias comerciais de clonagem em ratos nos últimos anos provavelmente levará a um interesse recorrente em modelos experimentais de ratos14.
Em geral, enxertos cardíacos heterotópicos podem ser anexados aos vasos receptores, seja realizando anastomose cervical ou abdominal. No entanto, alguns estudos sugerem que uma anastomose femoral facilita o melhor monitoramento devido ao melhor acesso à palpação manual ou ecocardiografia transfemoral e, portanto, permite uma detecção mais precisa da falha do enxerto15,16.
Mostrou-se que não há diferença quanto ao tempo de operação, taxa de complicações, desfecho e tempo de sobrevivência do enxerto entre ambas as técnicas de anastomose17. Claramente, a disponibilidade de um número suficiente de linfonodos drenantes deve ser mencionada como um benefício da anastomose cervical; no entanto, períodos de treinamento mais longos são necessários. Em contraste, a anastomose abdominal é menos complicada e igualmente valiosa para investigações imunológicas, especialmente quando combinada com resultados de um novo método de injeção intra-auricular de células musculares cardíacas alogênicas e linfadenectomia cervical subseqüente. Uma combinação de ambos os modelos oferece um amplo espectro de análises imunológicas pós-intervencionistas.
O protocolo a seguir refere-se à operação em pares de cirurgiões, a fim de reduzir o tempo de isquemia. No entanto, todos os experimentos podem ser realizados por uma única pessoa. A configuração de instrumentos e materiais para explantação e implantação de coração é exibida na Figura 2A-B.
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Protocol
Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes do Conselho de Ética Animal das autoridades regionais de defesa do consumidor e segurança alimentar da Baixa Saxônia (LAVES, Oldenburg, Alemanha) com as ids de aprovação 12/0768 e 17/2472.
1. Explantação e perfusão cardíaca
NOTA: Como doadores de enxerto, foram utilizados ratos do sexo feminino ou masculino com idade de 7 a 22 semanas.
- Anestesie o rato doador por inalação de isoflurano (indução a 5% e manutenção a 3% com fluxo De2 de 1 L/min). Injete 5 mg de Carprofen subcutâneamente por kg de peso corporal para analgesia perioperatória e verifique a ausência do reflexo de abstinência do dedo do pé.
- Aplique lubrificante ocular e remova a pele abdominal e torácica usando um cortador mecânico.
- Coloque o doador em posição supina, fixar os membros na base da mesa de operação com faixas elásticas e esterilizar a pele com 70% de etanol ou outra alternativa suficiente.
- Incise a pele na direção longitudinal e após a aplicação do anestésico local (por exemplo, lidocaína 0,2%) realizar uma laparotomia mediana usando uma tesoura.
- Insira retráteis, mobilize o intestino à esquerda do doador e exponha a veia cava inferior com cotonetes esterilizados.
- Para anticoagulação, injete 500 U.I. de heparina dissolvida em 1 mL de solução salina isotônica gelada por via intravenosa, perfurando a veia cava inferior. Pare o sangramento no local da punção por compressão de luz com um cotonete após a retração da agulha(Figura 3A).
- Incisa o diafragma e realiza toracotomia lateral em ambos os lados do doador.
- Fixar a parede ventral mobilizada do tórax na mesa de operação.
- Remova o pericárdio e o nervo vagal por preparação contundente usando dois suportes de microagulhas.
- Realizar transsecção de vasos abdominais a fim de exanguiar o doador e descarregar o coração.
- Insira o ramo contundente de uma sonda que apontou a tesoura no seio pericárdico transversivo e separe a aorta ascendente e a artéria pulmonar o mais distal possível sob leve tração caudal do coração com uma compressa molhada(Figura 3B).
- Coloque uma única ligadura 5-0 em torno da veia cava superior e inferior e das veias pulmonares e aperte-a o mais dorsal possível (Figura 3C).
- Respedao do tecido dorsal à ligadura e extraia o coração(Figura 3D).
