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Modelo de cardiopatía isquémica y comparación basada en vídeo de la contracción de cardiomiocitos utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSC

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DOI:

10.3791/61104

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5 de mayo de 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un modelo de cardiopatía isquémica utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos, junto con un método para la evaluación cuantitativa del daño tisular causado por la isquemia. Este modelo puede proporcionar una plataforma útil para la detección de fármacos y la investigación adicional sobre enfermedades cardíacas isquémicas.

Resumen

Las cardiopatías isquémicas son una causa importante de muerte en todo el mundo. Por lo tanto, ha sido objeto de una enorme cantidad de investigación, a menudo con modelos de animales pequeños como roedores. Sin embargo, la fisiología del corazón humano difiere significativamente de la del corazón de roedores, subrayando la necesidad de modelos clínicamente relevantes para estudiar enfermedades del corazón. Aquí, presentamos un protocolo para modelar la cardiopatía isquémica utilizando cardiomiocitos diferenciados de las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPS-CM) y para cuantificar el daño y deterioro funcional de los cardiomiocitos isquémicos. La exposición al 2% de oxígeno sin glucosa y suero aumenta el porcentaje de células lesionadas, que se indica mediante la tinción del núcleo con yoduro de propidium, y disminuye la viabilidad celular. Estas condiciones también disminuyen la contractilidad de los hiPS-CM confirmados por el análisis de campo vectorial de desplazamiento de imágenes de vídeo microscópicas. Además, este protocolo puede proporcionar un método conveniente para la detección personalizada de medicamentos al facilitar el uso de células hiPS de pacientes individuales. Por lo tanto, este modelo de cardiopatía isquémica, basado en iPS-CM de origen humano, puede proporcionar una plataforma útil para la detección de fármacos y la investigación adicional sobre enfermedades isquémicas del corazón.

Introducción

La cardiopatía isquémica (IHD) es reconocida en todo el mundo como la principal causa de muerte, y se estimó que fue responsable de más de nueve millones de muertes en 20161. La prevalencia de las enfermedades cardiovasculares sigue aumentando y la globalización parece haber contribuido a la prevalencia de factores de riesgo de enfermedades cardíacas en los países en desarrollo. Por lo tanto, el estudio de la IHD es cada vez más urgente2.

Los modelos experimentales de enfermedades cardiovasculares son fundamentales para estudiar los mecanismos de la enfermedad, la precisión del diagnóstico y el desarrollo de nuevas terapias. Varios modelos experimentales han sido propuestos por muchos laboratorios. Es de suma importancia elegir un modelo con ventajas significativas; viabilidad, repetibilidad y similitud con las enfermedades humanas son factores clave en la selección de los modelos de enfermedades cardiovasculares3. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (hiPSC) portadoras de mutaciones específicas asociadas a la cardiomiopatía son una alternativa prometedora a los modelos animales4. Aunque se han descrito muchas estrategias para inducir cardiomiocitos utilizando iPSCs5,6,7,,8,9, aquí proporcionamos un método simple para producir un modelo IHD utilizando cardiomiocitos diferenciados de hiPSCs, en el que no se aplica la laboriosa selección de cardiomiocitos usando marcadores. En este método, los cardiomiocitos se seleccionan funcionalmente mediante el análisis de la contracción espontánea.

La inducción de cardiomiocitos usando hiPSC evita el sacrificio animal y la cirugía técnicamente difícil. Establecer modelos animales de IHD requiere técnicas quirúrgicas desafiantes10. Es casi imposible simular perfectamente los diversos aspectos fisiopatológicos de las enfermedades cardíacas humanas, como la frecuencia cardíaca y los potenciales de acción de la fisiología de los roedores. Junto con la moral y la ética del uso de modelos animales, el desarrollo de nuevos modelos experimentales distintos de los modelos animales es imperativo. Los cardiomiocitos diferenciados de las células iPS humanas imitan mejor el estado fisiológico del corazón humano. En este protocolo, establecemos un modelo de IHD utilizando cardiomiocitos derivados de células hiPS (hiPS-CM). En nuestro modelo, la privación de oxígeno y glucosa conduce a una disminución en la fuerza contráctil y la viabilidad de los hiPS-CM. Nuestro método proporciona un nuevo enfoque para modelar IHD y demuestra una nueva plataforma para el estudio de esta enfermedad.

