Summary
우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs)는 세포 운명 결정 및 발달 타이밍의 복잡한 조절에 중요합니다. 초기 개발 중 miRNAs의 기여에 대한 생체 내 연구는 세포 수 제한으로 인해 기술적으로 도전적입니다. 더욱이, 많은 접근은 북부 블로팅, 마이크로어레이 및 qPCR와 같은 소사에서 정의될 관심있는 miRNA를 요구합니다. 따라서, 많은 miRNAs와 그들의 등색형의 표현은 초기 발달 도중 공부되지 않았습니다. 여기서, 우리는 신경 문장 세포의 초기 인구에 있는 miRNAs의 상대적으로 편견없는 프로파일링을 가능하게 하기 위하여 초기 마우스 배아에서 정렬된 세포의 작은 RNA 순서를 위한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 증폭 및 젤 기반 정화를 사용하여 도서관 준비 중에 낮은 세포 입력 및 크기 선택의 도전을 극복합니다. 우리는 생물학적 복제에서 miRNAs를 정확하게 프로파일하기 위하여 복제와 단계 일치마우스 태아 사이 변이를 위한 가변적인 회계로 배아 나이를 확인합니다. 우리의 결과는 이 방법이 세포의 그밖 혈통에서 miRNAs의 표현을 프로파일에 광범위하게 적용될 수 있다는 것을 건의합니다. 요약하자면, 이 프로토콜은 miRNAs가 초기 마우스 배아의 다른 세포 계보에 있는 발달 프로그램을 어떻게 통제하는지 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Introduction
발달 생물학의 핵심 질문은 단 하나 미분화 세포가 수많은 복잡한 세포 모형을 가진 전체 유기체를 초래할 수 있는 방법입니다. 배아 발생 하는 동안, 세포의 개발 잠재력 유기 체 개발으로 점진적으로 제한 된다. 한 가지 예는 다능성 세포 집단에서 말초 뉴런, 신경교, 두개골 뼈 및 연골과 같은 다양한 말단 유도체로 점진적으로 분화하는 신경 문장 계보입니다. 신경 문장 세포는 위질 도중 이독에서 지정된 다음 중간엽 전이에 상피 전달을 겪고 그(것)들이 말단으로 분화할 바디 를 통해 이산위치로 배아를 통해 이동합니다1. 수십 년의 작업이 전사 적 유전자 규제 네트워크를 발견했지만 신경 문장 발달의 타이밍을 제어하는 전사 후 규제 메커니즘에 대해 훨씬 적게 알려져 있습니다.
이전 연구는 microRNAs (miRNAs) 적절한 발달 타이밍 및 세포 운명 결정에 대한 유전자 발현을 억압 제안2,,3,,44,5,,6. 신경 문장 발달에 있는 miRNAs의 연구 결과는 주로 두개안면 발달의 후반 단계에 집중했습니다. 예를 들어, miR-17~92 및 miR-140은 마우스와 제브라피시의 두개안면 발달 중 발상발생에 매우 중요하며, 각각7,,8. 태아의 초기 신경 문장 운명 결정에 miRNAs의 기여는 철저히 조사되지 않았습니다. 초기 운명 결정에 있는 miRNAs의 연구 결과는 초기 태아에 존재하는 낮은 세포 수와 같은 기술적인 도전에 의해 제한되었습니다.
MiRNAs는 초기 마우스발달9를모델링하기 위하여 분화의 다른 단계에서 배아 바디를 사용하여 세포주에서 시험관내에서 프로파일화되었습니다. 초기 포유류 발달 중 생체 내의 작은 RNA에 대한 조사는 상대적으로 제한적이었습니다. miRNAs를 프로파일화하는 이전 방법은 qPCR, 마이크로어레이 및 북부blot(10)와같은 방법으로 특정 miRNA의 발현을 분석하는 데 공지된 서열로서 편향을 주도했다. 차세대 시퀀싱 및 적 분자 도구를 개선하는 것은 이제 초기 포유류 발달 및 세포 운명 결정에 대한 기여를 연구하기 위해 miRNA 발현의 상대적으로 편견없는 분석을 허용합니다.
