Evaluación biventricular de la función cardíaca y de los asas presión-volumen mediante cateterismo torácico cerrado en ratones

Resumen

Se presenta un protocolo para evaluar la función cardíaca biventricular en ratones mediante la generación de asas de presión-volumen (VP) desde el ventrículo derecho e izquierdo en el mismo animal mediante cateterismo torácico cerrado. La atención se centra en el aspecto técnico de la cirugía y la adquisición de datos.

Resumen

La evaluación de la función cardíaca es esencial para llevar a cabo investigaciones preclínicas cardiovasculares y pulmonares-vasculares. Los bucles de presión-volumen (bucles PV) generados por el registro de la presión y el volumen durante el cateterismo cardíaco son vitales para evaluar la función cardíaca sistólica y diastólica. La función cardíaca izquierda y derecha están estrechamente relacionadas, lo que se refleja en la interdependencia ventricular. Por lo tanto, el registro de la función biventricular en el mismo animal es importante para obtener una evaluación completa de la función cardíaca. En este protocolo, se adopta un enfoque de tórax cerrado para el cateterismo cardíaco consistente con la forma en que se realiza el cateterismo en los pacientes en ratones. Si bien es un desafío, la estrategia de tórax cerrado es un enfoque más fisiológico, porque abrir el tórax da como resultado cambios importantes en la precarga y la poscarga que crean artefactos, sobre todo una caída en la presión arterial sistémica. Si bien la ecocardiografía de alta resolución se utiliza para evaluar a los roedores, el cateterismo cardíaco es invaluable, particularmente cuando se evalúan las presiones diastólicas en ambos ventrículos.

Aquí se describe un procedimiento para realizar bucles invasivos, de tórax cerrado, secuenciales de presión-volumen (VP) ventricular izquierdo y derecho en el mismo animal. Los bucles fotovoltaicos se adquieren mediante tecnología de admisión con un catéter de presión-volumen de ratón y un sistema de adquisición de presión-volumen. Se describe el procedimiento, comenzando con la disección del cuello, que es necesaria para acceder a la vena yugular derecha y a la arteria carótida derecha, hasta la inserción y posicionamiento del catéter, y finalmente la adquisición de datos. A continuación, se analizan los criterios necesarios para garantizar la adquisición de bucles fotovoltaicos de alta calidad. Finalmente, se describe brevemente el análisis de los asas de PV de los ventrículos izquierdo y derecho y los diferentes parámetros hemodinámicos disponibles para cuantificar la función ventricular sistólica y diastólica.

Introducción

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades cardíacas son la principal causa de muerte en todo el mundo, tanto en hombres como en mujeres ^1,2,3. Muchos estudios se centran en el diagnóstico y la mejora de la función cardíaca deteriorada⁴. Para estas aplicaciones, es fundamental una evaluación de alta calidad y reproducible de la función cardíaca. Se requieren datos de catéter de alta fidelidad y reproducibles para evaluar las respuestas etiológicas y terapéuticas. Por ejemplo, la evaluación de la función cardíaca es esencial para evaluar la eficacia de fármacos y otros tratamientos en modelos preclínicos de infarto de miocardio⁵. Si bien muchos estudios cardiovasculares se centran en la función ventricular izquierda, la función ventricular derecha también es un determinante crítico de la capacidad funcional y el pronóstico en pacientes con enfermedad vascular pulmonar ^6,7. En pacientes con insuficiencia cardíaca avanzada, las presiones de llenado del lado derecho e izquierdo persistentemente elevadas son predictivas del riesgo combinado de muerte, hospitalización cardiovascular y trasplante cardíaco⁸. En la valvulopatía combinada aórtica y mitral, la función miocárdica preoperatoria (reflejada en parámetros como el índice cardíaco y la fracción de eyección del ventrículo izquierdo) es el principal predictor de supervivencia a largo plazo⁹. La función ventricular derecha es el principal predictor de morbimortalidad en la hipertensión arterial pulmonar^10,11. Por lo tanto, la evaluación de la función ventricular derecha es un componente necesario de un estudio preclínico integral que utilice modelos de hipertensión arterial pulmonar^12,13,14.

La función ventricular izquierda y derecha a menudo se estudian de forma independiente. Sin embargo, debido a que las funciones de los ventrículos izquierdo y derecho están íntimamente ligadas, es ideal obtener una evaluación biventricular de la función sistólica y diastólica a partir de una sola prueba¹⁵. Por ejemplo, el ventrículo derecho comparte fibras oblicuas en el tabique interventricular con el ventrículo izquierdo, lo que constituye uno de los enlaces mecánicos entre la función contráctil del ventrículo izquierdo y derecho^16,17. Este fenómeno, conocido como interacción ventricular sistólica, permite que la contracción del ventrículo izquierdo aumente la contracción del ventrículo derecho. Las interacciones ventriculares durante la diástole también son importantes. Durante la diástole, el volumen de un ventrículo influye en el volumen del ventrículo opuesto y, por lo tanto, altera la distensibilidad diastólica y la precarga^18,19. En condiciones patológicas, la disminución de la función de un ventrículo o la alteración de la carga de volumen pueden afectar directa o indirectamente la función del otro ventrículo²⁰. Como consecuencia de la interacción sistólica ventricular, una disminución global de la función ventricular izquierda puede reducir el rendimiento contráctil del ventrículo derecho¹⁵. En pacientes con insuficiencia cardíaca debido a la función sistólica del ventrículo izquierdo y al aumento de la presión diastólica final, la presión de la arteria pulmonar está elevada, aumentando indirectamente la poscarga del ventrículo derecho^21,22. Por el contrario, el aumento de la presión ventricular derecha y la sobrecarga de volumen en la hipertensión pulmonar grave ejercen una compresión mecánica sobre el corazón izquierdo. Este aplanamiento en forma de D del ventrículo izquierdo, causado por un desplazamiento hacia la izquierda del tabique interventricular, reduce los volúmenes del ventrículo izquierdo y altera la función sistólica y diastólica 23,24,25,26,27. Por lo tanto, la evaluación de los ventrículos izquierdo y derecho es esencial para evaluar la función cardíaca global en modelos preclínicos de enfermedad humana.