Protocolo

1. Cultivo de mantenimiento hiPSC

  1. Recubrir una placa de cultivo de seis pozos con laminina(Tabla de materiales).
    1. Diluir laminin a 0,5 g/ml en solución salina tamponada de fosfato (PBS).
    2. Añadir laminin diluido a una placa de seis pozos a un volumen de 2,0 ml/pozo.
    3. Incubar la placa a 37oC durante 30 min.
  2. Retire la solución de laminin de los pozos.
  3. HiPSCs de semillas en 2 ml de medio de mantenimiento iPSC(Tabla de Materiales)sobre los pomos recubiertos a una densidad de 3 × 104 células/pozo sin secar la superficie.
  4. Subcultura los hiPSC.
    1. Preparar 0.5× solución de enzimas de disociación celular (Tabla de Materiales).
      1. Mezclar 10 l de 0,5 M etilendiaminetetraacético (EDTA) y 10 ml de PBS para hacer EDTA/PBS de 0,5 mM.
      2. Diluir 10 ml de 1× enzimas de disociación celular a 0,5× añadiendo 10 ml de EDTA/PBS de 0,5 mM.
    2. Aspirar el medio gastado de los pozos.
    3. Agregue 2 ml/pozo de PBS para lavar las células, luego deseche el PBS.
    4. Añadir 800 l de las enzimas de disociación celular de 0,5×, e incubar las células durante 7 min a 37oC en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO2.
      NOTA: 0.05% de trippsina-EDTA se puede utilizar para disociar las células.
    5. Retire suavemente la solución de enzimas de disociación celular 0.5×.
    6. Lave las células con 2 ml de PBS y, a continuación, deseche el PBS.
      NOTA: Sea suave porque las células se desprenden fácilmente después de agregar la solución de enzimas de disociación celular.
    7. Añadir 1 mL de medio de mantenimiento iPS(Tabla de materiales)que contenga 10 m Y-27632.
      NOTA: Añadir Y-27632 aumenta la tasa de supervivencia de los hiPSC.
    8. Desalojar las células usando un rascador de células, y recogerlas en un tubo centrífugo de 15 ml.
    9. Cuente el número de celdas. Ajuste la densidad de la célula a 1,5 ×10 4 celdas/ml añadiendo un medio de mantenimiento iPS que contenga 10 m Y-27632.
      NOTA: No utilice centrifugación para evitar daños celulares.
    10. Semilla de 2 ml de mezcla celular en la placa de seis pozos recubierta de laminina (densidad final: 3 × 104 células/pozo).
    11. Incubar las células a 37oC en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO2.
    12. Sustituya el medio de cultivo por el medio de mantenimiento iPS sin Y-27632 en los días 1, 4, 5 y 6.
  5. Subcultura las células en el día 7.
    NOTA: Subcultura las células por el día 7 con el fin de inhibir la diferenciación aleatoria de hiPSCs.

2. Inducción de la diferenciación cardíaca de los hiPSC

  1. Recubrir una placa de cultivo de 96 pozos con laminina(Tabla de materiales).
    1. Diluir laminin a 1.675 g/ml con PBS.
    2. Añadir la solución de laminin diluida a una placa de 96 pozos a un volumen de 0,1 ml/pozo.
    3. Incubar la placa a 37oC durante 30 min.
  2. HiPSCs de semillas en una placa de 96 pocillos a una densidad de 3 × 104 células/pozo.
  3. Proliferar hiPSC a 37oC en una incubadora humidificada que contenga un 5% deCO2.
    1. Un día más tarde, sustituya el medio por un medio de crecimiento iPS de 200 l/pozo(Tabla de materiales).
    2. Cambie el medio cada día durante 2-3 días adicionales hasta que las células alcancen el 70% al 80% de confluencia.
  4. Aplicar medios de diferenciación.
    1. Aspirar el medio gastado y reemplazarlo lentamente con 200 l/pozo de medio de diferenciación precalegado A (Tabla de materiales).
    2. Colocar la placa a 37oC en una incubadora humidificada que contenga un 5% deCO2.
    3. Después de 48 h, aspirar el medio y reemplazarlo lentamente con 200 l/pozo de medio de diferenciación precalentó B(Tabla de materiales).
    4. Colocar la placa a 37oC en una incubadora humidificada que contenga un 5% deCO2.
      NOTA: Es extremadamente importante que los medios de diferenciación se mantengan frescos. Poco a poco perderán su efecto de diferenciación, por lo general dentro de dos semanas. Si es necesario, aliquot medio fresco y conservar a 20 oC.
  5. Aplicar medio de mantenimiento de cardiomiocitos.
    1. Después de 48 h, aspirar el medio y reemplazarlo lentamente con 200 l/pozo de medio de mantenimiento de cardiomiocitos precalentó (Tabla de Materiales).
    2. Colocar la placa a 37oC en una incubadora humidificada que contenga un 5% deCO2.
    3. Sustituya el medio de diferenciación de cardiomiocitos cada dos días hasta el día 30.
      NOTA: Es importante que la duración de la aplicación de los medios de diferenciación A y B se establezca con precisión en 48 h para garantizar la secuencia de expresión precisa de los genes necesarios para la diferenciación.