여기서, 우리는 가스화 (E7.5)를 아우르는 초기 마우스 배아에서 유기발생의 시작 (E9.5)에 신경 문장 세포에서 발현된 작은 RNA를 수확하고 순서하는 기술을 보고합니다. 이 기술은 간단하고 차세대 시퀀싱을 위한 최소한의 셀수로부터 작은 RNA 시퀀싱 라이브러리를 준비하기 위해 리니지 추적, 세포 선별 및 젤 기반 크기 선택을 결합합니다. 우리는 조기 발달의 급속한 변화 도중 miRNA의 포괄적인 보기를 얻기 위하여 6 시간 간격을 해결하기 위하여 배아의 엄격한 somite 단계 일치를 위한 중요성을 강조합니다. 이 방법은 유전 및 발달 연구에 널리 적용될 수 있고 태아의 풀링을 방지할 수 있습니다. 우리는 젤 기반 정화, 라이브러리 정량화 및 PCR에서 도입 된 편견을 최소화하여 miRNA 농축과 같은 현재 방법의 과제를 극복하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 miRNA 발현 패턴을 확인하기 위해 시간이 지남에 따라 miRNA 발현 패턴을 식별하여 miRNAs가 마우스 배아의 신경 문장 계보에서 개발 타이밍을 제어하는 방법을 연구하는 데 사용되었습니다.
Protocol
모든 연구 및 동물 관리 절차는 베일러 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었으며 베일러 의과 대학의 실험실 동물 관리 승인 동물 시설의 평가 및 인증 협회에 보관되었습니다. 모든 균주는 C57BL6 배경에서 유지되었습니다.
1. 배아 해부 (E7.5-E9.5)
- 임신 한 여성 마우스에서 자궁 뿔을 제거하고 절개가 만들어질 70 %의 에탄올로 복부를 살균하십시오.
- 인산완충식식염(PBS)으로 헹구어 자궁을 청소하십시오. 자궁을 멸균 플라스틱 10cm 접시에 넣습니다.
- 미세 절 가위를 사용하여 영역을 포함하는 각 데시두아를 서로 분리합니다. 자궁 근육을 벗겨 내고 모든 데키다큐를 노출하십시오. 하나씩 각 배아에서 데시두아를 제거합니다.
- 각 배아에서 노른자 주머니를 제거하고 지노티핑을 위해 저장합니다.
- 모든 배아를 이미징을 위해 신선한 PBS의 새로운 접시로 이동합니다.
- 전체 쓰레기의 이미지를 가져 가라. 각 배아를 개별적으로 이미지화하고 각 배아의 소미트 수를 계산합니다. 배율과 노출(형광용)을 실험 간에 동일하게 유지합니다.
참고: 50-200ms 노출이 형광에 적합하며 20ms는 밝은 필드 설정에 적절하다는 것을 발견했습니다.
2. 배아 해리 및 세포 분류
- 각 배아에서 정렬할 수 있도록 다음을 수행하십시오.
- E8.0보다 오래된 배아를 위한 오틱 플라코드 바로 위에 참수하십시오(두개골 부위의 표지된 세포만 원하는 경우). E7.5 배아의 경우, 엑스트라배아 구조를 제거하십시오(적절한 배아만 원하는 경우).
- 48웰 플레이트의 깨끗한 우물로 머리를 최소한의 PBS로 이동합니다. 250 μL의 파파인(27 U/mL)을 추가합니다. p200을 사용하여 부드럽게 위아래로 파이펫.
- 현미경의 밑에 확인하고 덩어리와 단 하나 세포를 찾아보십시오.
- 단일 셀 서스펜션이 달성 될 때까지 위아래로 부드러운 파이펫을 반복하십시오 (일반적으로 E7.5-E9.5의 경우 30 초에서 1 분 사이로 동일시되어야하는 위아래로 파이펫팅의 세 라운드).
- 태아 소 혈청 (FBS)의 250 μL로 담금질.
- 각 배아를 정렬하는 단계 2.1.1-2.1.5를 반복한다.
- 35 μm 나일론 메쉬 필터 캡 튜브를 통해 셀 서스펜션 500 μL을 걸러 서 덩어리를 제거합니다.
- 여과물을 가지고 새로운 1.5 mL 튜브로 이동하고 5 분 동안 200 x g에서 회전. 주체를 조심스럽게 제거하고 새로운 튜브로 옮김하십시오 (살아있는 세포가 펠릿에 있는 것으로 알려질 때까지 저장하십시오).