- Perfundir o coração explantado com uma cânula de 18 G de um cateter intravenoso através da aorta ascendente e da artéria pulmonar com 30 mL de solução salina de isotona gelada suplementada com 1000 U.I. de heparina e colocar o coração em um tubo de 15 mL cheio de solução salina no gelo(Figura 3E-F).
2. Implantação cardíaca
NOTA: Como destinatários, foram utilizados ratos fêmeas ou machos de 10 a 14 semanas. Doadores e receptores foram aproximadamente compatíveis com o peso.
- Realize a anestesia do rato receptor usando também inalação de isoflurano (indução a 5% e manutenção a 1,5-2% com fluxo De2 de 1 L/min). Injete 5 mg de Carprofen subcutâneamente por kg de peso corporal para analgesia perioperatória e verifique a ausência do reflexo de abstinência do dedo do pé.
- Aplique lubrificante ocular, remova a pele abdominal, fixe os membros e esterilize a pele de forma análoga à preparação do doador. Para o desfecho pós-operatório ideal, realize a operação em um ata de aquecimento para evitar hipotermia intraoperatória.
- Após a incisão longitudinal da pele, aplique um anestésico local, como lidocaína (0,2%), na fáscia abdominal. Abra a cavidade abdominal por laparotomia mediana e insira retráteis.
- Mobilize o intestino para o lado superior esquerdo do receptor e coloque-o em uma compressa quente e úmida.
- Após a mobilização do duodeno e do jejunpromal, respectivamente, utilizando o microscópio cirúrgico (ou óculos de ampliação) com uma ampliação de 5-7x, exponha a aorta abdominal e a veia cava inferior por preparação contundente com cotonetes. Não separe os vasos abdominais.
- Eleve os vasos abdominais usando dois micro porta-agulhas sem ferir as veias lombares e posicione o grampo vascular Cooley(Figura 4A).
- Perfure os vasos abdominais com uma cânula arqueada de 30-45° 27 G(Figura 4B).
- Amplie o local da punção usando uma tesoura potts para criar uma incisão longitudinal que corresponda ao tamanho do lúmen dos vasos doadores (Figura 4C-D) e perfundir os vasos receptores com solução salina, a fim de remover coágulos e prevenir trombose pós-operatória.
- Coloque o enxerto no situs e fixar a aorta ascendente do doador à aorta abdominal receptora por dois pontos simples interrompidos (8-0 sutura não ressorável de monofilamento) no canto cranial e caudal da incisão longitudinal(Figura 4E).
- Anastomose a aorta ascendente do doador com a aorta abdominal do receptor por um 8-0 correndo sutura de monofilamento em duas etapas: primeiro, coloque o enxerto à direita dos vasos receptores e realize a primeira metade da anastomose(Figura 4E). Posteriormente, coloque o enxerto à esquerda dos vasos receptores e realize a segunda metade da anastomose (Figura 4F).
- Fixar a artéria pulmonar doadora à veia cava inferior análogaà à anastomose aortal (8-0 sutura não ressorável de monofilamento). Sutura a primeira metade da anastomose venosa do lado intraluminal do vaso(Figura 4G-H).
- Lave as anastomas com soro estona diretamente antes de apertar os nós para evitar embolia periférica.
- Coloque uma gaze hemosática ao redor de ambas as anastomoses e libere cuidadosamente o grampo vascular Cooley para que a reperfusão do enxerto possa começar. Manuseie o sangramento ao longo das anastomas por compressão leve com cotonetes esterilizados.
NOTA: O enxerto deve começar a bater depois de cerca de 60 s. - Substitua o intestino em uma forma como a do nameia. Certifique-se de que não há malrotaçãos do radix mesentérico para evitar necrose intestinal ou obstrução mecânica.
- Feche os músculos abdominais/fáscia e a pele separadamente usando suturas contínuas de polifilamento 3-0.
3. Cuidados pós-operatórios
- Para analgesia pós-operatória, forneça aos receptores uma injeção subcutânea adicional de 5 mg de Carprofen por kg de peso corporal no primeiro dia pós-operatório (POD). Além disso, adicione 1 g de Metamizol a 500 mL de água potável até o terceiro POD.