3. Exposición a isquemia

  1. Privar al medio de cultivo de nutrientes y oxígeno.
    1. Preparar el medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) sin glucosa y suero.
    2. Aspirar medio de cultivo de los pocillos de la placa de 96 pocillos que contiene hiPS-CM.
    3. Añadir el medio sin nutrientes a los pozos a un volumen de 200 l/pozo.
  2. Coloque la placa de cultivo en una incubadora hipoxica (Tabla de materiales).
  3. Infundir gas nitrógeno y mantener la concentración interna de oxígeno al 2% y la concentración deCO2 al 5% durante 24 h.
  4. Proceder a los análisis deseados: por ejemplo,ensayo de viabilidad, evaluación de la contractilidad o evaluación del daño celular.

4. Evaluación de la viabilidad celular mediante ensayo MTT

  1. Utilice el kit de ensayo MTT (Tabla de materiales) para evaluar cuantitativamente la viabilidad de las células.
    NOTA: La exposición al peróxido de hidrógeno de 1 mM en DMEM durante 1 h se puede utilizar para dañar las células (control positivo). La exposición al peróxido de hidrógeno de 0 mM en DMEM se puede utilizar para el control negativo.
    1. Agregue 10 l de reactivo MTT a las celdas utilizando un pipeteador repetido.
    2. Mezclar suavemente durante un minuto en un agitador orbital.
    3. Incubar las células durante 3-4 h a 37oC en una incubadorade CO2 al 5%. Después de la incubación, el formazan producido en las células aparecerá como cristales oscuros en la parte inferior de los pozos.
    4. Después de retirar el sobrenadante, disolver los cristales de formazan insolubles en 100 l de solución de dimetil sulfóxido (DMSO). Esta solución disolverá los cristales de formazan, produciendo una solución púrpura.
      ADVERTENCIA: DMSO puede irritar los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Use guantes adecuados y protección para los ojos y la cara.
    5. Mida la absorbancia de cada muestra con un lector de microplacas a una longitud de onda de 570 nm.

