Summary
Vi beskriver en modell av heterotopic buken hjärtat transplantation hos råttor, vilket innebär ändringar av nuvarande strategier, vilket leder till en förenklad kirurgisk strategi. Dessutom beskriver vi en ny avstötningsmodell genom in-ear injektion av vitala hjärt muskelceller, vilket möjliggör ytterligare transplantation immunologiska analyser hos råttor.
Abstract
Heterotopic hjärta transplantation hos råttor har varit en vanligen använd modell för olika immunologiska studier i mer än 50 år. Flera ändringar har rapporterats sedan den första beskrivningen 1964. Efter 30 års utförande heterotopic hjärta transplantation hos råttor, har vi utvecklat en förenklad kirurgisk metod, som lätt kan läras ut och utföras utan ytterligare kirurgisk utbildning eller bakgrund.
Efter dissekering av stigande stora kroppspulsådern och pulmonell gatan och ligering av överlägsen och sämre kavall och pulmonell vener, är givaren hjärtat skördas och därefter perfused med iskall saltlösning kompletteras med heparin. Efter fastspänning och incising mottagaren buken fartyg, givaren stigande stora kroppspulsådern och pulmonell gatan anastomosed till mottagaren buken stora kroppspulsådern och sämre vena cava, respektive med hjälp av kontinuerliga rinnande suturer.
Beroende på olika kombinationer av givare och mottagare tillåter denna modell analyser av antingen akut eller kronisk avstötning av allografts. Den immunologiska betydelsen av denna modell förstärks ytterligare av en ny metod för in-ear injektion av vitala hjärt muskelceller och efterföljande analys av dränering massundersökning lymfvävnad.
Introduction
Heterotopic hjärta transplantation är en ofta använd experimentell modell för olika undersökningar om transplantation tolerans, akut och kronisk allograft avstötning, ischemi-reperfusion skada, maskin perfusion eller hjärt remomodellering. Bland andra fördelar kan transplantatfunktionen övervakas noninvasively genom palpation och transplantatsvikt leder inte till en vital försämring av mottagaren i motsats till andra organ, såsom njurar eller lever.
I 1964, Abbott et al. ursprungligen beskrivs heterotopic buken hjärtat transplantation hos råttor1. Senare, i 1966, end-to-side teknik för anastomoses beskrevs av Tomita et al.2. Grunden för den modell som för närvarande används rapporterades av Ono och Lindsey 19693. Under de senaste decennierna har flera ändringar publicerats för att skapa olika typer av lossade, delvis lastade eller laddade vänster Ventrikulära hjärttransplantat inklusive kombinerade heterotopic hjärt-lungtransplantation4,5,6. För immunologiska analyser utförs oftast en icke-volymladdad hjärttransplantat transplantation. I detta fall går blodflödet bakåtsträvande in i givaren stigande stora kroppspulsådern och därefter kranskärlen. Den venösa dräneringen sker längs koronar sinus i höger atrium och ventrikel (Figur 1A-B). Därför är den vänstra ventrikeln utesluten från blodflödet, bortsett från marginella mängder blod från Thebesian vener. Detta gör det också en användbar modell för att studera patofysiologiska mekanismer under vänster Ventrikulärt bistå enhet terapi7.
Heterotopic hjärta transplantation har utförts i olika arter, inklusive möss, kaniner, grisar och har även använts som en uni- eller biventricular hjälpa enhet hos människor8,9,10,11. Råttan representerar fortfarande ett populärt experimentellt djur för transplantationsmodeller, särskilt eftersom transplantatets överlevnadstider för olika råttastamkombinationer har definierats väl i det förflutna och ett stort antal immunologiska reagenser är tillgängliga12,13. Till skillnad från möss, råttor är större gör kirurgi och tillgång till lymfvävnad för immunologiska analyser mer genomförbart12. Dessutom kommer införandet av kommersiell kloningsteknik hos råttor under de senaste åren sannolikt att leda till ett återkommande intresse för experimentella råttamodeller14.
I allmänhet kan heterotopic hjärtat ympkvistar fästas på mottagarfartyg antingen genom att utföra livmoderhalscancer eller buken anastomosis. Några studier tyder dock på att en femoral annastomos underlättar förbättrad övervakning på grund av bättre tillgång till manuell palpation eller transfemoral ekokardiografi och därmed möjliggör en mer exakt upptäckt av transplantat misslyckande15,16.
Det har visat sig att det inte finns någon skillnad när det gäller drifttid, komplikationshastighet, utfall och transplantatöverlevnadstid mellan båda annakosteknikerna17. Det är uppenbart att tillgången på ett tillräckligt antal dränerande lymfkörtlar måste nämnas som en fördel med cervikal anestomos. Det krävs dock längre utbildningsperioder. Däremot är buken anastomosis mindre komplicerat och lika värdefullt för immunologiska undersökningar, särskilt i kombination med resultat från en ny metod för in-ear injektion av allogena hjärt muskelceller och efterföljande massundersökning lymfadenectomy. En kombination av båda modellerna erbjuder ett brett spektrum av immunologiska analyser efter interventionella.