- Comece a monitorar a função do enxerto cardíaco por palpação abdominal diária no terceiro POD.
NOTA: Em caso de falha do enxerto antes do terceiro POD, deve-se considerar uma falha cirúrgica e não imunológica. No entanto, isso depende, naturalmente, da combinação de cepas escolhida e do respectivo modelo imunológico (por exemplo, rejeição hiperaguda após a imunização prévia). - Após a rejeição do enxerto, extraia tecidos como os linfonodos retroperitoneal drenantes cranianos cranianos do anastomoses, do baço, do sangue, do timo e do enxerto para análises imunológicas posteriores através de citometria de fluxo ou imunohistoquímica.
4. Digestão enzimática do coração e injeção subcutânea de células cardíacas no ouvido
- Realizar explantação cardíaca e perfusão de forma análoga ao transplante de coração heterotópico (ver passo 1).
- Triture o coração em blocos de 3 mm x 3 mm usando um bisturi estéril ou uma tesoura estéril e incuba-o por 30 min a 37 °C em meio de cultura contendo 0,5 mg/mL colagenase.
NOTA: É importante usar meio de cultura contendo penicilina, estreptomicina e glutamina sem soro fetal (FCS) particularmente porque a FCS inibe a digestão da colagemnase. - Adicione o tecido digerido a uma peneira de grande porte, enquanto remove o meio de cultura e pica-fogo completamente para obter uma suspensão de células cardíacas vitais, principalmente células cardíacas mortas e células sanguíneas remanescentes. Lave a suspensão celular duas vezes com solução salina isotônica estéril.
NOTA: Configurações de centrifugação: 10 min, 200 x g, 20 °C - Filtrar a suspensão usando um filtro de células de 40 μm e coletar as congeries celulares vitais, lavando o coador celular com 5-10 mL de solução salina isotônica.
- Após a centrifugação, resuspenda as células musculares cardíacas em solução salina dissolvida em uma concentração de 5x105 células/mL e desenhe a solução celular em uma seringa de 1 mL.
- Realizar anestesia análoga ao protocolo descrito para a narcose receptora (ver passo 2) para transplante de coração heterotópico.
- Coloque o receptor em posição lateral e fixe a orelha com um dedo usando fita dupla face(Figura 5A).
- Injete 20 μL da solução celular muscular cardíaca (contendo 1 x 104 células) através de uma cânula de 27 G s.c. perto dos vasos capilares visuais no ouvido do receptor(Figura 5B).
- Após um período de observação definido (dependendo da combinação de tensão escolhida e força da rejeição), extraia os linfonodos cervicais drenantes e realize análises adicionais, como citometria de fluxo ou co-culturas(Figura 5C).
NOTA: Além disso, a análise histológica da pinna pode ser realizada para determinar a infiltração celular.
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Representative Results
No passado, diferentes questões imunológicas foram abordadas com base no modelo, que foi validado no grupo de trabalho por mais de 500 transplantes com uma taxa de sobrevivência superior a 95%13,18,19,20,21,22,23,24. O tempo total de funcionamento (incluindo explantio e implantação de enxerto) geralmente não excedia 60 minutos, enquanto os tempos combinados de isquemia fria e quente eram em torno de 30 minutos. As combinações de tensão aplicadas foram baseadas principalmente no fundo de Lewis (Lew). Os transplantes singênicos sobreviveram até 100 dias sem sinais de falha no enxerto, mas redução significativa de peso e tamanho após a explantação do enxerto. Mais recentemente, realizamos transplante de coração heterotópico em duas combinações diferentes de doadores-receptores simulando um modelo de rejeição rápida e prolongada: Lew.1a → Lew wt levando à rejeição rápida (tempo médio de sobrevivência de 7,4 dias) e Lew.1u-7B→ Lew.1a levando a uma rejeição mais prolongada (tempo médio de sobrevivência de 42,5 dias) (Figura 6). Macroscopicamente, os enxertos rejeitados apresentaram trombose acompanhada de uma descoloração lívida e inchaço, enquanto enxertos não rejeitados apresentam atrofia distinta, provavelmente como consequência de um ventrículo esquerdo descarregado. Além disso, elaboramos seções criotatos de corações transplantados a fim de detectar infiltração celular usando um método de coloração alcalino-fosfatase-antialcalina (APAAP). Quadros únicos com ampliação de 50x foram fundidos a uma imagem composta, dando uma visão geral do enxerto completo e da distribuição de células infiltradas. A análise histológica mostrou uma infiltração aumentada de células imunes (por exemplo, CD4+, TCR+, ou NKR-P1A/B+) nos enxertos alogênicos, enquanto os enxertos singênicos estavam em grande parte livres de infiltração celular(Figura 7A-C).