5. Evaluación de la contractilidad de iPS-CM

  1. Si no está instalado, obtenga Particle Image Velocimetry ImageJ plugin11 en https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv e instalar.
  2. Usando un microscopio de contraste de fase, grabe las imágenes de vídeo de los hiPS-CM usando la lente objetivo 4× a 20 fotogramas por segundo durante 10 s, y guárdelo como "analyze.avi". Para una comparación de contractilidad entre la isquemia antes y después, confirme que se registra la ubicación de interés.
    NOTA: Un microscopio con una etapa automatizada es útil para orientar la ubicación de interés. El archivo de película debe estar en formato .avi para su posterior análisis. Si no es así, convierta la película a .avi.
  3. Cree la estructura de carpetas como se indica en la Figura 1. Un ejemplo de "joblist.txt" se indica en el archivo suplementario.
  4. Analizar campos vectoriales bidimensionales discretos de desplazamiento celular.
    1. Inicie el software Fiji (ImageJ)12, vaya a Plugins > Macros > Editar y abra "vector_analysis.ijm" (Archivo de codificación suplementario).
    2. Haga clic en Ejecutar. El análisis se realizará automáticamente.
      NOTA: Los vectores de desplazamiento D(x,y) se calculan por cada 16 × 16 píxeles entre el fotograma de referencia (el primer fotograma) y todos los fotogramas subsiguientes (fotogramas 1 frente a 2, 1 frente a 3, 1 frente a 4, etc.). El resultado se calcula para cada fotograma y se guarda como "vec_x.txt"(x es un número de fotograma). Un vector de desplazamiento máximo, M(x, y), se define para cada par (x, y) de la siguiente manera:
      figure-protocol-1
      donde k representa el número de fotograma en el que - Dk (x,y) á máx. D2 (x,y) D3 (x,y), ..., Dn (x,y)-] y n denota el último fotograma. El resultado se guarda como "Max_vector.txt". | M(x, y)- representa el desplazamiento máximo causado por la contracción de cardiomiocitos en el punto de análisis (x, y). El valor de contractilidad C en unidades arbitrarias se calcula de la siguiente manera:
      figure-protocol-2
      Este valor se guarda en la columna 7, fila 1 en el "Max_vector.txt". C representa la suma de desplazamiento para todos (x, y). Cuanto mayor sea la porción donde el desplazamiento debido a la contracción miocárdica es grande, mayor será el valor de C. El campo vectorial de desplazamiento máximo, M(x, y), se superpone con la imagen de contraste de fase del primer fotograma ("Phase_contrast.png") y se guarda como "Overlaid.png". Como la magnitud del vector de desplazamiento se calcula en función del primer fotograma del vídeo, es preferible que los hiPS-CM estén en reposo en el período diastólico para el primer fotograma.

6. Evaluación del daño celular mediante citometría de flujo

  1. Diluir una solución de 1 mg/ml de yoduro propidium a 1:1.000 en PBS.
  2. Manchar las células separadas con yoduro propidium.
    1. Aspirar el medio y colocarlo en un tubo centrífugo de tamaño adecuado.
    2. Centrifugar el tubo a 1.000 × g durante 5 min, y retire cuidadosamente el sobrenadante para no perder células sedimentadas.
    3. Incubar las células con la solución diluida de yoduro propidium a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad.
    4. Centrifugar el tubo a 1.000 × g durante 5 min, y retire cuidadosamente el sobrenadante para no perder células sedimentadas.
    5. Reconstituir las células en 1 ml de PBS.
      NOTA: Es importante recoger células flotantes separadas del medio para cuantificar con precisión el daño celular.
  3. Mancha las células unidas con yoduro propidium.
    1. Lave las células conectadas dos veces con PBS suavemente y luego deseche PBS.
    2. Incubar las células con la solución diluida de yoduro propidium durante 15 minutos en la oscuridad.
    3. Aspirar la solución de yoduro propidium.
    4. Separe las células usando 0.25% de trippsina. Mueva la solución celular a un tubo centrífugo.
    5. Centrifugar el tubo a 1.000 × g durante 5 min, y retire cuidadosamente el sobrenadante para no perder células sedimentadas.
    6. Reconstituir las células en 1 ml de PBS.
  4. Mezcle las celdas flotantes y conectadas para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
  5. Pase la solución de la célula a través de un filtro de 30 m.
    NOTA: Pasar las celdas a un filtro es muy importante para una medición FACS precisa.
  6. Analice las muestras utilizando un sistema FACS.

