Se describe un protocolo para realizar el trasplante intratraqueal de células estromales mesenquimales (MSC) a través de la inyección intratraqueal en ratas neonatales. Esta técnica es una opción clínicamente viable para la administración de células madre y fármacos en pulmones de ratas neonatales para evaluar su eficacia.
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Artículo de método
Instilación intratraqueal de células madre en ratas neonatales a término
En este artículo
Resumen
Resumen
La exposición prolongada a altas concentraciones de oxígeno conduce a inflamación y lesión pulmonar aguda, que es similar a la displasia broncopulmonar humana (BPD). En bebés prematuros, la BPD es una complicación importante a pesar del uso temprano de la terapia con surfactantes, las estrategias óptimas de ventilación y la ventilación positiva de presión no invasiva. Debido a que la inflamación pulmonar desempeña un papel crucial en la patogénesis de la BPD, el uso de corticoesteroides es un tratamiento potencial para prevenirla. Sin embargo, el tratamiento sistémico con corticoesteroides no suele recomendarse para bebés prematuros debido a efectos adversos a largo plazo. Los estudios preclínicos y los ensayos clínicos de fase I en humanos demostraron que el uso de células estromales mesenquimales (MSC) en lesiones pulmonares inducidas por hiperoxia y en bebés prematuros es seguro y factible. Se ha demostrado que el trasplante intratraqueal e intravenoso de MSC protege contra la lesión pulmonar hiperóxica neonatal. Por lo tanto, la administración intratraqueal de células madre y el tratamiento combinado de tensioactivos y glucocorticoides ha surgido como una nueva estrategia para tratar a los recién nacidos con trastornos respiratorios. La etapa de desarrollo de los pulmones de rata al nacer es equivalente a la de los pulmones humanos a las 26 a 28 semanas de gestación. Por lo tanto, las ratas recién nacidas son apropiadas para estudiar la administración intratraqueal a bebés prematuros con dificultad respiratoria para evaluar su eficacia. Esta técnica de instilación intratraqueal es una opción clínicamente viable para la administración de células madre y fármacos a los pulmones.
Introducción
A menudo se requiere oxígeno suplementario para tratar a los recién nacidos con dificultad respiratoria1. Sin embargo, la terapia con hiperoxia en lactantes tiene efectos adversos a largo plazo. La exposición prolongada a altas concentraciones de oxígeno conduce a inflamación y lesión pulmonar aguda, que es similar a la displasia broncopulmonar humana (BPD)2. La BPD es una complicación importante del tratamiento con hiperoxia que puede ocurrir a pesar de la terapia con surfactantes tempranos, los procedimientos óptimos de ventilación y el aumento del uso de ventilación por presión positiva no invasiva en bebés prematuros....
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Protocolo
Este procedimiento fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Taipei.
NOTA: Los MSC humanos transfectados de forma estable con proteína fluorescente verde (GFP) y genes de la luciasa de luciélula (Fluc) se obtuvieron de una empresa comercial (Tabla de Materiales).
1. Caracterización de MSC humanos con luciosa de luciélub contra incendios y proteína fluorescente verde
- Mantener los MSC humanos transfectados con GFP y Fluc en medios completos (mínimo esencial medio de modificación de águila-alfa [-MEM], complementado con 10-15% de suero bovino fetal....
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Resultados
La distribución pulmonar de la instilación intratraqueal de las células madre en el término ratas neonatales se determinó por células madre etiquetadas con foufa luciferasa (Fluc). Los MSC fueron etiquetados con Fluc y etiquetados con proteína fluorescente verde a través de transducción lentiviral. La Figura 1A muestra un alto nivel de expresión de la GFP en los MSC humanos, y el 93,7% de la población mostró la expresión positiva de la GFP detectada por la citometría de flujo. Los MSC se car.......
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Discusión
Los recién nacidos con dificultad respiratoria suelen requerir tensioactivos intratraqueales y/o tratamiento con corticoesteroides19. Los ensayos clínicos de fase I en humanos han demostrado la seguridad de los MSC intratraqueales en bebés prematuros8. Estos estudios sugieren que la administración intratraqueal de medicamentos es una opción importante para los recién nacidos con dificultad respiratoria. Los estudios de modelos en animales son más úti.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado en parte por una subvención de Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwán (A-109-008).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 6-0 seda | Ethicon | 1916G | |
| Almohadilla de preparación de alcohol | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Kit de análisis | BD Biosciences | 562245 | Marcadores CD |
| CMV-Luciferasa-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector para imágenes in vivo SBI | BLIV511PA-1 | ||
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| MSC humanos | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwán | ||
| Luz infrarroja | JING SHANG | JS300T | |
| Halocarbono | isoflurano | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 sistema de imágenes para animales pequeños | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Sal de potasio de luciferina | Promega, Madison, WI | ||
| Microtijeras, rectas | Vannas | H4240 | |
| Solución salina normal | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Solución isotónica de cloruro de sodio |
| Aguja RN de cubo pequeño, calibre 30 | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Jeringa (100 y micro; l) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
Referencias
- Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study. Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).
- Gien, J., Kinsella, J. P.
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Reimpresiones y permisos