La función cardíaca también puede ser evaluada mediante ecocardiografía no invasiva, resonancia magnética (RM) y cateterismo invasivo^28,29,30. La ecocardiografía es la modalidad de imagen más utilizada en la investigación cardiovascular, ya que es relativamente barata y accesible³¹. Sin embargo, la ecocardiografía tiene varias limitaciones técnicas, incluida la medición indirecta de la presión de llenado y la capacidad limitada para cuantificar la función diastólica. Además, la calidad de los datos obtenidos por ecocardiografía depende en gran medida del operador. La resonancia magnética cardíaca es una adición relativamente nueva al arsenal de imágenes preclínicas que tiene un gran potencial para la evaluación cuantitativa de la función biventricular. La cuantificación con RM cardíaca es precisa, ya que no hace suposiciones geométricas de la forma ventricular, a diferencia de la ecocardiografía³². Sin embargo, la plataforma de imágenes de resonancia magnética es costosa y rara vez está disponible. Además, el procesamiento de los datos de resonancia magnética requiere el apoyo de un físico o científico equivalente, lo que falta en muchos laboratorios preclínicos³³. Del mismo modo, el uso de la microtomografía computarizada (MicroTC) en estudios preclínicos proporciona datos anatómicos cuantitativos tridimensionales (3D) de alta resolución que pueden obtenerse de forma no invasiva, lo que permite realizar estudios longitudinales³⁴. Sin embargo, las imágenes de MicroCT requieren la inyección de agentes de contraste, que a menudo son costosos. La plataforma de imágenes MicroCT, al igual que la resonancia magnética, también es costosa y también requiere un técnico calificado.

Por el contrario, el cateterismo es una técnica invasiva que consiste en la introducción de un catéter en el ventrículo derecho y/o izquierdo para medir la presión y/o el volumen. Las herramientas necesarias para realizar el cateterismo cardíaco no son tan costosas como la ecocardiografía, la tomografía computarizada o la resonancia magnética. Sin embargo, se requiere una competencia técnica sustancial para el cateterismo y la anestesia de animales pequeños. El cateterismo permite realizar evaluaciones directas y precisas de la función cardíaca²⁸. En este protocolo, se utiliza un catéter VP de admisión para evaluar la función cardíaca. Esta tecnología, basada en las distintas propiedades de conductancia eléctrica de la sangre y el músculo cardíaco, permite el registro simultáneo de la presión y el volumen dentro de la cavidad cardíaca y la generación de bucles fotovoltaicos en tiempo real ^5,35. Brevemente, el catéter se compone de electrodos de excitación y electrodos de registro. Los electrodos de excitación generan un campo eléctrico dentro del ventrículo derecho o izquierdo. El electrodo de registro interno mide el cambio de voltaje, que es proporcional a un cambio en la resistencia. La derivación del volumen ventricular se basa en la ley de Ohm (voltaje = corriente x resistencia) a partir de la cual se calcula la conductancia (es decir, la inversa de la resistencia). En este entorno, el valor de conductancia medido es una combinación de conductancia sanguínea y conductancia muscular. En el campo eléctrico, la sangre es puramente resistiva, mientras que el músculo tiene propiedades capacitivas y resistivas. La propiedad capacitiva del músculo provoca un retardo de tiempo en la señal medida. El seguimiento de este retraso, conocido como ángulo de "fase", informa de la intrusión del tejido cardíaco en el campo a medida que el corazón se contrae. Esta medida es mayor en la sístole y más baja en la diástole. Esta propiedad permite la separación del componente muscular de la conductancia del de la sangre y permite una aproximación cercana de los volúmenes sistólicos y diastólicos absolutos. Los asas de presión-volumen proporcionan una serie de parámetros hemodinámicos que no se pueden medir fácilmente con otros métodos, como el cateterismo retrógrado simple mediante catéteres llenos de líquido para medir las presiones cardíacas. Los bucles de presión-volumen miden las presiones ventriculares, pero también proporcionan datos sobre la contractilidad, la elastancia, la potencia, la energía y la eficiencia. Además, los bucles fotovoltaicos proporcionan mediciones cuantitativas sólidas³⁶. Por lo tanto, la evaluación de la función cardíaca mediante bucles VP generados por el cateterismo se ha convertido en el estándar de oro en la investigación preclínica³⁷. Además, las técnicas preclínicas son relevantes para las enfermedades humanas en las que el cateterismo cardíaco, aunque con catéteres llenos de líquido, es común. Sin embargo, el cateterismo cardíaco en roedores requiere una anestesia impecable y una excelente técnica para evitar la pérdida excesiva de sangre, la hipoventilación o los cambios en la temperatura corporal.

