Los cilios primarios son estructuras extracelulares asociadas con el centriolo. La detección de cilios primarios por tinción inmunofluorescente es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de muy alta calidad. En este protocolo, los fibroblastos que expresaban cilios primarios fueron fijos, inmunosutenidos e imágenes en un microscopio fluorescente o confocal.
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Artículo de método
Detección simple de cilios primarios por inmunofluorescencia
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Resumen
Resumen
Los cilios primarios se regulan dinámicamente durante la progresión del ciclo celular, específicamente durante las fases G0/G1 del ciclo celular, siendo reabsorbidos antes de la mitosis. Los cilios primarios se pueden visualizar con métodos altamente sofisticados, incluyendo microscopía electrónica de transmisión, imágenes 3D o el uso de software para la detección automática de cilios primarios. Sin embargo, la tinción inmunofluorescente de los cilios primarios es necesaria para realizar estos métodos. Esta publicación describe un protocolo para la fácil detección de cilios primarios in vitro mediante la tinción de la tubulina alfa acetilada (axoneme) y la tubulina gamma (cuerpo basal). Este protocolo de tinción inmunofluorescente es relativamente simple y da como resultado imágenes de alta calidad. El presente protocolo describe cómo cuatro líneas celulares (C2C12, MEF, NHLF y fibroblastos cutáneos) que expresaban cilios primarios fueron fijadas, inmunotendadas e imágenes con un microscopio fluorescente o confocal.
Introducción
Los cilios primarios son estructuras sensoriales, solitarias, ligadas a la membrana y no móviles asociadas con el centriole maternés de la célula. Los cilios primarios se encuentran en la mayoría de las células vertebradas con la excepción de los glóbulos rojos, adipocitos1y hepatocitos2. Los cilios primarios se forman como un axonemo alargado compuesto por microtúbulos, cuyo componente principal es la tubulina. El axonemo crece a partir del cuerpo basal, que está estructurado a partir de la tubulina. La longitud de los cilios primarios varía entre 2–10 m; sin embargo, sus dimensiones pueden cambiar durante la glicación, inanición, hipoxia, estrés citotóxico, o después de la exposición a la radiación ionizante3,4,5,6,7. Por lo general, las células tienen sólo un cilium primario, que participa en la morfogénesis y las vías de señalización celular importantes para la proliferación celular y la diferenciación8,9.
Los cilios primarios se regulan dinámicamente durante la progresión del ciclo celular, específicamente durante las fases G0/G1, y se reabsorben antes de entrar en la mitosis en un proceso asociado con la deacetilación de la tubulina mediada por HDAC6 (histona deacetilasa 6)10. El momento exacto de la resorción primaria de los cilios depende del tipo de célula y de la expresión de genes directamente implicados en este proceso, como Aurora A, Plk1, TcTex-111,12,,13. Dependiendo del tipo de célula, los cilios primarios expresan diferentes tipos de receptores, canales iónicos y vías de señalización activas. Estos incluyen los receptores de señalización más importantes que afectan a la proliferación y supervivencia, EGFR, PDGFR, y FGFR. También se incluyen algunas de las vías de señalización que pueden afectar la función de uno o más órganos, incluyendo erizo, muesca, y Wnt. Gracias a estos receptores y vías de señalización, los cilios primarios también realizan una función quimiosensorial. Esta función permite a los cilios primarios detectar ligandos específicos para la muesca, hormonas, y sustancias biológicamente activas como la serotonina o somatostatina. Otras funciones específicas exhibidas por cilios primarios de diferentes longitudes incluyen la reacción a los cambios de temperatura, gravedad y osmolalidad14.
Los cilios primarios se pueden visualizar a través de diversos métodos, como la visualización en vivo, la microscopía electrónica de transmisión, la imagen 3D o por software para la detección automática de cilios primarios5,,15,,16,,17. Sin embargo, estos métodos son métodos de investigación altamente especializados y continuos para los métodos básicos, rápidos y fáciles para tinr a los cilios primarios en cada etapa de la investigación. Descrito es un método fácil y útil para la detección de cilios primarios en células cultivadas.
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Protocolo
1. Preparación de medios de cultivo, soluciones y platos
- Autoclave los cubreobjetos (22 x 22 mm). Prepare 6 placas de pozo. Descongelar el suero bovino fetal (FBS) y la penicilina/estreptomicina antibiótica y calentar el cultivo a temperatura media a ambiente (RT). Usar trypsin-EDTA (0,25%) y 1x PBS (solución salina tamponada de fosfato con calcio y magnesio) para pasar las células.
- Preparar paraformaldehído fresco 4% (PFA) en dH2O (800 mg de PFA en 20 ml de dH2O). El PFA debe estar recién preparado para cada experimento. Revuelva y caliente la solución a 55 oC durante 30 minutos en el capó. Enfríe a RT. Añadir 1 M de hidróxido de sodio hasta que la solución quede clara (pH a 7,2–7,4). Conservar a 4oC durante un máximo de 1 semana.