- 0.5-1% 소 세럼 알부민을 함유한 PBS의 300 μL에서 세포 펠릿을 재일시 중단하고 정렬될 때까지 얼음을 유지합니다(현재와 정렬 종료 사이의 시간을 최소화).
- 원하는 경우, 셀 서스펜션의 10 μL을 가지고 Trypan 블루의 10 μL (0.4%)와 결합 그리고 혈종계를 사용하여 Trypan 블루만 죽은 세포를 얼룩으로 대략적인 세포 정량화 및 생존성을 식별합니다.
- 정렬 직전에 필터 캡 튜브를 통해 각 샘플을 다시 필터링하고 라이브 셀에 DAPI 얼룩을 추가합니다.
- 각 샘플을 RNA 추출 용액 500 μL(재료 표참조)로 70 μm 노즐로 셀 선별기로 정렬합니다.
- 모든 샘플을 수확할 때까지 -80°C에서 혼합하고 보관하십시오. 이 시점에서는 실험에 필요한 모든 샘플을 수확하여 라이브러리 준비 라운드 간의 기술적 변동을 줄일 수 있습니다.
3. RNA 추출
참고: 프로토콜은 RNA 절연 키트로부터 조정됩니다. 재료 표를 참조하십시오.
- RNA 추출 용액 500μL(재료 표참조)을 각 샘플에 추가하여 총 부피 1000 μL을 만듭니다.
- 각 샘플을 실온에서 해동합니다.
- 1.5 분 동안 각 샘플을 소용돌이, 균일화를 시작하기 전에 캡이 각 튜브에 안전하게 있는지 확인. 실온(15-25°C)에서 5분 동안 동형어를 배양한다.
- 140 μL의 클로로폼을 추가하고 캡 튜브를 단단히 넣고 15s를 위해 힘차게 흔들어 줍니다. 실온에서 3분 동안 배양하십시오.
- 4°C에서 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리기. 상부 수성 위상을 얼음 위에 새 수집 튜브로 옮기습니다. 단계 간 또는 유기 단계를 전송하지 마십시오. 분홍색 유기 단계에 접근할 때 튜브를 옆으로 팁으로 팁을 주어 명확한 수성 상이 수집될 수 없을 때까지 작은 알리쿼트를 제거합니다.
- 다음 단계에서 올바른 계산을 위해 각 샘플에서 수집된 수성 상이 포함된 RNA의 부피를 측정합니다.
- 100% 에탄올의 1.5부부(보통 525μL)를 추가하고 파이펫팅으로 철저히 섞는다.
- 침전을 포함하여 최대 700μL 샘플이 2mL 수집 튜브의 컬럼으로 들어갑니다. 실온에서 15s에 대해 ≥8,000 x g의 뚜껑과 원심분리기를 닫습니다. 흐름을 삭제합니다.
- 샘플의 나머지 부분을 사용하여 3.8 단계를 반복합니다.
- 제조업체 지침에 따라 열을 세척합니다. 1 분 동안 최고 속도로 회전하여 열을 건조. 컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브로 전송합니다.
- 메막 의 중앙에 핵자유물의 파이펫 11 μL. 실온에서 1분 동안 앉습니다. 최대 속도를 1분 회전하여 열을 벗어날 수 있습니다.
- 분광계 및 평행 모세관 전기 포근기구(재료표)를 사용하여 RNA 농도를측정한다.
4. 도서관 준비
참고 : 프로토콜은 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에서 적응; 재료 표를참조하십시오.
- 3' 어댑터의 1/4 희석을 사용하여 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 바와 같이 데마처레이션 및 3' 어댑터 결찰을 완료합니다.
- 3' 어댑터 제거를 계속합니다.
- 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 어댑터 고갈을 완료하십시오. 비드 클렌징을 위해 신선하게 준비된 80% 에탄올을 사용하고 모든 과잉 에탄올이 비드를 과도하게 건조시키지 않고 뉴클레아제없는 물로 재서스펜션 직전에 완전히 제거된다는 것을 반드시 사용하십시오 (비드 펠릿의 균열은 과다 건조 시 관찰됩니다).
- 초과 어댑터 비활성화로 직접 진행합니다.
- 얼음에 모든 시약을 조립 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 초과 어댑터 불활성화를 완료합니다.