En pacientes humanos, el cateterismo cardíaco se realiza en configuración torácica cerrada y el acceso vascular se logra a través de la vena yugular o subclavia para el ventrículo derecho y la arteria radial o femoral para el ventrículo izquierdo. Debido al pequeño tamaño de los ratones, el enfoque de tórax cerrado suele ser un desafío. Por lo tanto, los estudios realizados en ratones suelen adoptar un enfoque de tórax abierto. Esta técnica consiste en abrir el tórax, exponiendo así el corazón, y facilitando la inserción del catéter mediante punción del ápex ventricular izquierdo y/o derecho³⁸. Si bien este enfoque es técnicamente menos desafiante y bastante reproducible, sus principales limitaciones incluyen hemorragia y otras complicaciones de la inserción apical de catéteres, y una marcada caída en la presión intracardíaca como resultado de la apertura de la cavidad torácica a la presión atmosférica. La apertura del tórax en un roedor ventilado induce una disminución de 5-10 mm Hg en la presión sistólica del ventrículo izquierdo y una disminución de 2-5 mm Hg en la presión ventricular derecha³⁹. Por lo tanto, se desarrolló un abordaje de tórax cerrado que es menos traumático para el corazón y produce mediciones fisiológicamente más relevantes que se traducen más fácilmente a la evaluación clínica de la función cardíaca.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices éticas y de bioseguridad de la Queen's University (ROMEO/TRAQ#6016826). Los procedimientos seguidos se realizaron de acuerdo con los lineamientos institucionales. Se trata de un procedimiento terminal. Debido a la invasividad del cateterismo derecho e izquierdo, los animales deben ser sacrificados inmediatamente después de la adquisición de los datos. La eutanasia debe realizarse de acuerdo con las directrices de estudios con animales de la institución.

1. Preparación y puesta en marcha experimental

1. Colocar el catéter en una jeringa de 10 mL con solución salina/heparina, a temperatura ambiente 30 min antes de comenzar el experimento (Figura 1A).
2. Después de 30 minutos, calibre el catéter (p. ej., línea de base y sistema de adquisición) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El sistema de adquisición muestra valores de calibración altos y bajos que se utilizan para calibrar el sistema de adquisición antes de iniciar un experimento. Genere estos valores y asegúrese de que coincidan.
   1. Utilice el botón "Control de equilibrio de presión", "Grueso +/- " o "Fino +/-" para configurar el valor de presión de referencia en cero.
   2. Realice una calibración de dos puntos para la señal alta y baja.
      1. En la consola de control, presione "Configuración del sistema" en el "Menú del catéter".
      2. Presione "Enviar señal de calibración" en el "Menú de configuración del sistema" para enviar la señal baja. Asegúrese de que la presión, el volumen, la fase y la magnitud estén en 0 mm Hg, 0 μL, 0° y 0 μs respectivamente.
      3. Presione "Enter" para enviar la señal alta. Asegúrese de que la presión, el volumen, la fase y la magnitud estén a 100 mm Hg, 150 μL, 20° y 5.000 μs respectivamente.
      4. Presione "Enter" para volver al "Menú de configuración del sistema".
      5. Presione "6" para volver al "Menú de catéteres". A continuación, pulse "Adquirir datos".
3. Dobla una aguja de 30 G a aproximadamente 90° (Figura 1B, C). Esta aguja doblada se utilizará para perforar los vasos yugulares y carotídeos.

2. Anestesia y control de la temperatura corporal

1. Colocar el ratón (28 g, C57BL/6 en este protocolo) en una cámara de anestesia que contenga gas anestésico (es decir, oxígeno al 100%, isoflurano al 3-4% para la inducción).
2. Cuando el animal esté anestesiado, sin responder al pellizco de la pata o la cola, coloque el ratón en decúbito supino sobre la almohadilla térmica ajustada a 37 °C.
3. Conecte el ratón al respirador a través de un cono nasal que proporcione una mezcla de 100% de oxígeno y 2% de isoflurano. Para calcular automáticamente los ajustes de ventilación recomendados, introduzca el peso del animal en el software patentado del respirador mediante la pantalla táctil. Los cálculos utilizan la siguiente fórmula:
   Volumen corriente = 6,2 x masa animal^1,01 (kg),
   Frecuencia respiratoria = 53,5 x masa ^animal-0,26 (kg).
4. Abra la línea anestésica desde la cámara de anestesia hasta el cono de la nariz.
5. Inserte la sonda de retroalimentación de temperatura en el recto y la sonda de la almohadilla entre la almohadilla y la parte posterior del mouse, ajustando la temperatura corporal deseada a 37 °C a 37,5 °C. Controle la temperatura del animal en la pantalla del monitor (Figura 2A, B).
6. Pegue con cinta adhesiva las patas delanteras y una pata distal del ratón a la manta térmica con cinta quirúrgica, dejando una pata trasera libre para controlar la profundidad de la anestesia.