Nota: PFA es tóxico; siempre llevar equipo de protección personal adecuado y prepararse en la capucha química. - Preparar 500 ml de medios de cultivo, DMEM (medio de águila modificada de Dulbecco) que contiene 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, y 2% glutamina.
- Preparar 13 ml de solución de gelatina al 1% en dH estéril2O (130 mg de gelatina en 13 ml de dH2O). Utilice 2 ml de gelatina al 1% para cada pozo en un plato de 6 pozos. Manténgase estéril.
- Limpie la campana de flujo laminar con 70% de etanol. Coloque el material necesario dentro de la campana de flujo laminar antes de iniciar el experimento.
2. Cultivo celular para la tinción de inmunocitoquímica
- Descongelar las células (en este estudio C2C12, MEF, NHLF y fibroblastos de la piel) utilizando técnicas estándar y placarlas en un matraz T75 complementado con 10-12 ml de los medios preparados. Incubar a 37oC/5% co2/90% de humedad relativa (RH) hasta que las células alcancen el 70% de confluencia.
- Retire las células de la incubadora y colóquelas en la campana de flujo laminar. Retire el medio de cultivo y enjuague brevemente las células 2 veces con 1x PBS. Añadir 2 ml de 0,25% de trippsina-EDTA en el matraz T75 e incubar a 37 oC durante 5 min. Compruebe periódicamente el microscopio invertido para monitorear el desprendimiento celular.
NOTA: El tiempo de incubación depende de la línea celular y, por lo tanto, debe determinarse empíricamente. - Resuspender suavemente las células en 10 ml de medios de cultivo, pipeteando cuidadosamente para crear una suspensión de una sola célula. Enjuague el matraz de nuevo si es necesario.
- Coloque la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y centrífuga durante 5 min a 200 x g. Decantar el sobrenadante, añadir 10 mL de medios de cultivo, y resuspender suavemente el pellet. Tome 20 l de la suspensión celular y mezcle en una proporción de 1:1 con el azul tripano y cuente en un citómetro siguiendo el método estándar.
- Coloque un cubreobjetos dentro de cada pozo de una placa de 6 pozos usando pinzas. Recubrir los cubreobjetos con gelatina vertiendo 2 ml en los pozos. Esto ayudará a que las células se adhieran a los cubreobjetos. Retire la solución de gelatina y deje secar al aire durante unos minutos. Los cubreobjetos ya están listos para el cultivo de las células. Comience el cultivo inmediatamente.
- Sembrar 100.000 fibroblastos en cada pozo y añadir 2 ml de medios de cultivo. Incubar las células durante 24 h a 37oC/5% CO2/90% RH. En este punto, las celdas se pueden tratar de acuerdo con las necesidades del usuario. Los tratamientos para inducir la ciliación se han descrito previamente4,5.
NOTA: El número de siembra inicial depende del tiempo de duplicación de las celdas y debe determinarse en consecuencia.
3. Tinción inmunofluorescente de cilios primarios in vitro
- Calentar el 4% de paraformaldehído para RT. Preparar pipetas Pasteur, 1x PBS (RT), contenedor de residuos, tubos cónicos de 15 ml, micropipetas (0,5–10 l, 20–200 l y 100–1,000 l) y puntas. Tome las células de la incubadora y colóquelas en el banco.
NOTA: No es necesario realizar el procedimiento de tinción en condiciones estériles. Todas las soluciones deben estar en RT. - Retire los medios de cada pozo. Deje el cubreobjetos dentro del pozo. Lavar muy suavemente las células 3x con 2 ml de 1x PBS. Usando una pipeta Pasteur, agregue 2 mL de 4% de PFA en cada pozo para fijar las células. Incubar durante 10 min en RT. Retire la PFA y lave 3x con 1x PBS.
NOTA: Utilice siempre un volumen suficiente para cubrir todo el cubreobjetos durante los períodos de incubación. Nunca deje que las células se sequen. Nunca vierta ninguna de las soluciones directamente en el cubreobjetos. - Preparar 0.5% Triton X-100 en 13 mL de 1x PBS 10 min antes de su uso. Añadir 2 ml en cada pozo. Incubar durante 15 min. Lavar suavemente 4x con 1x PBS.
NOTA: Tritón X-100 es insoluble en PBS en RT. Caliente la solución 0.5% Triton X-100 a 37 oC en un baño de agua para disolverlo. - Descongelar el suero de cabra 5 min antes de su uso. Diluir el suero de cabra en 1x PBS en una proporción de 1:20 como solución de bloqueo. Añadir 150 l a cada cubreobjetos e incubar durante 20 minutos en RT.