7. Inmunostaining

  1. Corrija la muestra de celda.
    1. Aspirar el medio cultural.
    2. Añadir 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
    3. Lave las células tres veces con PBS.
      NOTA: Se recomienda una solución fresca de paraformaldehído para una fijación óptima.
  2. Permeabilizar las células con 0.2% Tritón X-100 durante 15 min, luego desechar el reactivo.
  3. Añadir 3% albúmina sérica bovina para bloquear las células durante 30 min.
  4. Aplicar anticuerpo primario.
    1. Deseche la solución de albúmina sérica bovina de la placa de cultivo.
    2. Incubar las células con anticuerpos primarios durante la noche a 4oC.
    3. Retire la solución de anticuerpos.
    4. Lave las células tres veces con PBS.
  5. Aplicar anticuerpo secundario.
    1. Deseche la solución PBS de la placa de cultivo.
    2. Incubar las células con anticuerpos secundarios durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
      NOTA: El anticuerpo monoclonal primario de troponina anti cardiaca T (TNNT2) se utiliza con una dilución de 1:750 en 3% de BSA. El anticuerpo antiratón de cabra secundario conjugado con Alexa Fluor 488 se diluye a 1:1.000 en 3% de BSA.
  6. Tinción adicional de fibras de núcleo y actina.
    1. Retire la solución de anticuerpos.
    2. Incubar las células en el reactivo de tinción del núcleo (Tabla de materiales) y reactivo de tinción de actina ( Tabla demateriales) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
      NOTA: 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o Hoechst 33342 se pueden utilizar para la tinción nuclear.
    3. Lave las células tres veces con PBS.
  7. Capture imágenes de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Las células diferenciadas con éxito muestran una contracción espontánea bajo el microscopio (Video 1). Típicamente, el 50% de los pozos muestran una contracción espontánea en <20 días(Figura complementaria 1). La proteína marcadora cardíaca (p. ej., cTnT) se puede utilizar para confirmar la diferenciación correcta (Figura 2).

Típicamente, las células del grupo isquémico muestran una menor viabilidad en los ensayos MTT (Figura 3A) y contractilidad (Figura 3E,F, Figura suplementaria 2) que las del grupo de control normódico. Además, la proporción de células yoduro-positivas propidium es mayor en el grupo isquémico que en el grupo de control (Figura 3B–D), lo que indica un daño celular mayor.

figure-results-1
Figura 1: Estructura de carpetas para el análisis vectorial de desplazamiento mediante imageJ.
"joblist.txt" describe la ruta de acceso a los archivos de película de cada línea. Si hay tres archivos para analizar, habrá tres carpetas (movie1, movie2 y movie3), en las que se debe colocar "analyze.avi" (la película de interés). Después de que el análisis se realiza mediante el código "vector_analysis.ijm", se generarán archivos (indicados en azul) en cada carpeta de película. La información almacenada en cada archivo se explica en detalle en el texto principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imagen representativa de la tinción de marcadores cardíacos.
Expresión de la proteína marcadora cardíaca troponina cardiaca T (cTnT). Azul: 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), rojo: actina, verde: cTnT. Inserción: expresión estriada de cTnT, que corresponde a la estructura de sarcomere. Barra de escala, 50 m. Esta cifra ha sido modificada de Wei et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Imágenes representativas del ensayo de viabilidad celular, evaluación del daño celular y contractilidad.
(A) Comparación de viabilidad celular (ensayo MTT). Una mayor absorbancia indica una mayor viabilidad. n 5 para cada condición. (B, C y D) Análisis de citometría de flujo de células teñidas de yoduro propidium (PI). Las células isquémicas presentan una intensidad de dispersión hacia adelante reducida y un aumento de la fluorescencia de PI, en comparación con el control. (D) Porcentaje de células manchadas por PI en el análisis de citometría de flujo. n a 3 para cada condición. (E) Análisis de la contractilidad de iPS-CM utilizando el software ImageJ. Los vectores rojo y azul indican las contracciones más grandes y más pequeñas, respectivamente. Barra de escala, 100 m. (F) Análisis cuantitativo de la contractilidad iPS-CM utilizando código. n a 3 para el control y n x 8 para la condición isquémica. Las barras de error representan un error estándar de la media. Para el análisis estadístico, se realizó la prueba t de Estudiante de dos colas sin par. *: p < 0.05, **: p < 0.01. : p < 0.0001. Esta cifra se cita de Wei et al.13Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1: Las células diferenciadas muestran una contracción espontánea bajo el microscopio. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.