3. Acceso al sitio quirúrgico

1. Realizar una incisión cervical ventral en forma de H de 2 cm desde el manubrio hasta el nivel del hueso hioides.
   1. Refleja la piel lejos de los músculos subyacentes. Si es necesario, estos músculos se pueden extirpar para una mejor visualización.
   2. Mueve suavemente la glándula submandibular hacia un lado.
   3. Diseccionar el tejido blando cervical y exponer el esternocleidomastoideo y el músculo esternohioideo con fórceps utilizando el método de disección roma.
   4. Divide la fascia por la mitad, superponiendo el esternohioides pareado. Permita que el esternohioideo emparejado se retraiga lateralmente para exponer la tráquea. Tenga cuidado de no dañar las arterias carótidas y los nervios vagos, que corren a lo largo de la tráquea.
2. Pase unas pinzas por debajo de la tráquea para elevarla. Luego, pase una sutura de seda quirúrgica 4.0 por debajo de la tráquea y haga un posible nudo en el medio de la sutura, que luego se apretará para asegurar el tubo endotraqueal (Figura 3A).
3. Con unas tijeras, haga un pequeño corte entre los anillos de cartílago de la tráquea por debajo del nivel de la laringe. Inserte el tubo endotraqueal (Figura 3B).
4. Conecte el tubo de traqueostomía al respirador y comience la ventilación con oxígeno al 100% e isoflurano al 2%. Apriete el nudo alrededor de la tráquea para asegurar el tubo endotraqueal y pegue el tubo del respirador a la mesa de operaciones. Asegúrese de que la tráquea no esté obstruida ni colapsada (Figura 3C).

4. Aislamiento de la yugular derecha y de la carótida derecha

1. Aislamiento de la carótida derecha
   1. Usando una disección roma, desplazar el músculo esternohioideo lateralmente para exponer y aislar la arteria carótida derecha.
   2. Aislar la arteria carótida del nervio vago mediante disección roma con fórceps.
   3. Pasar tres suturas quirúrgicas (4.0) por debajo de la arteria carótida, excluyendo el nervio vago.
2. Aislamiento de la vena yugular derecha
   1. Desplazar lateralmente la glándula submandibular y la glándula parótida para visualizar la vena yugular derecha. Diseccionar y exponer sin rodeos la vena yugular derecha con fórceps. Disecciona cuidadosamente la vena y retira la fascia circundante.
   2. Pase las pinzas por debajo de la vena yugular.
   3. Pase una sutura quirúrgica por debajo de la vena yugular y luego átela en el lado craneal de la vena. Aplique una tracción suave sobre esta sutura en la dirección de la cabeza con una pinza hemostática.
   4. Pase dos suturas adicionales por debajo de la vena yugular. Tire suavemente de la sutura más distal en dirección caudal con una pinza hemostática. Haz un nudo suelto en la sutura central.
   5. Coloque varias gotas de solución salina fisiológica tibia en el vaso sanguíneo en el sitio de la venotomía anticipada.

5. Procedimientos quirúrgicos para el cateterismo ventricular derecho y ventricular izquierdo

1. cateterismo ventricular derecho (Figura 4 A-D).
   1. Con el microscopio estereoscópico, identifique la vena yugular.
   2. Aplique suavemente una tracción superior en la vena. Realizar una venotomía insertando una aguja curva de 30 G entre la sutura craneal y la sutura media. Inserte la aguja en un ángulo de 140° con respecto a la vena para asegurarse de que entre de manera coaxial.
   3. Cuando se inserte, dilate la venotomía moviendo la aguja. Inserte la punta del catéter en la venotomía, debajo de la aguja. A continuación, ate suavemente la sutura central, asegurando el catéter.
      NOTA: Tenga mucho cuidado de no atar la sutura con demasiada fuerza, ya que el exceso de fuerza puede dañar el catéter.
   4. Liberar la sutura caudal y hacer avanzar el catéter hacia el ventrículo derecho, detectando la forma de onda clásica de presión del ventrículo derecho en un monitor continuo.
   5. Estabilizar la presión del ventrículo derecho. Asegurar la correcta colocación del catéter en el ventrículo derecho para generar un asa VP óptima.
      1. Estabilizar la magnitud, que refleja la sangre y el músculo, para generar bucles presión-magnitud (es decir, presión del eje Y, magnitud del eje X). Si es necesario, gire suavemente el eje del catéter para lograr una colocación óptima del catéter a lo largo del eje del ventrículo derecho.
         NOTA: El valor máximo de fase, que refleja el músculo, debe ser inferior a 7°.
   6. Cuando la señal de bucle de presión-magnitud sea óptima, presione "Enter" en la consola durante la adquisición para realizar un escaneo de línea de base. Asegúrese de que la frecuencia cardíaca informada en la pantalla del monitor en latidos por minuto (lpm) esté en un rango fisiológico (es decir, 400-600 lpm).
   7. Genere los bucles fotovoltaicos. Cambie "Magnitud" a "Volumen" como parámetro para el eje X y mantenga la presión como eje Y. Cuando la señal de bucles fotovoltaicos sea óptima, registre durante 30 s.
   8. Detenga la grabación. Retire el catéter y límpielo suavemente con una gasa. Coloque el catéter en una solución de heparina/cloruro de sodio y ate la sutura caudal para detener el sangrado de la vena yugular.
2. Cateterismo ventricular izquierdo (Figura 5 A-D).
   1. Eleve suavemente la carótida derecha, que previamente estaba aislada (5A) deslizando pinzas curvas por debajo de la arteria.
   2. Amarre la sutura anterior, ocluyendo así la arteria. A continuación, aplique suavemente la tracción dirigida cranealmente con una pinza hemostática.
   3. Tire de la sutura más distal en dirección caudal con una pinza hemostática. Haz un nudo potencial suelto en la sutura central.
   4. Coloque varias gotas de solución salina fisiológica tibia en el vaso sanguíneo en el sitio de la arteriotomía prevista. Concéntrese en la sección craneal, entre la sutura caudal y la sutura media, utilizando el microscopio estereotáxico.
   5. Aplique suavemente una tracción superior en la arteria. Realizar una arteriotomía, insertando una aguja curva de 30 G entre la sutura craneal y la sutura media. Inserte la aguja a 140° con respecto a la arteria para asegurarse de que entre de manera coaxial.
   6. Inserte la punta del catéter en la arteriotomía y luego apriete la sutura central para asegurar el catéter. Simultáneamente, suelte la sutura distal y avance el catéter hacia la aorta para comenzar a grabar. Asegúrese de que el canal de presión muestre un trazo típico de la aorta.
   7. Hacer avanzar el catéter retrógrado a través de la válvula aórtica hasta el ventrículo izquierdo. La entrada en el ventrículo izquierdo será evidente por la caída repentina y marcada de la presión diastólica de la aorta.
   8. Estabilizar la presión del ventrículo izquierdo. Asegurar la correcta colocación del catéter en el ventrículo izquierdo para generar un asa VP óptima.
      1. Estabilizar la magnitud, que refleja la sangre y el músculo, para generar bucles presión-magnitud (es decir, presión del eje Y, magnitud del eje X). Si es necesario, gire suavemente el eje del catéter para lograr una colocación óptima del catéter a lo largo del eje del ventrículo izquierdo.
         NOTA: El valor máximo de fase, que refleja el músculo, debe ser inferior a 7°.
   9. Detenga la grabación. Retire el catéter y colóquelo en una solución de heparina/cloruro de sodio. A continuación, ata la sutura caudal.
   10. Limpie el catéter con un detergente enzimático (por ejemplo, endozima).
       NOTA: Después de la cirugía, eutanasiar al animal de acuerdo con las pautas de estudios con animales de la institución. 