Följande protokoll avser drift i par kirurger för att minska ischemi tid. Alla experiment kan dock utföras av en enda person. Installationen av instrument och material för hjärta explantation och implantation visas i figur 2A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurerfarenheter har utförts i enlighet med riktlinjerna från de regionala myndigheternas lokala etiknämnd för konsumentskydd och livsmedelssäkerhet (LAVES, Oldenburg, Tyskland) med godkännande-ID 12/0768 och 17/2472.
1. Hjärta explantation och perfusion
OBS: Som transplantatdonatorer användes honråttor eller hanråttor vid en ålder av 7-22 veckor.
- Söva givarens råtta genom isofluraninandning (induktion vid 5% och underhåll vid 3% med ett O2-flöde på 1 L/min). Injicera 5 mg Carprofen subkutant per kg kroppsvikt för perioperativ analgesi och kontrollera att det inte finns någon tillbakadragande reflex.
- Applicera ögonsmörjmedel och ta bort buk- och bröstpälsen med hjälp av en mekanisk klippare.
- Placera givaren i ryggläge, fixera lemmarna vid basen av operationsbordet med elastiska band och sterilisera huden med 70% etanol eller annat tillräckligt alternativ.
- Incise huden i longitudinell riktning och efter applicering av lokalbedövning (t.ex. lidokain 0,2%) utföra en median laparotomy med hjälp av sax.
- Sätt upprullningsdon, mobilisera tarmen till vänster om givaren och exponera sämre vena cava med steriliserade bomullspinne.
- För antikoagulation, injicera 500 I.U. av heparin upplöst i 1 ml iskalla isoton saltlösning intravenöst genom att punktera sämre vena cava. Stoppa blödningen vid punkteringsstället genom ljuskompression med en bomullspinne efter att nålen har dragits tillbaka (figur 3A).
- Incise membranet och utföra laterala thoracotomy till båda sidor av givaren.
- Fäst bröstkorgens mobiliserade ventrala vägg på operationsbordet.
- Ta bort hjärtsäcken och vagalnerven genom trubbigt preparat med hjälp av två mikronålshållare.
- Utför transsektion av bukkärl för att exsanguinate givaren och lossa hjärtat.
- Sätt in den trubbiga grenen av en sond spetsig sax i den tvärgående perikardvätskans bihålehåla och separera den stigande aorta- och lungartären så distal som möjligt under lätt caudal dragkraft i hjärtat med en fuktad kompress (figur 3B).
- Placera en enda 5-0 ligatur runt den överlägsna och sämre vena cava och lungvenerna och dra åt den så dorsal som möjligt (figur 3C).
- Klipp vävnadsdrarna till ligaturen och extrahera hjärtat (figur 3D).
- Dränka det explanterade hjärtat med en 18 G kanyl från en intravenös kateter genom den stigande aorta och lungartären med 30 ml iskall, isotonsaltlösning kompletterad med 1000 I.U. av heparin och placera hjärtat i ett 15 ml-rör fyllt med saltlösning på is (Figur 3E-F).
2. Hjärta implantation
OBS: Som mottagare användes 10-14 veckor gamla hon- eller hanråttor. Givare och mottagare var ungefär vikt matchade.
- Utför anestesi av mottagarråttan genom att även använda isofluraninanding (induktion vid 5% och underhåll vid 1,5-2% med ett O2-flöde på 1 L/min). Injicera 5 mg Carprofen subkutant per kg kroppsvikt för perioperativ analgesi och kontrollera att det inte finns någon tillbakadragande reflex.
- Applicera ögonsmörjmedel, ta bort bukpälsen, fixa lemmarna och sterilisera huden analogt med givarpreparatet. För optimalt postoperativt resultat, utför operationen på en värmematta för att förhindra intraoperativ hypotermi.
- Efter longitudinella snitt i huden, applicera ett lokalbedövningsmedel, såsom lidokain (0,2%), på bukfascia. Öppna bukhålan med median laparotomy och skär upprullningsdon.
- Mobilisera tarmen till den övre vänstra sidan av mottagaren och placera den i en varm, fuktad kompress.
- Efter att ha mobiliserat tolvfingertarmen och proximala jejunum, respektive, med hjälp av kirurgiska mikroskop (eller förstoringsglas) med en 5-7x förstoring, exponera bukaorta och sämre vena cava genom trubbigpreparat med bomullspinnar. Separera inte bukkärlen.
- Höj bukkärlen med två mikronålshållare utan att skada ländryggen och placera Cooleys kärlklämma (figur 4A).
- Punktera bukkärlen med en 30-45° välvd 27 G kanyl (figur 4B).
- Förstora punkteringsstället med hjälp av Potts sax för att skapa ett längsgående snitt som matchar storleken på givarkärlens lumen (figur 4C-D) och granska mottagarkärlen med saltlösning för att avlägsna blodproppar och förhindra postoperativ trombos.
- Placera transplantatet i sitten och fixera givaren stigande aorta till mottagaren bukaorta med två enkla avbrutna stygn (8-0 monofilament icke-resorberbar sutur) i det räftala och caudal hörnet av det längsgående snittet (figur 4E).