Figura complementaria 1: Análisis de Kaplan-Meier del porcentaje de muestras sin contracción espontánea. El 50% de las muestras de iPS-CM mostraron contracción el día 20. El día 30, el 64,4% de las muestras mostraron contracción. n 83. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 2: Evaluación de la contractilidad cardíaca. La contractilidad escalada obtenida dividiendo la contractilidad C por el número de puntos de análisis (x, y) se trazaron para grupos de control e isquémicos antes y después de la exposición a la hipoxia de 24 h. n a 3 para el control y n x 8 para la condición isquémica. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 3: Evaluación del contenido de cardiomiocitos. Inmunomancha de proteína marcadora cardíaca en una placa de 96 pozos. Verde: cTnT, Azul: DAPI. La tasa de las células diferenciadas se calculó en 20,7 ± 9,6% dividiendo el área de la región teñida de cTnT por la de la región manchada de DAPI. Barra de escala a 1 mm. n a 4 para la condición de control. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Archivo de codificación suplementario. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Los investigadores a menudo utilizan modelos de laboratorio para animales pequeños para llevar a cabo experimentos con IHD. Aquí, desarrollamos un modelo de cultivo celular de IHD humano para llevar a cabo tales experimentos.

El principal problema que puede enfrentar un usuario de este protocolo es la baja tasa de cardiomiocitos diferenciados. Se deben tomar varias medidas con gran cuidado para mejorar la tasa de diferenciación exitosa: (a) ser suave al pipetear porque las células se desprenden fácilmente después de la adición del reactivo de enzimas de disociación celular, (b) la adición de Y-27632 aumenta la tasa de supervivencia de las células iPS al separarse, y (c) el momento de los cambios medios al comienzo de la diferenciación debe ser precisamente 48 h de distancia para asegurar la expresión controlada de genes en la diferenciación.

En cuanto a las proteínas de matriz extracelular utilizadas para recubrir la superficie de la placa de cultivo, se pueden utilizar otros materiales distintos de la laminina que utilizamos en este protocolo. Por ejemplo, Matrigel14,15, y gelatina16,17 se utilizan para el cultivo de mantenimiento sin alimentación de hiPSCs. Según Haraguchi et al., hiPSCs sembrados en Matrigel se diferenciaron con éxito en la hoja de células cardíacas18.

Hay una serie de estudios anteriores sobre modelos de cultivo para el modelado de enfermedades utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSCs. En cuanto al modelado de la lesión por isquemia-reperfusión, se han introducido19manipulaciones del entorno celular, como hiperpotasemia, acidosis y acumulación de lactato. Otros métodos incluyen peletización celular para obstaculizar la difusión de oxígeno20 y la inhibición metabólica utilizando cianuro21. En el protocolo actual, la lesión celular se logró mediante un método relativamente simple, a saber, la privación de oxígeno y nutrientes a las 24 horas. Sin embargo, se debe tener cuidado de considerar procesos fisiopatológicos precisos de la cardiopatía isquémica, ya que efectivamente hay diferencias entre la enfermedad in vivo y el modelo de enfermedad del protocolo actual, como la presencia o ausencia de entorno celular tridimensional y sangre.

En cuanto al aspecto tecnológico de la evaluación de la función cardiomiocitos, Toepfer et al. informaron de un algoritmo basado en MatLab para determinar la contracción y relajación de los sarcomeres en hiPS-CMs22. Smith y otros informaron de un método avanzado de análisis electrofisiológico de alto rendimiento de células excitables derivadas de hiPS-CM, utilizando sofisticados arreglos multielectrodo modelados nanotopográficamente23,,24. La ventaja de nuestro protocolo es que sólo requiere software convencional y consumibles, como software imageJ y placas de 96 pozos.

Con respecto al nivel de oxígeno en el corazón, la presión de oxígeno en las venas que llegan al corazón se cree que es 40 mmHg25. Según McDougal et al., la presión extracelular de oxígeno bajo hipoxia se estima en <12.8 mmHg26. Mediante la aplicación del método de Rondas yotros 27, la presión de oxígeno en el medio de cultivo (salinidad: 35o) bajo la condición hipoxica (2% de oxígeno) a 37 oC tratada con el protocolo actual se calcula como 14,9 mmHg, que es superior a la estimación anterior. Curiosamente, Al-Ani et al. informaron que hay un gradiente de presión de oxígeno en el medio de cultivo, y la presión de oxígeno se ve afectada por el tipo de célula, la densidad de siembra y el volumen medio28. Típicamente, la concentración de oxígeno en la parte inferior de la placa de cultivo donde residen las células es la más baja. Por lo tanto, el efecto de la profundidad en el medio de cultivo reduciría aún más la presión efectiva de oxígeno cerca de hiPS-CM. Con el fin de inducir suficiente daño a los hiPS-CM utilizando la condición hipoxica, se debe prestar atención cuidadosa a la profundidad del medio y la densidad de las células.