6. Análisis de datos

1. Realizar el análisis del bucle fotovoltaico de acuerdo con las recomendaciones establecidas.
   1. Seleccione la traza de presión-volumen óptima (idealmente un registro completo y estable de 30 s). En el software, haga clic en "Avanzar", haga clic en "Bucles" y luego haga clic en "Cálculo fuera de línea".
   2. Seleccione el volumen como canal de volumen y la presión como canal de presión.
   3. Para obtener resultados consistentes, se necesita un mínimo de 20 bucles.

Resultados

El catéter se colocó en una jeringa de 10 mL que contenía una solución de suero fisiológico heparinizado a temperatura ambiente 30 min antes del cateterismo (Figura 1A). Se dobló una aguja de 30 G ~90° (Figura 1B, C) y se preparó una cánula de traqueotomía de 1,45 mm de diámetro (Figura 1C).

El mantenimiento de la temperatura corporal fisiológica es fundamental. El ratón fue atado con cinta adhesiva y conectado al respirador a través de un cono nasal. La sonda de retroalimentación se colocó entre la almohadilla y la parte posterior del mouse. Se insertó una sonda rectal para monitorear la temperatura corporal del animal (Figura 2A). Se monitorizaron la temperatura corporal (37,1 °C) y la temperatura de la almohadilla (40,7 °C) (Figura 2B).

Las fotografías de los pasos críticos del procedimiento de intubación se muestran en la Figura 3A-C. La intubación exitosa y sin obstrucciones dio como resultado una frecuencia respiratoria regular con presión máxima estable (Figura 2B).

En la Figura 4D se muestran imágenes de los pasos críticos del cateterismo cardíaco derecho, desde el aislamiento de la vena yugular (Figura 4A-C) hasta la inserción del catéter en la vena yugular. La figura 5 muestra los pasos críticos del cateterismo cardíaco izquierdo, incluido el aislamiento de la arteria carótida derecha (Figura 5 A, B) y la inserción del catéter (Figura 5 C, D)

El catéter se introdujo en la vena yugular y avanzó hasta el ventrículo derecho. A continuación, se estabilizó la presión del ventrículo derecho y se verificó la posición correcta. Todos los electrodos del catéter (de 6 mm de longitud de eje) debían estar dentro de las cámaras del ventrículo derecho y no en contacto con las paredes del ventrículo. El posicionamiento óptimo del catéter, como se representa esquemáticamente en la Figura 6A , generó bucles PV óptimos (es decir, triangulares, regulares). El posicionamiento incorrecto como se representa esquemáticamente en la Figura 6B (es decir, el contacto con la pared ventricular) dará como resultado bucles fotovoltaicos defectuosos (es decir, bucles colapsados e irregulares).

El catéter se introdujo en la carótida, avanzó hacia la aorta y luego avanzó retrógrado a través de la válvula aórtica hasta el ventrículo izquierdo. Se estabilizó la presión ventricular izquierda y se verificó la posición derecha. Todos los electrodos del catéter (de 6 mm de longitud de eje) deben estar dentro de las cámaras del ventrículo izquierdo y no en contacto con las paredes del ventrículo. La posición óptima del catéter, como se representa esquemáticamente en la Figura 6C , generó asas PV óptimas (es decir, rectangulares, regulares). El posicionamiento incorrecto como se representa esquemáticamente en la Figura 6D (es decir, el contacto con la pared ventricular) dio como resultado bucles fotovoltaicos defectuosos (es decir, bucles colapsados, no rectangulares e irregulares).