- 5' 4N 어댑터 리차션을 계속 합니다.
- 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 5' 어댑터 결찰을 완료하여 5' 어댑터의 1/4 희석을 사용하고 모든 시약을 얼음에 조립합니다.
- 전사를 반전으로 진행합니다.
- 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 바와 같이 완전한 역전사-첫 번째 가닥 합성을 통해 얼음에 대한 모든 시약을 조립하고 장기간 냉동고에서 효소를 유지하지 않도록 주의한다.
참고: 이 시점에서 프로토콜은 4°C에서 하룻밤 사이에 저장된 샘플을 사용하여 프로토콜을 중지할 수 있습니다. 또는 PCR 증폭을 계속합니다. - 작은 RNA 라이브러리 준비 키트 핸드북에 명시된 대로 시약을 조립하고 PCR 사이클수를 최소화하여 PCR 증폭을 완료합니다. PCR 주기의 수는 각 응용 프로그램에 대해 실험적으로 결정되어야 하며 최소 사이클 수를 사용해야 합니다. 여기서 우리는 우리의 작은 RNA 라이브러리를 성공적으로 증폭하기 위하여 16 주기를 이용했습니다.
- 크기 선택으로 직접 진행합니다.
5. 크기 선택
- 각 샘플에 6x 젤 로딩 염료와 파이펫 5 μL을 추가하여 혼합합니다.
- 10 μL의 사다리를 젤의 첫 번째 우물에 적재하여 우물을 오른쪽 빈 상태로 즉시 남깁니다. 모든 제품을 5.1 단계에서 6% 트리/붕산/에틸렌디아민트라아세트산에 적재하고 폴리아크라이알라미드 젤(TBE-PAGE)을 각 시료 사이에 1레인을 둡니다.
참고: 다음 단계를 위해 젤이 들어온 용기를 보관하십시오. - 0.5배 TBE 러닝 버퍼에서 약 30-40분 동안 150V에서 젤을 실행하십시오(하부 염료 밴드가 겔 의 바닥 근처에 있을 때까지, 0.5-1 cm).
- 젤이 실행되는 동안 염색 용액 1 L을 확인하십시오: SYBR 골드는 0.5배 TBE로 1:10,000을 희석시켰습니다.
- 젤이 실행이 완료되면 (즉, 하부 염료 밴드는 젤의 바닥 근처에 있음), 조심스럽게 젤의 방향을 지적, 유리 플레이트에서 젤을 제거합니다.
- 원래 포장의 트레이에 젤을 놓습니다. 0.5x TBE를 제거하고 5.5단계에서 염색 용액으로 교체하십시오. 스테인 젤15 분 동안. 염색 시간을 늘려야 할 수도 있습니다.
- UV 트랜실루미나이터에 젤을 놓고, 겔을 찢지 않도록 주의하고 위에서 언급한 방향을 유지합니다(사다리 의 밴드가 명확하게 볼 수 없는 경우 추가 시간 동안 다시 얼룩).
- 카메라가 있는 UV 트랜틸루미너에 염색이 완료되면 젤을 이미지합니다.
- 더 나은 이미지가 필요한 경우, 먼저 UV 트랜실루미너 이외의 이미징 장치를 사용하여 UV 트랜일루미노이터에서 직접 이미징으로 UV 트랜일루미노터에서 밴드를 절단하기 전에 겔의 이미지를 캡처하면 도 3A-B에도시된 바와 같이 배경의 가변 색소를 일으킨다. 젤이 섬세하고 찢어질 수 있으므로 너무 여러 번 이동하지 마십시오.
- 깨끗한 면도날을 사용하여 ~150bp 대역을 식별하고 제거하고 깨끗한 1.5mL 튜브에 넣습니다. ~130 bp 대역(어댑터 디머 제품)을 잘라내지 마십시오.
- 문서화 를 위해 라이브러리 제품을 포함하는 조각을 제거 한 후 젤을 다시 이미지합니다.
- 젤 슬라이스를 함유한 마이크로센심분리기 튜브를 최대 속도로 30초간 회전하여 각 튜브의 하단에 있는 슬라이스를 수집합니다.
- 각 샘플에 p200 팁을 사용하여 젤 조각을 가능한 가장 작은 비트로 분쇄하십시오. 각 팁을 각 튜브로 배출합니다.