- Anstomose den stigande stora kroppspulsåder av givaren med bukaorta av mottagaren med en löpande 8-0 monofilament sutur i två steg: för det första, placera transplantatet till höger om de mottagande fartygen och utföra den första halvan av analusen (figur 4E). Placera därefter transplantatet till vänster om mottagarkärlen och utför den andra halvan av annasomosen (figur 4F).
- Fixera givarens lungartär med den sämre vena cava analogt med aortala annastomosis (8-0 icke-resorberbar sutur). Sutur den första halvan av venös annastomosis från intraluminal sidan av fartyget (Figur 4G-H).
- Spola anastomoserna med saltlösning direkt innan du drar åt knutarna för att förhindra perifer emboli.
- Placera en hemostatisk gasväv runt båda anastomoserna och släpp försiktigt Cooley vaskulär klämma så att reperfusion av transplantatet kan börja. Hantera blödning längs anastomoserna genom ljuskompression med steriliserade bomullspinne.
OBS: Transplantatet ska börja slå efter cirka 60 s. - Byt ut tarmen på ett meander som mode. Se till att det inte finns några malrotationer av den mesenteriala radix för att förhindra tarmnekros eller mekanisk obstruktion.
- Stäng magmusklerna/fascia och huden separat med kontinuerliga 3-0 polyfilament kör suturer.
3. Postoperativ vård
- För postoperativ analgesi, förse mottagarna med en ytterligare subkutan injektion på 5 mg Carprofen per kg kroppsvikt på den första postoperativa dagen (POD). Dessutom, tillsätt 1 g Metamizol till 500 ml dricksvatten tills den tredje POD.
- Börja övervaka hjärttransplantatfunktionen genom daglig bukpkreditering på den tredje POD.
OBS: Vid transplantat misslyckande före den tredje POD, bör en kirurgisk snarare än en immunologisk misslyckande övervägas. Detta beror dock naturligtvis på den valda stamkombinationen och respektive immunologiska modell (t.ex. hyperakut avslag efter prioriterad immunisering). - Efter transplantat avstötning, extrakt vävnader som dränering retroperitoneal lymfkörtlar hjärnskålen av anastomoses, mjälte, blod, bräss och transplantatet för ytterligare immunologiska analyser via flöde cytometri eller immunohistochemistry.
4. Enzymatisk matsmältning av hjärtat och subkutan injektion av hjärtceller i örat
- Utför hjärtexplantation och perfusion analogt med heterotopic hjärttransplantation (se steg 1).
- Strimla hjärtat i 3 mm x 3 mm block med en steril skalpell eller steril sax och inkubera det i 30 min vid 37 °C i odlingsmedium som innehåller 0,5 mg/ml kollagenas.
OBS: Det är viktigt att använda odlingsmedium som innehåller penicillin, streptomycin och glutamin utan fetala kalv serum (FCS) särskilt som FCS hämmar kollagenas matsmältningen. - Tillsätt den smälta vävnaden till en stor-pored sikt, samtidigt ta bort odlingsmediet och färs ordentligt för att få en suspension av vitala hjärtmuskelceller, mestadels döda enstaka hjärtceller och återstående blodkroppar. Tvätta cellfjädringen två gånger med steril isotonisk saltlösning.
Obs: Centrifugeringsinställningar: 10 min, 200 x g, 20 °C - Filtrera suspensionen med en 40 μm cellsil och samla upp de vitala cell congeriesna genom att spola cellsilen med 5-10 ml isotonisk koksaltlösning.
- Efter centrifugering, återsuspend hjärtmuskelceller i saltlösning upplöst vid en koncentration av 5x105 celler/ml och dra celllösningen upp i en 1 ml spruta.
- Utför anestesi analogt med det protokoll som beskrivs för mottagarens narkos (se steg 2) för heterotopic hjärttransplantation.
- Placera mottagaren i ett sidoläge och fixera örat med ett finger med dubbelhänta tejp (bild 5A).
- Injicera 20 μL av hjärtmuskelcelllösningen (innehållande 1 x 104 celler) via en 27 G kanyl s.c. nära de visuella kapillärkärlen i mottagarens öra (figur 5B).
- Efter en definierad observationsperiod (beroende på den valda stamkombinationen och styrkan hos avstötningen), extrahera de dränerande lymfkörtlarna i livmoderhalscancer och utföra ytterligare analyser såsom flödescytometri eller samkulturer (figur 5C).