La hemodinámica representativa generada por los asas VP izquierda y derecha mostró una frecuencia cardíaca de 410 lpm, un gasto cardíaco de 9.107 μL/min y un volumen sistólico de 24,5 μL. Los parámetros específicos del ventrículo derecho mostraron una presión sistólica del ventrículo derecho de 21,9 mm Hg, una presión diastólica final del ventrículo derecho de 1,049 mm Hg, una fracción de eyección del 56,1%, dp/dt máx. de 1.469 mm Hg/s, dp/dt máx. de -1.504 mm Hg/s, volumen diastólico final de 38,4 μL, trabajo al brazo de 0,068 mJ, área de presión-volumen de 0,089 mJ, elastancia arterial pulmonar (Ea) de 0,83 mm Hg/μL y factor Tau de 12,8 ms. Los parámetros específicos del ventrículo izquierdo mostraron una presión sistólica del ventrículo izquierdo de 77,1 mm Hg, presión diastólica final del ventrículo izquierdo de 2,33 mm Hg, fracción de eyección del 59,1%, dp/dt máx. de 4.695 mm Hg/s, dp/dt máx. de -3.553 mm Hg/s, volumen diastólico final de 36,9 μL, trabajo sistólico de 0,14 mJ, área presión-volumen de 0,22 mJ, elastancia arterial (Ea) de 5,37 mm Hg/μL, y factor Tau de 15,1 ms (Tabla 1).

Parámetros hemodinámicos
RRHH (BPM)	410,6 ± 23,3
CO (μL/min)	9107 ± 1016
SV (μL)	24,5 ± 2,3
Función RV
RVSP (mmHg)	21,9 ± 2,15
RVEDP (mmHg)	1,042 ± 0,12
FE (%)	56.1 ± 4.4
dP/dt máx. (mmHg/s)	1469 ± 170
dP/dt máx. (- mmHg/s)	1504 ± 215
EDV (μL)	38,4 ± 3,7
SW (mJoules)	0,068 ± 0,008
PVA (mJoules)	0,084 ± 0,009
Ea (mmHg/μL)	0,83 ± 0,09
Factor Tau (ms)	12,8 ± 0,8
Función LV
LVSP (mmHg)	77,1 ± 2,4
LVEDP (mmHg)	2,33 ± 0,17
FE (%)	59,1 ± 3,6
dP/dt máx. (mmHg/s)	4695 ± 355
dP/dt máx. (- mmHg/s)	3553 ± 373
EDV (μL)	36,9 ± 4,8
SW (mJoules)	0,14 ± 0,013
PVA (mJoules)	0,22 ± 0,03
Ea (mmHg/μL)	5,37 ± 0,9
Factor Tau (ms)	15.07 ± 1.7
CO: gasto cardíaco; Ea: elastancia arterial; EDV: volumen diastólico final; FC: frecuencia cardíaca; DPVI: volumen diastólico final del ventrículo izquierdo; LVSP: presión sistólica del ventrículo izquierdo; PVA: área de volumen de presión; RVEDP: presión diastólica final del ventrículo derecho; RVSP: presión sistólica del ventrículo derecho; SV: volumen sistólico; SW, trabajo de trazo; Factor Tau, Tau Mirsky. N= 6 ratones. Los valores se expresan ± SEM

Tabla 1: Tabla de parámetros hemodinámicos. Parámetro hemodinámico de los ventrículos izquierdo y derecho medido en seis ratones.