- 각 튜브에 300 μL의 용출 버퍼를 추가하여 튜브 측면에서 젤 비트를 세척하고 p200 팁을 다시 부착하고 각 샘플의 팁을 씻어 냅니다.
- 25°C로 설정된 흔들리는 인큐베이터에 용출 샘플을 놓습니다. 하룻밤 사이에 1000 rpm 흔들림으로 배양하십시오. 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 실온에서 최대 속도로 10 분 동안 회전하십시오.
- 라이브러리 제품을 포함하는 상체를 2mL RNase 무료 96 웰 플레이트로 전송합니다. 젤을 옮기지 않도록 주의하십시오.
- 각 샘플에 50 μL 정리 구슬을 추가하고 파이펫팅하여 혼합합니다. 즉시 350 μL의 이소프로판올을 넣고 파이펫팅으로 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양하여 흔들리면 됩니다.
- 펄스 스핀 플레이트를 펠릿 구슬로 한 다음 2 분 동안 자화하십시오. 상체를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오.
- 80% 에탄올의 950 μL을 추가합니다. 30s에 대한 인큐베이션. 모든 상체를 제거합니다. 총 2개의 에탄올 세시에 대해 반복합니다.
- 3 분 동안 샘플을 건조. 이 단계에서각 우물의 바닥에서 수집되는 잔류 에탄올 (한 번 이상)을 제거하고 비드를 과도하게 건조시키지 않도록주의하십시오 (과도하게 건조하면 비드 펠릿이 균열될 것입니다).
- 우물 바닥에 있는 잔류 액을 모두 제거합니다. 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거합니다.
- 13 μL의 재서스펜션 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다. 균일할 때까지 파이펫으로 섞습니다. 2 분 동안 배양 한 다음 3 분 동안 자화하십시오.
- 12 μL의 상류체를 깨끗한 튜브 또는 깨끗한 접시로 옮겨 후속 보관을 합니다. 모든 샘플을 하룻밤 사이에 4°C 또는 -20°C의 장기저장합니다.
- 모세관 전기포고감도 DNA 분석체를 사용하여 각 라이브러리에 존재하는 단편의 크기와 농도를 확인한다. 하나 이상의 방법으로 농도를 확인합니다.
참고: 우리는 때때로 모세관 전기 포근을 과부하하지 않도록 표준 감도 키트를 사용했습니다.
Representative Results
여기에서 입증된 절차를 사용하여, 우리는 E7.5, E8.5 및 E9.5에서 배아를 수확했습니다. 외화 구조는 모든 배아에서 제거된 다음 배아는 6시간간격(그림 1A-1B)을해결하기 위해 소미트로 준비되었다. 원리 성분 분석을 사용하여 유사성에 따라 샘플을 그룹화하여 배아 연령의 결과로 변이를 강조하고 생물학적 복제에 대한 신중한 솜릿 매칭의필요성(도 1C)을발견합니다. 우리는 E7.5에서 만능 성전성, 혈통추적 전철 및 E8.5에서 Wnt1-Cre를 사용하여 전철 및 철새 신경 문장 세포를 추적하였으며 E9.5(그림 1D)에서Sox10-Cre를 사용하여 철새 신경 문장 세포를 사용하였다. 여기서 우리는 특히 오틱 플래코드 바로 위에 배아를 참수하여 두개골 신경 문장을 수확합니다. 신경 문장 세포에 자주 사용되는 두 개의 Cre-driver(Wnt1 및 Sox10)의 비교는 초기 마우스 배아(그림1E)에서다른 집단을 표시한다는 것을 확인한다. 게이팅 전략은 RNA 추출 용액(재료 표참조)으로 직접 분류되고 -80°C(도1F)에저장된 살아있는 단일 RFP 양성 세포를 얻기 위해 사용되었다. 각 샘플에서 얼마나 많은 세포가 수확되었는지 추적하는 것이 중요합니다.