NOTA: Prolongue el período de bloqueo hasta 60 minutos si es necesario. No lave las células después de bloquearlas con suero de cabra. - Descongelar los anticuerpos primarios (es decir, tubulina alfa antiequillada y tubulina anti gamma) 5 minutos antes de su uso. Diluir los anticuerpos por separado en 1x PBS de la siguiente manera: tubulina alfa antiequiltilada de ratón en una proporción de 1:800 y tubulina anti gamma de conejo en una proporción de 1:300. Retire la solución de bloqueo. No lavar. Añadir 150 l de ambas diluciones de anticuerpos a los cubreobjetos e incubar durante 60 minutos en RT.
NOTA: Si la incubación durante la noche utiliza 500–1,000 l de las soluciones primarias de anticuerpos, selle la placa de 6 pocillos con película de parafina y guárdela a 4oC. Alternativamente, utilice 150 l de anticuerpos e incubar en una cámara de humedad. - Retire los anticuerpos primarios. Lavar los cubreobjetos muy suavemente 3x con 2 ml de 1x PBS. Preparar los anticuerpos secundarios en 1x PBS diluyendo por separado Cy3 oveja anti-ratón y Alexa Fluor488 cabra anti-conejo en una proporción de 1:300. Añadir 150 l de ambas diluciones de anticuerpos secundarios a los cubreobjetos. Incubar durante 45 min en RT en la oscuridad.
NOTA: Incubar en la oscuridad para evitar el fotoblancada. Se pueden utilizar otras combinaciones de anticuerpos secundarios según sea necesario. - Prepare una solución DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacene el exceso de alícuotas a -20 oC. Diluir 10 l de una alícuota de stock (1:5.000) en 50 ml de 1x PBS. Añadir 2 ml de esta dilución a los cubreobjetos. Incubar durante 5 minutos en RT en la oscuridad.
NOTA: Es importante incubar las células en la oscuridad para evitar el fotoblancada. La dilución DAPI se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 mes. - Prepare 2 agujas, portaobjetos, pinzas y medios de montaje. Etiquete las diapositivas.
- Retire la solución DAPI de los pozos. Lavar 3x con 1x PBS. Coloque una gota de medios de montaje en cada diapositiva. Utilice la aguja para levantar suavemente el cubreobjetos desde la parte inferior del pozo. Voltee el cubreobjetos con las pinzas y colóquelo suavemente sobre la gota del soporte de montaje. Retire con cuidado las burbujas.
- Proteja los portaobjetos de la luz y guárdelos durante la noche a 4 oC.
- Utilice un microscopio fluorescente o confocal con alto aumento para visualizar a los cilios primarios.
NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar en la oscuridad a 4 oC durante un máximo de 2 meses.
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Resultados
La tinción inmunofluorescente de los cilios primarios es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de alta calidad. En estos experimentos, los fibroblastos que expresaban cilios primarios fueron fijos, inmunotuvistedos e imágenes en un microscopio fluorescente o confocal siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El cilium primario se detectó utilizando la tubulina acetilada y la tubulina. La evaluación de los cilios primarios se puede realizar en varios niveles y cualquier cambio en este s...
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Discusión
Varios autores han descrito diversos métodos para la detección de cilios primarios, a veces también describiendo varios métodos de fijación que pueden afectar a su detección6,,20,,21,,22. A pesar de todo, es difícil encontrar un protocolo completo y directo para la detección. La disponibilidad de tal método sería sin duda de gran ayuda para el estudio de la investigación de cilios primarios, es...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Defensa de la República Checa - Plan de desarrollo de organización a largo plazo Aspectos médicos de las armas de destrucción masiva de la Facultad de Ciencias de la Salud Militar, Universidad de Defensa; ministerio de Educación, Juventud y Deporte, República Checa (Proyecto de Investigación Específico No: SV/ FVZ201703) y PROGRES Q40/06. Gracias también a Daniel Díaz por su amable ayuda en la revisión del idioma inglés.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 6 pocillos | TPP | 92406 | Dimensiones 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Fragmento de cabra anti-conejo IgG |
| anti-Tubulina y gamma; | Sigma-Aldrich | T5192 | Conejo policlonal anti-ratón IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Mioblasto (ratón) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-ratón IgG (molécula entera) F(ab′)2 fragmento– Anticuerpo Cy3 producido en ovejas |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco&agudo; s Águila modificada y aguda; s medio | Thermo Scientific | 11960044 | Alto contenido de glucosa, Sin glutamina, Gibco |
| Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato | Sigma-Aldrich | D8662 | con MgCl2 y CaCl2, Filtrado estéril, Apto para cultivo celular |
| Suero fetal bovino | Thermo Scientific | 16000044 | Estéril Filtrado, Gibco |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Fibroblasto embrionario de ratón |
| Tubulina monoclonal antiacetilada | Sigma-Aldrich | T7451 | Anticuerpo monoclonal antiacetilado Tubulina producido en ratón |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Fibroblastos pulmonares primarios (humanos) |
| Suero normal de cabra | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Polvo |
| Penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P0781 | 10.000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina por ml en NaCl al 0,9%, Sterile-Filtered |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Fibroblastos de la piel | Amablemente obsequiado por la Universidad Charles, Facultad de Medicina en Hradec Krá amoré. | ||
| Cubreobjetos cuadrados | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Vidrio de borosilicato, 22x22mm, cuadrado |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Tripsina-EDTA (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | Con filtro estéril, Gibco |
Referencias
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
- Sharma, N., Kosan, Z. A., Stallworth, J. E., Berbari, N. F., Yoder, B. K. Soluble levels of cytosolic tubulin regulate ciliary length control. Molecular Biology of the Cell. 22 (6), 806-816 (2011).