Os ensaios de linfanectomia cervical e reestimulação de células de linfonodos drenantes após a injeção de orelha de células musculares cardíacas nas combinações de tensão acima mencionadas revelaram respostas imunes distintas específicas da tensão em relação ao tecido cardíaco alogênico e permitiram análises imunológicas adicionais, como o perfil da citocina(Figura 8A-C).
Figura 1: Apresentação esquemática das anastomoses de ponta a ponta e do fluxo sanguíneo resultante através do coração. Após aanastomos o doador ascendente aador a lado para a aorta abdominal receptora e, analogamente, a artéria pulmonar para o receptor vena cava inferior(A),o fluxo sanguíneo entra nas artérias coronárias através da aorta ascendente. A drenagem venosa ocorre através do sinus coronarius no átrio direito e ventrículo e através da artéria pulmonar na veia cava inferior receptora (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Instrumentos cirúrgicos e materiais necessários. (A) Explantation: 1: banda de membro elástico, 2: retráteis, 3: 5-0 ligadura, 4: tesoura pontiaguda da sonda, 5-6: micro agulhas, 7: tesoura, 8: fórceps cirúrgicos, 9: fórceps micro, 10: lubrificante ocular, 11: compressas, 12: cotonetes de algodão, 13: base de perfusão, 14: solução salina no gelo. (B) Implantação: 1: banda de membro elástico, 2: retráteis, 5-6: micro porta-agulhas, 7: tesoura, 8: fórceps, 9: fórceps, 10: lubrificante para os olhos, 11: compressas, 12: cotonetes de algodão, 15: micro tesouras, 16: fórceps, 17: Tesoura potts, 18: porta-agulhas, 19: cânula arqueada, 20: Grampo de fricção suturas de monofilamento, 22: gaze hematética, 23: 3-0 suturas polifilamentos, 24: placa de Petri, 25: Carprofen (5 mg/mL), 26: anestésico local (lidocaína 0,2%), 27: solução salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Explantação do coração. Após a heparinização(A), atoracotomia é realizada e a aorta ascendente e artéria pulmonar são cortadas o mais distal possível(B). Com uma única ligadura pulmonar e ambas as veias de caval são ocluídas(C) e o coração é removido da cavidade torácica(D). (E) mostra o coração antes e(F) após a perfusão com solução salina de 30 mL contendo heparina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Implantação cardíaca. Após a exposição de vasos abdominais e colocação de um grampo vascular Cooley(A)os vasos são cannulados (B) e uma incisão longitudinal é realizada usando uma tesoura potts(C-D). A aorta ascendente do doador é fixada com um nó cada no canto cranial e caudal da incisão da aorta abdominal receptora(E) e a anastomose é realizada por suturas contínuas(E-F). Observe que o enxerto é colocado no lado direito dos vasos durante a primeira metade da anastomose (E) e no lado esquerdo dos vasos para a segunda metade da anastomose(F)e a anastomose venosa subseqüente. A primeira metade da anastomose venosa é realizada por uma sutura intraluminal(G). Depois de terminar a segunda metade da anastomose venosa, o enxerto está pronto para reperfusão (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Injeção in-ear de células cardíacas alogênicas. Depois de fixar a orelha do receptor em um dedo usando fita dupla face(A)as células cardíacas vitais alogênicas são injetadas subcutâneamente perto de vasos capilares visuais(B). Após um período de observação, são extraídos linfonodos cervicais(*)(C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Sobrevivência cardíaca em diferentes combinações singênicas e alogênicas de doadores-receptores. A análise de Kaplan-Meier mostra a sobrevivência de enxertos singênicos (n=10 de rejeição rápida; n=5 modelo de rejeição prolongada) e enxertos alogênicos (n=11 modelo de rejeição rápida; n=14 modelo de rejeição prolongada). No modelo de rejeição prolongada, seis dos 14 beneficiários chegaram ao final do período de observação (60 dias) sem falha no enxerto, levando a uma sobrevida prolongada do enxerto neste grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise histológica de enxertos cardíacos singênicos