Figura 1: Preparación y configuración experimental. (A) Catéter en jeringa de 10 ml de solución salina/heparina, (B), (C) aguja de 30 G doblada a aproximadamente 90°, (D) cánula de traqueotomía, 1,45 mm de diámetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Anestesia, control de la temperatura corporal . (A) Ratón con tres patas pegadas con cinta adhesiva, conectado al respirador a través de un cono nasal, con retroalimentación y sondas rectales insertadas. Tenga en cuenta que la almohadilla térmica está debajo de la manta quirúrgica. (B) Control del monitor de temperatura que muestra la temperatura del cuerpo (rectal) y de la almohadilla (retroalimentación) y los parámetros de ventilación: frecuencia respiratoria (RR establecido), volumen corriente medio (Meas TV), presión máxima (PeakPress) y ventilación minuto (MinVol). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Procedimiento de intubación. (A) La piel fue arrancada y cortada. La glándula submandibular se apartó suavemente. El esternocleidomastoideo y el músculo esternohioideo se separaron y luego se pasaron fórceps por debajo de la tráquea, utilizando una disección suave y roma. (B) Se pasó seda quirúrgica (4.0) por debajo de la tráquea y se hizo un pequeño corte anterior entre dos anillos de cartílago de la tráquea. Se insertó la traqueostomía y se le ató la traqueotomía. (C) El tubo de traqueostomía se conectó al ventilador y la sutura se ató alrededor del tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Cateterismo ventricular derecho. (A), (B), (C) Se aisló la vena yugular derecha, luego se pasó una sutura quirúrgica por debajo y se ató en el lado craneal de la vena. Sobre esta sutura se aplicó una tracción suave en la dirección de la cabeza mediante una pinza hemostática. Se pasaron dos suturas adicionales distalmente, por debajo de la vena yugular. La sutura más distal se tiró suavemente en dirección caudal mediante pinza hemostática. Se hizo un nudo suelto en la sutura central. (D) El catéter se insertó en la vena yugular, la sutura media se ató al catéter. Las imágenes de (C) y (D) se amplían a través de un microscopio estereoscópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Cateterismo ventricular izquierdo. (A), (B) Se aisló la carótida derecha, luego se pasó una sutura quirúrgica por debajo de la vena yugular y se ató en el lado craneal de la vena. Sobre esta sutura se aplicó una tracción suave en la dirección de la cabeza mediante una pinza hemostática. Se pasaron dos suturas adicionales por debajo de la arteria carótida. La sutura más distal se tiró suavemente en dirección caudal con una pinza hemostática. Se hizo un nudo suelto en la sutura central. (C) La punta del catéter se insertó en la arteria carótida y luego la sutura central se ató al catéter para asegurarla. (D) El catéter se avanzó suavemente hacia atrás por la carótida hacia la aorta. Las imágenes de (B), (C), (D) se amplían a través de un microscopio estereoscópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Representación esquemática de la posición del catéter y los bucles de PV resultantes. (A) Posicionamiento óptimo del catéter en el ventrículo derecho. La punta del catéter se encuentra en el centro del ventrículo, aislada de las paredes del ventrículo. Asas VP representativas resultantes de una posición óptima del catéter en el ventrículo derecho (es decir, estable, triangular). (B) Colocación incorrecta del catéter en el ventrículo derecho. La punta del catéter está en contacto con las paredes ventriculares. Ruido representativo de bucles VP que resulta de una posición subóptima del catéter en el ventrículo derecho (es decir, colapsado, irregular). (C) Posicionamiento óptimo del catéter en el ventrículo izquierdo. La punta del catéter se encuentra en el centro del ventrículo, aislada de las paredes del ventrículo. Asas VP representativas resultantes de la posición óptima del catéter en el ventrículo izquierdo (es decir, estable, rectangular). (D) Colocación incorrecta del catéter en el ventrículo izquierdo. La punta del catéter está en contacto con las paredes ventriculares. Asas VP representativas resultantes de una posición subóptima del catéter en el ventrículo izquierdo (es decir, colapsada, irregular). Se aplicó un filtro de ruido FIR de 50 Hz para generar los bucles fotovoltaicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La evaluación de la función cardíaca es un paso crítico para la investigación cardiovascular y pulmonar-vascular preclínica. En este trabajo, propusimos un protocolo para una evaluación biventricular a tórax cerrado de la función cardíaca en ratones. A través de este enfoque, se pueden generar los bucles PV del ventrículo derecho y del ventrículo izquierdo en el mismo ratón. Este enfoque proporciona una evaluación robusta y completa de la función cardíaca, lo que permite medir la función sistólica y diastólica, así como el volumen sistólico y el gasto cardíaco. A diferencia del abordaje de tórax abierto que se utiliza clásicamente para el cateterismo de roedores, esta técnica de tórax cerrado da como resultado una fisiología más estable y datos fisiológicamente más relevantes. Si bien técnicamente es más desafiante y depende de las habilidades del operador para colocar con éxito el catéter en el ventrículo derecho e izquierdo, el enfoque de tórax cerrado limita el trauma y la hemorragia asociados con la cirugía de tórax abierto y reduce los cambios drásticos de presión asociados con la exposición de los pulmones a la presión atmosférica. El abordaje a tórax cerrado también emula mejor el procedimiento de cateterismo cardíaco realizado en los pacientes, lo que aumenta la relevancia del uso de esta técnica en la investigación preclínica.

El procedimiento quirúrgico es el paso crítico del protocolo. Incluso cuando se utiliza un microscopio quirúrgico para la inserción de un catéter en la vena yugular o la arteria carótida, que se recomienda, este procedimiento requiere práctica y habilidad técnica. La disección cuidadosa de los vasos libres de la fascia circundante por medio de una disección suave y roma aumentará el éxito de la canulación al tiempo que minimizará el riesgo de hemorragia. Para minimizar la pérdida de sangre, es crucial canular la carótida en pasos secuenciales: 1) introducir la punta del catéter en la arteria carótida; 2) atar suavemente la sutura alrededor de la parte de la arteria que contiene el catéter; 3) soltar la sutura segura, permitiendo el movimiento del catéter mientras se mantiene una suave tracción hacia arriba para minimizar el sangrado; y 4) avanzar el catéter hasta la aorta. La colocación del catéter en el ventrículo, según lo determinado por la monitorización de la forma de onda en tiempo real, es la parte más difícil de este protocolo. Todos los electrodos del catéter deben estar dentro de la cavidad ventricular y ninguno debe tocar la pared. Cualquier colocación incorrecta del catéter dará lugar a bucles de PV irregulares y afectará negativamente o impedirá la adquisición de datos. Reconocer la forma de onda característica de presión-volumen que resulta de tener todos los electrodos dentro del ventrículo permite estar seguro de una posición adecuada del catéter. Es fundamental obtener una forma de onda de presión ventricular estable y bucles estables de presión-magnitud antes de cambiar al modo fotovoltaico y la adquisición de volumen. El conocimiento adecuado de la fisiología y anatomía cardíaca es esencial para el éxito de este procedimiento. La lectura en línea de los trazos de la VP, de la aurícula, el área de la válvula tricúspide y el ventrículo derecho, mostrará el avance del catéter y ayudará a lograr un posicionamiento adecuado. Es fundamental conocer la frecuencia cardíaca normal (400-600 lpm) y las formas de onda y presiones esperadas (p. ej., presión sistólica del ventrículo derecho, 18-25 mm Hg, presión diastólica <5 mm Hg; presión sistólica del ventrículo izquierdo 60-120 mm Hg⁴⁰, presión diastólica <8 mmHg) en ratones para permitir al operador evaluar la veracidad de los datos observados.