OBS: Dessutom kan histologisk analys av pinna utföras för att bestämma cellinfiltration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidigare har olika immunologiska frågor behandlats på grundval av modellen, som validerades i arbetsgruppen av mer än 500 transplantationer med en överlevnad på mer än 95%13,18,19,20,21,22,23,24. Totala drifttider (inklusive transplantatexplantation och implantation) vanligtvis inte överstiger 60 minuter, medan kombinerade kalla och varma ischemi gånger var cirka 30 minuter. Stamkombinationerna baserades huvudsakligen på Lewis (Lew) bakgrund. Syngena transplantationer överlevde upp till 100 dagar utan tecken på transplantat misslyckande, men betydande vikt och storlek minskning på moderplanterade explantation. Senast utförde vi heterotopic hjärta transplantation i två olika givare-mottagare kombinationer simulera en snabb och en långvarig avslag modell: Lew.1a → Lew wt leder till snabb avstötning (genomsnittlig överlevnadstid på 7,4 dagar) och Lew.1u-7B → Lew.1a leder till en mer långvarig avslag (genomsnittlig överlevnadstid på 42,5 dagar) (Figur 6). Macroscopically, visade avvisade ympkvistar en trombos tillsammans med en livid missfärgning och svullnad, medan icke-avvisade ympkvistar visar distinkta atrofi, troligen som en följd av en oladdad vänstra ventrikel. Dessutom utarbetade vi kryostat delar av transplanterade hjärtan för att upptäcka cell infiltration med hjälp av en alkalisk fosfatas-antialkalisk fosfatas (APAAP) färgning metod. Enstaka ramar med en 50x förstoring slogs samman till en sammansatt bild, vilket ger en översikt över hela transplantat och fördelningen av infiltrera celler. Histologisk analys visade en ökad infiltration av (t.ex. CD4+, TCR+, eller NKR-P1A/B+) immunceller i allogena ympkvistar, medan syngena transplantat var i stort sett fria från cellinfiltration (figur 7A-C).
Cervikal lymfadenectomy och återstimuleringsanalyser av dränerande lymfkörtelceller efter öroninjektion av hjärtmuskelceller i de ovan nämnda stamkombinationerna visade tydliga stamspecifika immunsvar mot allogen hjärtvävnad och tillät ytterligare immunologiska analyser, såsom cytokinprofilering (figur 8A-C).
Figur 1: Schematisk presentation av end-to-side anastomoses och den resulterande blodflödet genom hjärtat. Efter anastomosing givaren stigande stora kroppspulsådern end-to-side till mottagaren buken stora kroppspulsådern och analogt pulmonell artär till mottagaren sämre vena cava (A), blodflödet kommer in i kranskärlen via stigande stora kroppspulsådern. Den venösa dränering sker via sinus coronarius i höger atrium och ventrikel och genom lungartären i mottagaren sämre vena cava (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Erforderliga kirurgiska instrument och material. AExplantation: 1: elastiskt lemband. 2: upprullningsdon, 3: 5-0 ligatur, 4: sond spetsig sax, 5-6: mikronålshållare, 7: sax, 8: kirurgiska pincett, 9: mikrotångpinne, 10: ögonsmörjmedel, 11: kompresser, 12: bomullsspinnar, 13: per bas, 14: saltlösning på is. B)Implantation: 1: elastiskt extremband, 2: upprullningsdon, 5-6: mikronålshållare, 7: sax, 8: pincett, 9: mikrotångpinne, 10: ögonsmörjmedel, 11: kompresser, 12: bomullspinne, 15: mikrosax, 16: mikrotångpinne, 17: Potts sax, 18: nålhållare, 19: välvd kanyl, 20: Cooley kärlklämma, 21: 8-00 monofilament suturer, 22: hemostatisk gasväv, 23: 3-0 polyfilament suturer, 24: Petriskål, 25: Carprofen (5 mg/mL), 26: lokalbedövning (lidokain 0,2%), 27: saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Explantation. Efter heparinisering (A), thoracotomy utförs och stigande stora kroppspulsådern och pulmonell artär är avskurna så distala som möjligt (B). Med en enda ligatur pulmonell och båda kaval vener är ockluderas(C) och hjärtat avlägsnas från brösthålan (D). (E)visar hjärtat före och(F)efter perfusion med 30 ml saltlösning som innehåller heparin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Hjärtimplantation. Efter utläggning av bukkärl och placering av en Cooley kärlklämma (A) kanyleras kärlen (B) och ett längsgående snitt utförs med potts sax (C-D). Givaren stigande stora kroppspulsåder är fixerad med en knut vardera vid hjärnskålen och caudal hörnet av snittet av mottagaren buken stora kroppspulsåder (E) och annasomos utförs genom kontinuerligt kör suturer (E-F). Observera att transplantatet placeras på höger sida av kärlen för den första halvan av annasi (E) och på vänster sida av kärlen för andra halvan av annastomos (F) och den efterföljande venösa annasomos. Den första halvan av venös anastomosis utförs av en intraluminal sutur (G). Efter avslutad andra halvan av venös annastomos är transplantatet redo för reperfusion (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Injektion i öronen av allogena hjärtmuskelceller. Efter fastställande av mottagarens öra på ett finger med dubbelsidig tejp (A) injiceras allogena vitala hjärtmuskelceller subkutant nära visuella kapillärkärl (B). Efter en observationsperiod extraheras cervikal lymfkörtlar (*) (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Hjärtats överlevnad i olika syngena och allogena kombinationer av givare och mottagare. Kaplan-Meier analys visar överlevnaden av