RNA 절연은 RNA 키트 프로토콜의 수정된 버전을 사용하여 수행되었다. 구체적으로, 우리는 4°C에 저장되는 미니 RNA 컬럼을 사용합니다. 이러한 컬럼은 소량(11 μL)으로 용출하여 세포 입력이 제한되는 시료로부터 가능한 가장 높은 RNA 농도를 얻는 데 유용합니다. 이러한 이유로 페놀 클로로폼 추출 후 모든 수성 상을 얻는 것이 중요하다. 수집하는 동안 튜브를 한쪽으로 느리게 파이프팅하고 기울이는 것은 수율을 최대화하는 데 중요합니다. 본 절차에서, 우리는 분광계를 모두 사용하여 RNA를 정량화하고, 염/단백질 오염에 대한 정보를 얻고, 모세관 전기포고증(도2)을측정한다. 분광광계 추적은 RNA가 오염 단백질없이 격리되었지만 염분 함량이 높다는 것을 보여줍니다(그림 2A-2B). 이상적으로 260/280 비율은 ~1.8이어야 하며 260/230 비율은 >2.0이어야 합니다. 분광계에 의해 측정된 총 RNA 수율은 E8.5-E9.5 사이의 나이와 함께 증가하지 않았다. 이는 우리가 수확하는 세포의 수로부터 RNA 농도의 변화를 감지하기에 충분히 민감하지 않은 분광계의 해상도에 기인하며, 모세관 전기포고증(도2C)으로부터얻은 농도 정보를 사용하는 것이 좋습니다. 모세관 전기 포근 추적은 RNA 단편의 농도 및 크기를 추정하는 데 사용될 수 있다. 봉우리 &1000 뉴클레오티드는 저하를 나타낸다. 대표적인 추적은 저하되지 않는 RNA와 일치한다. 2000뉴클레오티드 및 5100 뉴클레오티드에서의 피크는 각각 18s 및 28s rRNA이다. 작은 RNA 부위는 ~150뉴클레오티드(도2D)에위치한다.
작은 RNA 염기서열 분석 라이브러리는 재료의 표에설명된 작은 RNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 준비되었다. 여기서 우리는 각 샘플에서 얻은 RNA의 절반 미만(11 μL 용출의 4μL, ~80-120 ng)을 사용하여 각 샘플에서 나머지 RNA로부터 RNA 시퀀싱 라이브러리를 합성할 수 있게 한다. 여기서 우리는 3' 및 5'의 소형 RNA 어댑터를 1/4로 희석하여 어댑터 디머의 양을 낮추고 어댑터 결찰, 정리 및 역전사 단계가 가능한 한 지속적으로 완료될 것을 제안합니다. 라이브러리를 증폭하기 위해 16개의 PCR 주기를 사용했으며 모든 실험에 대한 최소 PCR 주기 수가 경험적으로 결정될 것을 제안합니다. 초과 PCR 주기를 완료함으로써, 하나는 인위적으로 낮은 표현 miRNA의 읽기 수를 팽창 시킬 수 있습니다.
크기 선택은 일반적으로 존재하는 어댑터 디머가 아닌 miRNAs 라이브러리를 보강하는 것이 필수적입니다. 라이브러리 제품 크기(150bp) 및 어댑터 디머(130bp)의 크기는 매우 유사합니다. 겔 추출은 어댑터 디머(도3)로부터작은 RNA 시퀀싱 라이브러리를 분리하는 데 사용됩니다. 절제 하기 전에 PAGE 젤의 이미지는 제품 크기의 무리가 각 샘플에 존재 하는 것을 보여줍니다(그림 3A). 두 샘플 또는 젤에 로드되는 사다리 사이에 하나의 차선을 열어 두는 것이 중요합니다. 겔 의 하단에 있는 마이그레이션 전면은 150 bp 대역이 모든 샘플을 구별하기 어려운 경우 느린 속도로 달리는 것이 필요할 수 있음을 나타내는 약간 곡선된다. 이 대표적인 이미지는 또한 각 배아 샘플에 들어간 것과 비교하여 라이브러리 준비에 들어간 양성 조절 RNA(쥐의 뇌에서 총 RNA)의 높은 농도로부터 150bp 의 풍부한 생성물을 나타낸다. 음의 대조군은 시약이 핵산 종(도3A)을오염시킬 수 없다는 것을 보여준다. 150 bp 대역의 절제는 깨끗한 면도칼로 수행해야하며 수집 된 영역은 도 3B에표시됩니다. 모세관 전기포고는 크기 선택 전후에 겔 정화(도 3C-3D)를통해 150bp 라이브러리 제품의 순도가 급격한 개선을 보여준다.Figure 3 도 3C-3D의 Figure 3추적은 마커보다 높은 샘플 피크를 가지며 오버로드를 나타내는 것이 중요합니다. 이러한 경우, 조각의 크기는 정확할 수 있지만 농도는 그렇지 않을 수 있다. 정량화는 라이브러리를 마커의 범위로 희석하거나 대체 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 우리는 라이브러리 정량화의 대체 방법에 걸쳐 몇 가지 변형을 발견하고 정량화의 여러 방법을 경험적으로 테스트하는 것이 좋습니다. 한 번에 시퀀스되는 시료 수를 최대화할 때 농도의 정확한 정량화가 필수적입니다. 라이브러리는 시퀀싱을 위해 1.3pM로 희석되며 일반적으로 15-25 샘플은 150사이클 시퀀싱 키트에서 한 번에 시퀀싱하여 1억 4천만 개의 판독을 제공한다. 이로 인해 샘플당 약 500만 개의 읽기가 발생합니다. 일반적으로 매핑 속도는 60-80% 사이입니다.