- Filipová, A., et al. Ionizing radiation increases primary cilia incidence and induces multiciliation in C2C12 myoblasts. Cell Biology International. 39 (8), 943-953 (2015).
- Filipová, A., et al. The toxic effect of cytostatics on primary cilia frequency and multiciliation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (8), 5728-5736 (2019).
- Gadadhar, S., et al. Tubulin glycylation controls primary cilia length. The Journal of Cell Biology. 216 (9), 2701-2713 (2017).
- Shamloo, K., et al. Chronic Hypobaric Hypoxia Modulates Primary Cilia Differently in Adult and Fetal Ovine Kidneys. Frontiers in Physiology. 8, 677(2017).
- Malone, A. M. D., et al. Primary cilia mediate mechanosensing in bone cells by a calcium-independent mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (33), 13325-13330 (2007).
- Luesma, M. J., et al. Enteric neurons show a primary cilium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (1), 147-153 (2013).
- Pugacheva, E. N., Jablonski, S. A., Hartman, T. R., Henske, E. P., Golemis, E. A. HEF1-dependent Aurora A activation induces disassembly of the primary cilium. Cell. 129 (7), 1351-1363 (2007).
- Li, A., et al. Ciliary transition zone activation of phosphorylated Tctex-1 controls ciliary resorption, S-phase entry and fate of neural progenitors. Nature Cell Biology. 13 (4), 402-411 (2011).
- Spalluto, C., Wilson, D. I., Hearn, T. Evidence for reciliation of RPE1 cells in late G1 phase, and ciliary localisation of cyclin B1. FEBS Open Bio. 3, 334-340 (2013).
- Malicki, J. J., Johnson, C. A. The Cilium: Cellular Antenna and Central Processing Unit. Trends in Cell Biology. 27 (2), 126-140 (2017).
- Morleo, M., Franco, B. The Autophagy-Cilia Axis: An Intricate Relationship. Cells. 8 (8), 905(2019).
- Ott, C., Lippincott-Schwartz, J. Visualization of live primary cilia dynamics using fluorescence microscopy. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.26 (2012).
- Sun, S., Fisher, R. L., Bowser, S. S., Pentecost, B. T., Sui, H. Three-dimensional architecture of epithelial primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9370-9379 (2019).
- Lauring, M. C., et al. New software for automated cilia detection in cells (ACDC). Cilia. 8 (1), 1(2019).
- Conroy, P. C., et al. C-NAP1 and rootletin restrain DNA damage-induced centriole splitting and facilitate ciliogenesis. Cell Cycle. 11 (20), 3769-3778 (2012).
- Kim, J. H., et al. Genome-wide screen identifies novel machineries required for both ciliogenesis and cell cycle arrest upon serum starvation. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (6), Pt A 1307-1318 (2016).
- Yuan, K., et al. Primary cilia are decreased in breast cancer: analysis of a collection of human breast cancer cell lines and tissues. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 857-870 (2010).
- Smith, Q., et al. Differential HDAC6 Activity Modulates Ciliogenesis and Subsequent Mechanosensing of Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 24 (4), 895-908 (2018).
- Mirvis, M., Siemers, K. A., Nelson, W. J., Stearns, T. P. Primary cilium loss in mammalian cells occurs predominantly by whole-cilium shedding. PLOS Biology. 17 (7), 3000381(2019).
- Hua, K., Ferland, R. J. Fixation methods can differentially affect ciliary protein immunolabeling. Cilia. 6 (1), 5(2017).
- Lim, Y. C., McGlashan, S. R., Cooling, M. T., Long, D. S. Culture and detection of primary cilia in endothelial cell models. Cilia. 4, 11(2015).
- DiDonato, D., Brasaemle, D. L. Fixation methods for the study of lipid droplets by immunofluorescence microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 51 (6), 773-780 (2003).
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