La calidad y reproducibilidad de los datos dependerá de la rapidez del procedimiento y de la pérdida de sangre o hemorragia. El procedimiento, desde la anestesia hasta la finalización de la adquisición de datos, tarda una media de ~30-40 minutos/ratón. El cateterismo cardíaco derecho desde la inserción del catéter hasta la adquisición de datos tarda de 5 a 10 minutos, el cateterismo cardíaco izquierdo desde la inserción del catéter hasta la adquisición de datos tarda otros 10 a 15 minutos. Los datos de calidad de publicación se obtienen en ~75% de los casos. La secuencia de pasos en el cateterismo cardíaco debe mantenerse constante entre los animales. En este procedimiento, primero se intuba a los ratones, seguido del cateterismo ventricular derecho y, finalmente, del cateterismo ventricular izquierdo. La decisión de proceder en este orden se basa en la mayor dificultad y riesgo de sangrado del cateterismo cardíaco izquierdo en comparación con el derecho. Se puede observar un artefacto de grabación de ruido inespecífico de 50 Hz. Este ruido podría reducirse utilizando un filtro FIR con un corte alto a 50 Hz y un corte bajo de 0 en el software. Para el canal de volumen, cree un nuevo canal/filtro/filtro FIR. También se podría aplicar un filtro de muesca de 50 Hz durante la adquisición de datos para eliminar el ruido de la red y eliminar cualquier interferencia de radiofrecuencia.

Cuanto más rápido se realice el cateterismo, mejor será la calidad de los datos. En base a la experiencia previa, se recomienda adquirir los datos en un plazo de 15 minutos. El aumento del tiempo de cateterismo aumenta el estrés fisiológico del animal y aumenta el riesgo de arritmia debido a la presencia del catéter en la cavidad. Estas fuerzas pueden reducir el volumen sistólico y perjudicar la reproducibilidad e interpretabilidad de las formas de onda. Además, la punta del catéter es afilada y puede dañar o perforar el ventrículo. Esto es particularmente importante para el ventrículo derecho, que es ~ 1/^{3 del} grosor del ventrículo izquierdo.

La traqueostomía invasiva y la ventilación mecánica con presión positiva dan como resultado una respiración estable y controlada de los ratones y disminuyen la variabilidad de la adquisición de asas de PV. Sin embargo, la presión positiva al final de la espiración (PEEP, por sus siglas en inglés) es un marcado contraste con la ventilación normal, que es un fenómeno de presión negativa. Juntos, la ventilación con presión positiva y la PEEP disminuyen el gasto cardíaco y reducen la presión cardíaca derecha. Por lo tanto, si bien es necesario para la adquisición de datos estables, la ventilación mecánica, así como los efectos cardiodepresivos de la anestesia, afectarán los bucles de VP y deben considerarse como una limitación. La detención transitoria de la ventilación mecánica durante el breve registro de los bucles fotovoltaicos se utiliza para eliminar esta fuente potencial de artefactos. Tenga en cuenta que la eficiencia de la ventilación puede confirmarse mediante el monitoreo capnográfico del dióxido de carbono.

Las habilidades técnicas requeridas para el abordaje a pecho cerrado pueden ser una limitación de esta técnica. Del mismo modo, es difícil obtener una posición adecuada y estable del catéter en el ventrículo. Las probabilidades de éxito aumentan con la experiencia del operador y con el tamaño y peso de los ratones. El cateterismo de ratones por debajo de 20 g es extremadamente difícil. La geometría única de la cavidad del ventrículo derecho puede afectar la medición del volumen y debe tenerse en cuenta. El anestésico utilizado, la frecuencia cardíaca, la temperatura y la tensión del animal podrían afectar los parámetros hemodinámicos y deben ser cuidadosamente informados y monitoreados.

En conclusión, en este protocolo tanto el cateterismo ventricular derecho como el izquierdo se realizan en el mismo ratón. Dependiendo de los objetivos específicos del científico, el cateterismo ventricular izquierdo o derecho se puede realizar de forma independiente, utilizando la parte pertinente del procedimiento biventricular. Sin embargo, el enfoque presentado es óptimo para la evaluación completa de la función cardíaca.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de presión-volumen ADVantage (ADV500)	Transonic	FY097B
Endozime AW triple plus	Ruhof	34521
Fibra óptica doble Cuello de cisne Volpi	Intralux	# 6000-1
Pinzas	F.S.T	11052-10
Pinzas	F.S.T	11251-20
Esponjas de gasa	Dermacea	441400
Pinza hemostática	F.S.T	13003-10
Pinza hemostática	F.S.T	13018-14
Heparina sódica	Sandoz	023-3086	100 U/L
Catéter de admisión de alta fidelidad	Scisence; Transonic	FTH-1212B-3518
Isofluorano	Baxter	CA2L9108
labScribe v4 software	iworx	LS-30PVL
Aguja (calibre 30)	BD	305106
cloruro de sodio inyección	Baxter	JB1309M	0.9%(wt/vol)
Microscopio estereoscópico	Cole-Parmer	OF-48920-10
Sutura quirúrgica	SERAFLEX	ID158000	seda trenzada negra, 4.0
Cinta quirúrgica	3M, Transpore	SN770
Sistemas de anestesia de sobremesa para un solo animal	Aparato Harvard	72-6468
Cánula de traqueotomía de 1,45 mm de diámetro	Aparato Harvard	72-1410
Ventilador, almohadilla térmica de infrarrojo lejano para ratones y ratas PhysioSuite	Kent corporación científica	# PS-02