그림 1: 작은 RNA 염기서열분석에 대한 마우스 배아에서 세포를 수확. (A)E8.5 마우스 배아는 마우스 배아의 단계를 결정하는 데 사용되는 노른자B낭과 소미트의 제거를 강조하기 위해 신경 문장 발달의 단계를 포착합니다(C)분류된 야생형 신경 문장 세포로부터 준비된 라이브러리의 원리 성분 분석은 샘플그룹이나이별C-5-Cre-5-Cret-5.C를 사용하여 수확한 방법을 보여주는 분석 라벨 사전 이민 및 철새 신경 문장 세포및 Sox10-Cre에 대한 라벨은 E9.5에서 만 철새 신경 문장 세포(E)원리 성분 분석만 에 관계없이 나이(F)E8.5 및 E9.5 배아에서 RFP + 신경 문장 세포를 분리하는 데 사용되는 Cre-driver에 의해 함께 샘플 그룹을 보여주는 분류 된 야생 형 신경 문장 세포에서 준비된 라이브러리의 원리 성분 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: E7.5-E9.5 마우스 배아로부터의 RNA 절연. (A)우리가 이 프로토콜을 적용한 태아의 막내 단계에서 RNA 절연의 대표적인 분광계 추적. (B)분광계로부터 얻어진 RNA 품질의 대표적인 값을 나타내는 표. (C)각 연령의 배아로부터 선별된 신경 문장 세포로부터 수확된 RNA의예(D)모세관 전기포고는 양질의 RNA를 나타내는 상이하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 크기 선택 전후의 miRNA 라이브러리입니다. (A)TBE-PAGE 젤은 150bp 대역 절제 후 4개의 샘플 및 대조군을 위한 대표적인 소형 RNA 라이브러리를전(B)에대해 보여준다. 상기 화살은 크기 선택 전후의 작은 RNA 라이브러리의 소세혈관 전기포고사형(C) 축출될 150bp 대역을 나타낸다.CD 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
발달 과정은 빠르게 진행될 수 있으며, 세포는 초기 운명 결정에 기여하는 miRNAs의 포괄적 인 관점을 포착하기 위해 널리 사용되는 반나절 증가보다 더 구체적인 스테이징이 필요합니다. 최근 연구는 3 ~6 소크릿11을갖는 것에서 범위 Theiler 단계 12 배아에서 RNA 염기서열 분석 수행했다. 우리는 이 기간 동안 신경 문장 세포가 지정되어 있음을 발견합니다 (나이의 소미트 3 개), 망상 (4 개의 소암), 및 이동 (5-6 소암). 우리는 또한 추적 세포 인구를 계보하는 데 사용되는 Cre-driver 외에, 나이는 생물학 견본 사이 변이의 가장 큰 근원이고, 다만 somite 일치하는 태아는 복제로 고려되어야 한다는 것을 것을을 발견합니다. 이것은 또한 야생형 통제에 형질 전환 태아를 비교할 때 고려되어야 합니다.