syngen (n = 10 snabb avstötning modell; n = 5 långvarig avstötning modell) och allogena ympkvistar (n = 11 snabb avstötning modell; n = 14 långvarig avstötning modell). I den långvariga avslag modell sex av 14 mottagare nådde slutet av observationsperioden (60 dagar) utan transplantat misslyckande, vilket leder till en långvarig moderplantor överlevnad i denna grupp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Histologisk analys av syngena och allogena hjärttransplantat. (A-B)visar infiltration av CD4+ celler med APAAP-färgningsmetoden i ett syngent transplantat (A) och ett allogent transplantat vid avstötning (B). (C)presenterar ökningen av cellinfiltration i allogena ympkvistar jämfört med syngena transplantat (som fungerar som referensgrupp) för olika immuncellundergrupper. Klassificeringen tillämpas för att kvantifiera cell infiltration ändrades från Hirschburger et al.25: 0 = infiltration jämförbar med syngena ympkvistar; 0.5 = liten ökning av färgade celler i isolerade vävnadssektioner; 1 = ökning av singular färgade celler över hela vävnaden avsnitt; 1.5 = ökning av färgade cellkluster som är jämnt fördelade över hela vävnadsdelen. 2 = stark; 2.5 = mycket stark; 3 = den starkaste ökningen av färgade cellkluster i hela vävnadsdelen. De histologiska delarna av ympkvistar analyserades med hjälp av en 50x förstoring. Fem ympkvistar per grupp (syngen respektive allogenic) ingick i analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Analys av dränerande lymfkörtelceller efter injektion i örat av allogena hjärtmuskelceller. Specifik återstimulering (med 2 x 105 splenocyter av respektive givarstam) på 2 x 105 lymfocyter som skördats från antingen dränering av livmoderhalscancer eller mesenteriala lymfkörtlar (LN) av snabb avslag lew wt och förlänga avslagit Lew.1a mottagare visade betydligt minskad spridning av dränerande lymfkörtelceller i Lew.1a mottagare(A),medan proliferative kapacitet i allmänhet var fortfarande observerbar efter ospecifik stimulering med CD3/CD28 antikroppar (B). Överraskande, cytokin profilering visade en ökning av inflammatoriska cytokiner i lymfkörtlarna av långvarig avvisa mottagare (C). Resultaten presenteras som medelvärde ± SEM på minst 4 djur per grupp. Signifikans anges med * för p-värden ≤ 0,05 och **** för p-värden ≤ 0,0001. (Denna siffra har ändrats från Beetz et al.24). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den tidigare beskrivna metoden för heterotopic hjärttransplantation hos råttor är huvudsakligen baserad på beskrivningen av Ono och Lindsey 19693. Sedan dess har flera modifieringar införts i olika arter som leder till en stor mångfald av denna modell. Kombinera flera av dessa ändringar och införa vår egen erfarenhet till följd av över 30 år att utföra heterotopic hjärtat transplantationer i laboratoriet, skapade vi en genomförbar kirurgisk strategi, som inte kräver långa träningsperioder eller kirurgisk bakgrund. I det följande kommer vi att diskutera allmänna begränsningar av denna modell och understryka kritiska steg i protokollet. Dessutom kommer vi att betona fördelarna med att kombinera heterotopic hjärta transplantation med en ny metod för in-ear injektion av hjärt muskelceller.
Anestesi och allmänna komplikationer
Även om det har rapporterats att isoflurananestesi är överlägsen injektion anestesi när det gäller tidig överlevnad efter heterotopic hjärttransplantation, intraoperativ andningsdepression representerar fortfarande en av de vanligaste komplikationerna och kräver därför en noggrann narkos hantering26. Istället för seriegrafatmpat explantation och implantation, respektive, rekommenderar vi att påbörja beredningen av mottagaren och bukkärlen omedelbart efter thoracotomy av givaren djuret, särskilt eftersom drifttider på mindre än en timme är förknippade med ett bättre resultat när det gäller transplantat och mottagarens överlevnad26,27. Förutom redan nämnda komplikationer såsom hypotermi på grund av långa driftstider och saknade värmemattor, och intestinal nekros eller obstruktion genom ofysiologisk placering av tarmen, en pares av hinder lemmar utgör en ytterligare komplikation, som kan förhindras genom atraumatisk vaskulär fastspänning och grundlig spolning av anastomoses för att undvika perifer emboli28,29.
Ligatur av lung- och kavalvener och blödningskomplikationer
För att minska varm ischemi tid, använder vi en enda ligatur för både kavall och alla fyra pulmonell vener. Som en möjlig komplikation till följd av en alltför proximala/ventrala placering av ligaturen, måste störningar av venösa backflow genom ocklusion av sinus coronarius nämnas. Vid allvarlig blödning efter avlägsnande av Cooleyklämman och synlig misshandel av transplantatet måste ligaturen kontrolleras omedelbart med efter avlägsnande av Cooleyklämman. Vi observerade denna typ av komplikation särskilt om dissekering av pulmonell vener utfördes för nära ligatur samtidigt ta bort moderplantor från bröst hålighet. Annars orsakas allvarlig blödning främst av insufficiens hos kärlanastomoserna. Dessutom beskrivs en kranskärl som löper längs den stigande stora kroppspulsådern som ofta är avskuren under explantation för att orsaka dödlig blödning vid reperfusion27.