e alogênicos. (A-B) mostram a infiltração de células CD4+ utilizando o método de coloração APAAP em enxerto singênico(A)e enxerto alogênico após a rejeição(B). (C) apresenta o aumento da infiltração celular em enxertos alogênicos quando comparado syngenic enxertos (servindo como grupo de referência) para diferentes subconjuntos de células imunes. A classificação aplicada para quantificar a infiltração celular foi modificada a partir de Hirschburger et al.25: 0 = infiltração comparável aos enxertos singênicos; 0,5 = ligeiro aumento das células manchadas em seções de tecidos isolados; 1 = aumento das células manchadas singulares sobre toda a seção tecidual; 1,5 = aumento de aglomerados de células manchadas distribuídos uniformemente por toda a seção tecidual; 2 = forte; 2,5 = muito forte; 3 = aumento mais forte de aglomerados de células manchadas em toda a seção tecidual. As seções histológicas dos enxertos foram analisadas por uma ampliação de 50x. Cinco enxertos por grupo (singênicos e alogênicos, respectivamente) foram incluídos na análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise das células de linfonodos drenantes após a injeção in-ear de células cardíacas alogênicas. Reestimulação específica (com 2 x 105 esplenocitos da respectiva cepa de doadores) de 2 x 105 linfócitos colhidos de linfonodos cervicais ou mesentéricos drenantes (LN) de rejeição rápida lew wt e prolongamento rejeitar os receptores lew.1a apresentaram significativamente redução da proliferação de células de linfonodos drenantes em receptores lew.1a(A),enquanto a capacidade proliferativa em geral ainda era observável após estimulação inespecífica com anticorpo CD3/CD28(B). Surpreendentemente, o perfil da citocina revelou um aumento de citocinas inflamatórias nos linfonodos de receptores rejeitados prolongados(C). Os resultados são apresentados como média ± SEM de pelo menos 4 animais por grupo. A significância é indicada com * para valores p ≤ 0,05 e **** para valores p ≤ 0,0001. (Este número foi modificado de Beetz et al.24). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método anteriormente descrito de transplante cardíaco heterotópico em ratos baseia-se principalmente na descrição de Ono e Lindsey em 19693. Desde então, várias modificações foram introduzidas em várias espécies levando a uma ampla diversidade deste modelo. Combinando várias dessas modificações e introduzindo nossa própria experiência resultante de mais de 30 anos realizando transplantes de coração heterotópicos em laboratório, criamos uma abordagem cirúrgica viável, que não requer longos períodos de treinamento ou antecedentes cirúrgicos. A seguir, discutiremos as limitações gerais deste modelo e sublinharemos as etapas críticas do protocolo. Além disso, enfatizaremos os benefícios da combinação do transplante de coração heterotópico com um novo método de injeção intra-auricular de células musculares cardíacas.
Anestesia e complicações gerais
Embora tenha sido relatado que a anestesia isoflurana é superior à anestesia por injeção em relação à sobrevivência precoce após transplante de coração heterotópico, a depressão respiratória intraoperatória ainda representa uma das complicações mais comuns e, portanto, requer um cuidadoso manejo da narcose26. Em vez de explantio e implantação de enxerto em série, respectivamente, aconselhamos iniciar a preparação do receptor e dos vasos abdominais imediatamente após a toracotomia do animal doador, particularmente porque os tempos de operação de menos de uma hora estão associados a um melhor resultado em relação ao enxerto e à sobrevivência do receptor26,27. Além de complicações já mencionadas, como hipotermia devido aos longos tempos de funcionamento e falta de ata de aquecimento, e necrose intestinal ou obstrução por colocação imfisida do intestino, uma paresia de membros dificultadores representa uma complicação adicional, que pode ser prevenida por aperto vascular atraumático e lavagem completa das anastomoses para evitar embolia periférica28,29.