초기 발달 중에 miRNAs를 프로파일링하는 이전 방법은 작은 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비를 위해 RNA 입력의 10-100 ng 사이를 사용하고 한 샘플13,,14로여러 배아를 풀링하였다. 우리는 단일 E7.5 배아또는 E8.5 및 E9.5에서 정렬된 신경 문장 세포로부터 RNA 절연 및 라이브러리 준비를 총 RNA의 약 100 ng를 입력으로 시연합니다. 분류를 위해 배아를 해리할 때, 현미경의 밑에 해리를 보고 단 하나 세포가 얻어질 때 관찰하는 반응을 담금질하기 위하여 주의해야 합니다. 우리는 E8.5-E9.5 배아의 두개골 영역의 해리가 프로토콜에 설명된 것과 같이 부드러운 수동 파이펫팅으로 거의 즉각적이라는 것을 발견합니다. 더 큰 조직 및 점점 더 오래된 태아를 위해, 해리 시간은 해리되는 태아의 부분에 따라서 더 길수 있습니다. E7.5-E9.5 배아의 경우, 세포의 덩어리는 현미경의 밑에 쉽게 볼 수 있고 더 이상 덩어리가 보이지 않게 될 때까지 해리는 계속되어야 합니다. 5-10x에서 어디서나 우물의 용액을 통해 초점을 조정하면 단일 셀이 용액에서 볼 수 있습니다. 이전 방법은 RNA 시퀀싱을 위한 리시스 버퍼로 직접 세포를 정렬하여 낮은 수의세포(14)로부터벌크 RNA를 준비한다. 여기서 우리는 RNA 추출 용액으로 직접 분류하여 RNA가 라이브러리 준비가 시작되기 전에 분리될 수 있도록 합니다. 11 μL 용출 부피를 가진 미니 컬럼을 사용하면 단일 RNA 준비가 작은 RNA와 벌크 RNA 염기분석 사이에 분할될 수 있도록 충분한 RNA 농도를 허용한다.
대부분의 작은 RNA 염기서열 분석 방법의 한 가지 현재 제한은 변환 된 cDNA의 PCR 증폭이다. 우리의 방법은이 제한을 극복하지 못하지만, 우리는 16 사이클까지 권장되는 25 최대에서 PCR 사이클의 수를 최소화 할 수 있었다. 이러한 증폭 감소는 PCR에 의해 도입된 인공 증폭 편향을 감소시다. 바이어스의 또 다른 소스는 어댑터와 miRNA의 끝에 위치한 특정 시퀀스가 다른 시퀀스보다 더 큰 효율성과 함께 ligate 수 있다는 것으로 알려진 어댑터의 결찰입니다. 이를 방지하기 위해 이 프로토콜에 사용된 어댑터는 각 어댑터 끝에 4개의 임의 베이스를 통합하여 결찰 반응의 바이어스를 방지합니다. 또한, 또 다른 일반적인 문제는 RNA 입력이 낮을 때 형성하는 어댑터 디머의 양입니다. 라이브러리 준비 키트에는 어댑터 비활성화 및 비드 정리와 같은 어댑터 디머 형성을 줄이는 단계가 포함되어 각 결찰 후 과도한 어댑터를 제거합니다. 또한 3'와 5'4N 어댑터를 1/4로 희석하여 형성할 수 있는 어댑터 이머의 양을 줄입니다. 희석되지 않을 때, 130 bp 대역 강도가 증가하여 젤상에 원하는 작은 RNA 라이브러리를 함유하는 150bp 대역과 구별하기가 어렵다는 것을 발견했습니다.
시퀀싱 라이브러리를 준비하는 또 다른 현재의 과제는 시퀀싱 전에 제품의 정확한 정량화입니다. 우리는 다른 방법이 동일한 라이브러리에 다양한 결과를 제공하는 것을 발견했다. 우리는 연구원이 집중의 정확한 추정을 얻기 위하여 정량화의 다중 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜은 RNA가 낮은 수의 세포에서 수확되는 유전, 발달 연구, 또는 그밖 응용에 넓게 적용될 수 있습니다. 이 접근법은 배아의 풀링을 피함으로써 시간적 연구를 단순화하고 비 정렬 및 정렬 된 세포 모두에 쉽게 적용 할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 앤드류 맥도노프 B + 재단과 NIH (R01-HD099252, R01-HD098131에 의해 지원되었다. R.J.P.는 암 연구(RR150106)와 암 연구(V 재단)의 V 학자입니다. 저자는 또한이 프로젝트에 필요한 장비를 제공하기 위한 BCM의 세포 측정 및 세포 선별 코어를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P.
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