Ischemitid och perfusion
Oavsett transplantationsmodellen är det alltid nödvändigt att minska ischemitiden, särskilt som hjärtat betraktas som ett sårbart organ när det gäller ischemiskador. Genom att utföra kirurgi med två kirurger, vi kan uppnå en minimal varm och kall ischemisk tid och därför avstå från användning av kardioplegiska lösningar för att minska ischemi-reperfusion skador30. Generellt, perfusion av transplantatet spelar en nyckelroll och är viktigt att kyla transplantatet och ta bort blodkroppar, vilket kan resultera i trombos eller emboli. Lågt perfusionstryck leder till otillräcklig perfusion och därmed till ett ofullständigt avlägsnande av blodkroppar, men högt perfusionstryck kan orsaka endotelskador31,32. Vi rekommenderar perfusion av pulmonell gatan samt stigande stora kroppspulsådern tills födans artärer är synligt spolas klart.
Snitt av mottagarfartyg
Ett kritiskt steg i protokollet utgör snittet av de mottagande fartygen utan att orsaka skador på fartygen bakre väggen: Schmid et al. beskrev fördelen med aortotomy eller venotomy utför en liten tvärgående snitt följt av längsgående utvidgningen i kranial och caudal riktning, vilket ytterligare leder till en minskad stenos hastighet av aortal annasomos33. I vår modell punkteras mottagarkärlen med hjälp av en liten kanyl. Därefter förstoras punkteringsstället med hjälp av Potts sax för att skapa ett längsgående snitt. För en bättre genomförbarhet rekommenderar vi att du böjer kanylens spets till en vinkel på 30-45° vilket leder till en minskad risk för att skada kärlens bakre vägg. Vi observerade inte kliniskt relevanta vaskulära stenoses i någon av våra mottagare. Liknande fördelar med att öppna mottagarfartyg genom att punktera bukaorta och sämre vena cava med en kanyl har beskrivits av Shan et al.34.
Mastering modellen för heterotopic hjärttransplantation
Under det senaste årtiondet har modellen utförts av forskare vid institutionen med liten eller ingen kirurgisk bakgrund. Som nämnts ovan arbetar vi i par kirurger, medan den mer erfarna forskaren ansvarar för att garantera framgången för transplantationen och samtidigt för att gradvis förbättra kompetensen hos den oerfarna forskaren. Efter en kort utbildningsperiod på cirka tio transplantatexplantationer och implantationer hos döda djur ansvarar den oerfarna forskaren för att utföra hjärtats explantation och hjälpa ympkvisten implantation hos cirka tio levande djur. Därefter utför den oerfarna forskaren aktivt vaskulära anastomoser, så att efter cirka tio ytterligare transplantationer, den tidigare oerfarna forskaren är vanligtvis kan utföra alla kritiska steg i modellen.
Tillämpa denna utbildning koncept, tidigare publikationer från vår avdelning med heterotopic hjärttransplantation hos råttor visade inga skillnader när det gäller sjuklighet, dödlighet eller transplantat funktion trots flera olika grupper avkirurger 13,18,19,20,21,22,23,24.
Att notera, utför vaskulära anastomoses representerar det mest kritiska steget i detta protokoll och fasta organ transplantation modeller i allmänhet. Vi rekommenderar därför längre utbildningsperioder med döda djur tills anastomoser utförs korrekt och snabbt, särskilt om en erfaren forskare inte är tillgänglig för vägledning hos levande djur.
Allmänna fördelar och nackdelar med modellen
Medan spontan toleransinduktion ofta beskrivs som ett fenomen vid levertransplantation och även observeras vid njurtransplantation, anses hjärtat vara ett ganska immunogent organ och möjliggör därmed tillförlitlig avstötning i transplantationsmodellerna35,36. I motsats till dessa resultat, kunde vi också märker långsiktig överlevnad och avsaknad av avslag efter heterotopic hjärta transplantation i vissa givare-mottagare kombinationer trots fullständig större histocompatibility komplexa skillnader.
En ofta omnämnd kritik av heterotopic hjärtat transplantation är subjektivitet graft övervakning av manuell palpation. Därför har modellen utvidgats till femorala anoromos tekniker för att underlätta tillgången till palpation och införa ytterligare övervakningstekniker såsom transfemoral ekokardiografi15,16. Å andra sidan visade Mottram et al. att övervakningen av transplantatet via palpation korrelerar väl med elektrokardiografiska mätningar37. Således verkar manuell palpation i heterotopic hjärtat transplantationer tillräcklig för övervakning moderplantor funktion i en akut avstötning modell.