Nuestro modelo hiPS-CM, que está muy cerca de las condiciones fisiológicas de los miocitos cardíacos humanos, imita ventajosamente la IHD humana. Los enfoques basados en modelos animales incluyen cuestiones éticas, técnicas y académicas. En particular, los modelos in vivo requieren una técnica avanzada de microcirugía para lograr datos reproducibles: por ejemplo, oclusión de la rama descendente anterior de la arteria coronaria izquierda en roedores3. El modelo hiPS-CM descrito en este documento supera estas barreras críticas y proporciona una plataforma útil, relevante y repetible para las enfermedades cardiovasculares.

Sin embargo, deben tenerse en cuenta algunas limitaciones. Una diferencia obvia entre los cardiomiocitos inducidos por iPS y los cardiomiocitos normales es la ausencia de T-tubules29,y no incluimos factores humorales como el daño tisular inducido por los leucocitos y la activación de un sistema de complemento en nuestro estudio. Además, se debe mejorar la tasa de cardiomiocitos diferenciados en este modelo (20,7 ± 9,6%, Figura Complementaria 3). La reciente publicación de Halloin et al. describe un método escalable, definido químicamente para inducir la pureza hiPS-CM de >95% por moduladores químicos de vía WNT sin necesidad de ninguna selección por los marcadores30. Sin embargo, nuestro modelo de IHD humana es relativamente simple y clínicamente aplicable (por ejemplo, el cribado de fármacos utilizando células iPS derivadas del paciente). Nuestro modelo es también una plataforma única para dilucidar aún más los mecanismos subyacentes a los IHD.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por JSPS KAKENHI, Fondo para la Promoción de la Investigación Internacional Conjunta (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Los autores agradecen al Laboratorio Central de Investigación de la Escuela de Medicina de la Universidad de Okayama por la asistencia de FACS.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo de tinción de actina (Reactivo ActinRed 555 ReadyProbes)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UUR37112
Anticuerpo antitroponina T cardíacaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UUMA5-12960
Medio de mantenimiento de cardiomiocitos (kit de diferenciación de cardiomiocitos PSC)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. A2921201
Enzimas de disociación celular (TrypLE Select)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. 12563011
Medio de diferenciación A (kit de diferenciación de cardiomiocitos PSC)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.A2921201
Medio de diferenciación B (kit de diferenciación de cardiomiocitos PSC)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. A2921201
sistemaFACS Aria IIIBD Biosciences, San José, CA, EE. UU
Microscopio fluorescenteKEYENCE, Osaka, JapónBZ-X710
Anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 anti-ratón de cabraThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UUA28175
Células iPS humanasRIKEN, Tsukuba, Japón201B7
Incubadora hipóxicaSANYO, Osaka, JapónMCO-175M
Medio de crecimiento iPSC (Essential 8 Medium)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. A1517001
medio de mantenimiento iPSC (StemFit AK02N)Ajinomoto, Tokio, JapónRCAK02N
Laminina (iMatrix-511)Nippi, Tokio, Japónde ensayo iMatrix-511
MTT (Kit de ensayo de proliferación celular MTT)Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EE. UU. 10009365
Reactivo de tinción de núcleo (reactivo NucBlue Fixed Cell ReadyProbes)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UUR37606
Triton X-100Nacalai Tesque, Kioto, Japón35501-02
. . . . Kit .