Ligadura de veias pulmonares e cavalegos e complicações sangrentas
A fim de reduzir o tempo de isquemia quente, usamos uma única ligadura para caval e todas as quatro veias pulmonares. Como uma possível complicação resultante de uma colocação muito proximal/ventral da ligadura, deve-se mencionar a interrupção do backflow venoso por oclusão do sinus coronarius. Em caso de hemorragia grave após a remoção do grampo Cooley e da batida visível do enxerto, a ligadura deve ser verificada imediatamente por insuficiência. Observamos esse tipo de complicação especialmente se a dissecção das veias pulmonares foi realizada muito perto da ligadura enquanto retirava o enxerto da cavidade torácica. Caso contrário, a hemorragia grave é causada principalmente pela insuficiência das anastomoses vasculares. Além disso, uma artéria coronária que corre ao longo da aorta ascendente que é frequentemente cortada durante a explantação é descrita como causa de hemorragia letal após a reperfusão27.
Tempo de isquemia e perfusão
Independentemente do modelo de transplante, é sempre indispensável reduzir o tempo de isquemia, especialmente porque o coração é considerado como um órgão vulnerável em relação aos danos à isquemia. Ao realizar a cirurgia com dois cirurgiões, somos capazes de atingir um tempo isquêmico mínimo quente e frio e, portanto, renunciar ao uso de soluções cardioplégicas a fim de reduzir os danos de isquemia-reperfusão30. Geralmente, a perfusão do enxerto desempenha um papel fundamental e é essencial para resfriar o enxerto e remover as células sanguíneas, o que pode resultar em trombose ou embolia. Considerando que as baixas pressões de perfusão levam à perfusão insuficiente e, portanto, a uma remoção incompleta das células sanguíneas, altas pressões de perfusão podem causar danos endoteliais31,32. Aconselhamos a perfusão da artéria pulmonal, bem como da aorta ascendente até que as artérias coronárias estejam visivelmente liberadas.
Incisão de vasos receptores
Um passo crítico no protocolo constitui a incisão dos vasos receptores sem causar danos à parede posterior dos vasos: Schmid et al. descreveram o benefício da aortotomia ou venotomia realizando uma pequena incisão transversal seguida de alargamento longitudinal na direção craniana e caudal, o que leva ainda a uma diminuição da taxa de estenose da anastomose aortal33. Em nosso modelo, os vasos receptores são perfurados usando uma pequena cânula. Posteriormente, o local da punção é ampliado usando uma tesoura potts para criar uma incisão longitudinal. Para uma melhor viabilidade, recomendamos dobrar a ponta da cânula para um ângulo de 30-45° levando a um risco reduzido de danificar a parede posterior dos vasos. Não observamos estenoses vasculares clinicamente relevantes em nenhum de nossos receptores. Benefícios similares da abertura dos vasos receptores ao perfurar a aorta abdominal e a veia cava inferior com uma cânula foram descritos por Shan et al.34.
Dominando o modelo de transplante de coração heterotópico
Durante a última década, o modelo tem sido realizado por pesquisadores do departamento com pouco ou nenhum fundo cirúrgico. Como dito acima, atuamos em pares de cirurgiões, enquanto o pesquisador mais experiente é responsável por garantir o sucesso do transplante e, ao mesmo tempo, melhorar gradualmente o conjunto de habilidades do pesquisador inexperiente. Após um curto período de treinamento de aproximadamente dez explantações de enxerto e implantações em animais mortos, o pesquisador inexperiente é responsável por realizar a explantação cardíaca e auxiliar a implantação do enxerto em aproximadamente dez animais vivos. Posteriormente, o pesquisador inexperiente realiza ativamente as anastomoses vasculares, de modo que após aproximadamente dez novos transplantes, o ex-pesquisador inexperiente é geralmente capaz de realizar todas as etapas críticas do modelo.