Som en följd av heterotopic placering och vänster Ventrikulärt lossning, hjärtat inte fungerar under anatomiska eller fysiologiska förhållanden förutsatt att detta inte påverkar immunologiska analyser. I motsats till detta antagande, det hade visat sig att hjärt remodeling till följd av vänster Ventrikulärt lossning under vänster Ventrikulärt bistå enhet terapi leder till en minskad cytokin release38,39. Å andra sidan beskrev Tang-Quan et al. den olastade inställningen som en lämpligare metod för immunologisk analys, eftersom långsiktiga ischemisk skada av transplantatet till följd av perfusion med delvis deoxygenated blod i den vänstra Ventrikulärt laddade modellen observerades40.
Även buken placering av ympkvistar erbjuder kirurgiska fördelar när det gäller genomförbarhet, är det svårt att skörda tillräckligt många dränering retroperitoneal lymfkörtlar på moderplantor avstötning försämra ytterligare analyser. Av denna anledning introducerade vi en ny metod för in-ear injektion av allogena hjärtmuskelceller. Med ursprung i parasitologisk forskning har detta begrepp inte tillämpats för immunologiska analyser vid transplantation, trots dess genomförbarhet41,42. Fördelen med denna modell är möjligheten att identifiera och skörda ett betydande antal dränerande lymfkörtlar, vilket ger möjlighet att utföra komplexa immunologiska analyser. Observera att båda modellerna skulle kunna kombineras i en mottagare som erbjuder ytterligare insikter i mekanismerna för avstötning och tolerans vid cell- och organtransplantation hos råttor.
Våra modeller av råtthjärta och hjärtmuskelcelltransplantation representerar en praktiskt genomförbar och väl studerad metod och kan utföras utan ytterligare kirurgisk träning eller bakgrund. Inför det faktum att nya kloningstekniker för råttor har införts och utvecklats nyligen, erbjuder dessa modeller stora möjligheter för transplantationsmunologiska forskare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Britta Trautewig, Corinna Löbbert och Ingrid Meder för deras engagemang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia device (including isoflurane vaporizer) | Summit Anesthesia Solutions | No Catalog Number available | |
| Cannula (27 G) | BD Microlance | 302200 | |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl 50 mg/mL | |
| Cellstar Tubes (15 mL) | GreinerBioOne | 188271 | |
| Cell strainer (40 µm) | BD Falcon | 2271680 | |
| Collagenase Type CLSII | Biochrome | C2-22 | |
| Compresses 5x5 cm | Fuhrmann | 31501 | |
| Compresses 7.5x7.5 cm | Fuhrmann | 31505 | |
| Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf | 1032128 | |
| Dexpathenol (5 %) | Bayer | "Bepanthen" | |
| DPBS BioWhittaker | Lonza | 17-512F | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD557R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD313R | |
| Forceps | B. Braun | Aesculap BD35 | |
| Heating mat | Gaymar Industries | "T/Pump" | |
| Hemostatic gauze | Ethicon | Tabotamp | |
| Heparin-Natrium 25 000 I.E. | Ratiopharm | No Catalog Number available | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-pored sieve (stainless steel) | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| Lidocaine | Astra Zeneca | 2 % Xylocain | |
| Metamizol-Natrium | Ratiopharma | Novaminsulfon 500 mg/mL | |
| Micro forceps | B. Braun | Aesculap BD3361 | |
| Micro needle holder | Codman, Johnson & Johnson Medical | Codmann 80-2003 | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap BD336R | |
| Micro needle holder | B. Braun | Aesculap FD241R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FD101R | |
| Micro scissors | B. Braun | Aesculap FM471R | |
| Needle holder | B. Braun | Aesculap BM221R | |
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine (100x) | PAA | P11-010 | |
| Peripheral venous catheter (18 G) | B. Braun | 4268334B | |
| Peripheral venous catheter (22 G) | B. Braun | 4268091B | |
| Probe pointed scissors | B. Braun | Aesculap BC030R | |
| Retractors | Forschungswerkstätten Hannover Medical School | No Catalog Number available | |
| RPMI culture medium | Lonza | BE12-702F | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Baxter | No Catalog Number available | |
| Scissors | B. Braun | Aesculap BC414 | |
| Surgical microscope | Carl-Zeiss | OPMI-MDM | |
| Sutures (anastomoses) | Catgut | Mariderm 8-0 monofil | |
| Sutures (ligature) | Resorba | Silk 5-0 polyfil | |
| Sutures (skin, fascia) | Ethicon | Mersilene 3-0 | |
| Syringe (1 mL) | B. Braun | 9166017V | |
| Syringe (10 mL) | B. Braun | 4606108V | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4606205V | |
| Vascular clamp | B. Braun | Aesculap FB708R |
References
- Abbott, C. P., et al. A Technique for Heart Transplantation In the Rat. Archives of Surgery. 89 (4), 645-652 (1964).
- Tomita, F.
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Wen, P., et al. A simple technique for a new working heterotopic heart transplantation model in rats. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2522-2526 (2013).
- Benke, K., et al. Heterotopic abdominal rat heart transplantation as a model to investigate volume dependency of myocardial remodeling. Transplantation. 101 (3), 498-505 (2017).