Referencias

  1. Naghavi, M. Global Burden of Disease Self-Harm, C. Global, regional, and national burden of suicide mortality 1990 to 2016: systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. BMJ. 364, 94(2019).
  2. Nowbar, A. N., Gitto, M., Howard, J. P., Francis, D. P., Al-Lamee, R. Mortality From Ischemic Heart Disease. Circulation: Cardiovascular Quality and Outcomes. 12 (6), 005375(2019).
  3. Oh, J. G., Ishikawa, K. Experimental Models of Cardiovascular Diseases: Overview. Methods in Molecular Biology. 1816, 3-14 (2018).
  4. Brodehl, A., et al. Human Induced Pluripotent Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Genetic Cardiomyopathies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), (2019).
  5. Garbern, J. C., et al. Inhibition of mTOR Signaling Enhances Maturation of Cardiomyocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells via p53-Induced Quiescence. Circulation. , (2019).
  6. Horikoshi, Y., et al. Fatty Acid-Treated Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Human Cardiomyocytes Exhibit Adult Cardiomyocyte-Like Energy Metabolism Phenotypes. Cells. 8 (9), (2019).
  7. Hu, D., et al. Metabolic Maturation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by Inhibition of HIF1alpha and LDHA. Circulation Research. 123 (9), 1066-1079 (2018).
  8. Correia, C., et al. Distinct carbon sources affect structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 8590(2017).
  9. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  10. Tamargo, J., et al. Genetically engineered mice as a model for studying cardiac arrhythmias. Frontiers in Bioscience. 12, 22-38 (2007).
  11. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Wei, H., Wang, C., Guo, R., Takahashi, K., Naruse, K. Development of a model of ischemic heart disease using cardiomyocytes differentiated from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 520 (3), 600-605 (2019).
  14. Ghaedi, M., Niklason, L. E. Human Pluripotent Stem Cells (iPSC) Generation, Culture, and Differentiation to Lung Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 55-92 (2019).
  15. Hou, J., et al. Retaining mTeSR1 Medium during Hepatic Differentiation Facilitates Hepatocyte-Like Cell Survival by Decreasing Apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (4), 1533-1543 (2018).
  16. Yoshida, K., et al. Differentiation of mouse iPS cells into ameloblast-like cells in cultures using medium conditioned by epithelial cell rests of Malassez and gelatin-coated dishes. Medical Molecular Morphology. 48 (3), 138-145 (2015).
  17. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods in Molecular Biology. 1340, 79-95 (2015).
  18. Haraguchi, Y., Matsuura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Simple suspension culture system of human iPS cells maintaining their pluripotency for cardiac cell sheet engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (12), 1363-1375 (2015).
  19. Chen, T., Vunjak-Novakovic, G. In vitro Models of Ischemia-Reperfusion Injury. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 4 (3), 142-153 (2018).
  20. Strijdom, H., Genade, S., Lochner, A. Nitric Oxide synthase (NOS) does not contribute to simulated ischaemic preconditioning in an isolated rat cardiomyocyte model. Cardiovascular Drugs and Therapy. 18 (2), 99-112 (2004).
  21. Cavalheiro, R. A., et al. Potent cardioprotective effect of the 4-anilinoquinazoline derivative PD153035: involvement of mitochondrial K(ATP) channel activation. PLoS One. 5 (5), 10666(2010).
  22. Toepfer, C. N., et al. SarcTrack. Circulation Research. 124 (8), 1172-1183 (2019).
  23. Smith, A. S. T., et al. NanoMEA: A Tool for High-Throughput, Electrophysiological Phenotyping of Patterned Excitable Cells. Nano Letters. , (2019).
  24. Smith, A. S., Macadangdang, J., Leung, W., Laflamme, M. A., Kim, D. H. Human iPSC-derived cardiomyocytes and tissue engineering strategies for disease modeling and drug screening. Biotechnology Advances. 35 (1), 77-94 (2017).
  25. Sitkovsky, M., Lukashev, D. Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nature Reviews Immunology. 5 (9), 712-721 (2005).
  26. McDougal, A. D., Dewey, C. F. Modeling oxygen requirements in ischemic cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11760-11776 (2017).
  27. Rounds, S. A., Wilde, F. D., Ritz, G. F. Chapter A6. Section 6.2. Dissolved oxygen. Report No. 09-A6.2. , Reston, VA. (2006).
  28. Al-Ani, A., et al. Oxygenation in cell culture: Critical parameters for reproducibility are routinely not reported. PLoS One. 13 (10), 0204269(2018).
  29. Cadet, J. S., Kamp, T. J. A Recipe for T-Tubules in Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1294-1295 (2017).
  30. Halloin, C., et al. Continuous WNT Control Enables Advanced hPSC Cardiac Processing and Prognostic Surface Marker Identification in Chemically Defined Suspension Culture. Stem Cell Reports. 13 (2), 366-379 (2019).

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