Aplicando este conceito de treinamento, publicações passadas do nosso departamento utilizando transplante de coração heterotópico em ratos não mostraram diferenças em relação à morbidade, mortalidade ou função de enxerto, apesar de várias equipes diferentes de cirurgiões13,18,19,20,21,22,23,24.
Note-se que a realização das anastomoses vasculares representa o passo mais crítico neste protocolo e modelos de transplante de órgãos sólidos em geral. Por isso, recomendamos períodos de treinamento prolongados usando animais mortos até que os anastomoses sejam realizados de forma precisa e rápida, especialmente se um pesquisador experiente não estiver disponível para orientação em animais vivos.
Vantagens gerais e desvantagens do modelo
Considerando que a indução de tolerância espontânea é frequentemente descrita como um fenômeno no transplante hepático e também observada no transplante renal, o coração é considerado como um órgão bastante imunogênico e, portanto, permite uma rejeição confiável nos modelos de transplante35,36. Ao contrário desses achados, também podemos notar a sobrevivência a longo prazo e a ausência de rejeição após o transplante de coração heterotópico em certas combinações doador-receptor, apesar da completa disparidade complexa de histocompatibilidade.
Uma crítica frequentemente mencionada ao transplante de coração heterotópico é a subjetividade do monitoramento do enxerto por palpação manual. Assim, o modelo foi estendido às técnicas de anastomose femoral, a fim de facilitar o acesso à palpação e introduzir técnicas de monitoramento adicionais, como a ecocardiografia transfemoral15,16. Por outro lado, Mottram et al. demonstraram que o monitoramento do enxerto via palpação correlaciona-se bem com as medidas eletrocardiográficas37. Assim, a palpação manual em transplantes cardíacos heterotópicos parece suficiente para monitorar a função do enxerto em um modelo de rejeição aguda.
Como conseqüência da colocação heterotópica e descarga ventricular esquerda, o coração não funciona sob condições anatômicas ou fisiológicas assumindo que isso não impacta as análises imunológicas. Contrariamente a esta suposição, foi demonstrado que a remodelagem cardíaca resultante do descarregamento ventricular esquerdo durante a terapia do dispositivo de assistência ventricular esquerda leva a uma diminuição da liberação de citocinas38,39. Por outro lado, Tang-Quan et al. descreveram o ajuste descarregado como uma abordagem mais adequada para a análise imunológica, uma vez que foram observados danos isquêmicos de longo prazo do enxerto resultantes de perfusão com sangue parcialmente desoxigenado no modelo carregado ventricular esquerdo40.
Embora a colocação abdominal dos enxertos ofereça benefícios cirúrgicos em termos de praticidade, é difícil colher números suficientes de linfonodos retroperitoneal drenantes após a rejeição do enxerto prejudicando novas análises. Por essa razão, introduzimos um novo método de injeção intra-auricular de células cardíacas alogênicas. Originário de pesquisas parasitológicas, esse conceito não tem sido aplicado para análises imunológicas em transplantes, apesar de sua viabilidade41,42. A vantagem desse modelo é a possibilidade de identificar e colher um número significativo de linfonodos drenantes, o que oferece a possibilidade de realizar análises imunológicas complexas. Note-se que ambos os modelos poderiam ser combinados em um receptor oferecendo mais insights sobre os mecanismos de rejeição e tolerância no transplante celular e de órgãos em ratos.
Nossos modelos de transplante de células cardíacas e cardíacas de coração de rato representam uma abordagem praticável e bem estudada e podem ser realizados sem treinamento cirúrgico ou antecedentes. Diante do fato de que novas tecnologias de clonagem para ratos foram introduzidas e desenvolvidas recentemente, esses modelos oferecem vastas oportunidades para pesquisadores imunológicos transplantados.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Queremos agradecer a Britta Trautewig, Corinna Löbbert e Ingrid Meder pelo comprometimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
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