- Kearns, M. J., et al. Rat Heterotopic Abdominal Heart/Single-lung Transplantation in a Volume-loaded Configuration. Journal of Visualized Experiments. (99), 52418 (2015).
- Ibrahim, M., et al. Heterotopic abdominal heart transplantation in rats for functional studies of ventricular unloading. The Journal of Surgical Research. 179 (1), e31-e39 (2013).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lu, W., et al. A new simplified volume-loaded heterotopic rabbit heart transplant model with improved techniques and a standard operating procedure. Journal of Thoracic Disease. 7 (4), 653-661 (2015).
- Kitahara, H., et al. Heterotopic transplantation of a decellularized and recellularized whole porcine heart. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 22 (5), 571-579 (2016).
- Kadner, A., et al. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Zinöcker, S., et al. Immune reconstitution and graft-versus-host reactions in rat models of allogeneic hematopoietic cell transplantation. Frontiers in Immunology. 3 (NOV), 1-12 (2012).
- Klempnauer, J., et al. Genetic control of rat heart allograft rejection: effect of different MHC and non-MHC incompatibilities. Immunogenetics. 30, 81-88 (1989).
- Huang, G., et al. Genetic manipulations in the rat: Progress and prospects. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (4), 391-399 (2011).
- Gordon, C. R., et al. Pulse doppler and M-mode to assess viability of cardiac allografts using heterotopic femoral heart transplantation in rats. Microsurgery. 27 (4), 240-244 (2007).
- Gordon, C. R., et al. A new modified technique for heterotopic femoral heart transplantation in rats. The Journal of Surgical Research. 139 (2), 157-163 (2007).
- Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Experimental and Clinical Transplantation. 9 (2), 128-133 (2011).
- Bektas, H., et al. Differential effect of donor-specific blood transfusions after kidney, heart, pancreas, and skin transplantation in major histocompatibility complex-incompatible rats. Transfusion. 37 (2), 226-230 (1997).
- Saiho, K. O., et al. Long-term allograft acceptance induced by single dose anti-leukocyte common antigen (RT7) antibody in the rat. Transplantation. 71 (8), 1124-1131 (2001).
- Bektas, H., et al. Blood transfers infectious immunologic tolerance in MHC-incompatible heart transplantation in rats. Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (5), 614-617 (2005).
- Jäger, M. D., et al. Sirolimus promotes tolerance for donor and recipient antigens after MHC class II disparate bone marrow transplantation in rats. Experimental Hematology. 35 (1), 164-170 (2007).
- Timrott, K., et al. Application of allogeneic bone marrow cells in view of residual alloreactivity: Sirolimus but not cyclosporine evolves tolerogenic properties. PLoS ONE. 10 (4), 1-16 (2015).
- Hadamitzky, M., et al. Memory-updating abrogates extinction of learned immunosuppression. Brain, Behavior, and Immunity. 52, 40-48 (2016).
- Beetz, O., et al. Recipient natural killer cells alter the course of rejection of allogeneic heart grafts in rats. Plos One. 14 (8), e0220546 (2019).
- Hirschburger, M., et al. Nicotine Attenuates Macrophage Infiltration in Rat Lung Allografts. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28 (5), 493-500 (2009).
- Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplantation Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
- Wang, D., et al. A simplified technique for heart transplantation in rats: abdominal vessel branch-sparing and modified venotomy. Microsurgery. 26 (6), 470-472 (2006).
- Wang, C., et al. A modified method for heterotopic mouse heart transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).
- Al-Amran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45 (2), 625-629 (2013).
- Hoerstrup, S. P., et al. Modified technique for heterotopic rat heart transplantation under cardioplegic arrest. Journal of Investigative Surgery. 13 (2), 73-77 (2000).
- Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
- Ahmadi, A. R., et al. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
- Schmid, C., et al. Successful heterotopic heart transplantation in rat. Microsurgery. 15 (4), 279-281 (1994).
- Shan, J., et al. A modified technique for heterotopic heart transplantation in rats. Journal of Surgical Research. 164 (1), 155-161 (2010).
- Moris, D., et al.
- Bickerstaff, A. A., et al. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovascular Research. 22 (5), 315-321 (1988).
- Torre-Amione, G., et al. Decreased expression of tumor necrosis factor-α in failing human myocardium after mechanical circulatory support: A potential mechanism for cardiac recovery. Circulation. 100 (11), 1189-1193 (1999).
- Goldstein, D. J., et al. Circulatory resuscitation with left ventricular assist device support reduces interleukins 6 and 8 levels. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (4), 971-974 (1997).
- Tang-Quan, K. R., et al. Non-volume-loaded heart provides a more relevant heterotopic transplantation model. Transplant Immunology. 23 (1-2), 65-70 (2010).
- Lakhal-Naouar, I., et al. Transcutaneous immunization using SLA or rLACK skews the immune response towards a Th1 profile but fails to protect BALB/c mice against a Leishmania major challenge. Vaccine. 37 (3), 516-523 (2019).
- Sousa-Batista, A. J., et al. Novel and safe single-dose treatment of cutaneous leishmaniasis with implantable amphotericin B-loaded microparticles. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. , (2019).
