Detección simple de cilios primarios por inmunofluorescencia

Resumen

Los cilios primarios son estructuras extracelulares asociadas con el centriolo. La detección de cilios primarios por tinción inmunofluorescente es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de muy alta calidad. En este protocolo, los fibroblastos que expresaban cilios primarios fueron fijos, inmunosutenidos e imágenes en un microscopio fluorescente o confocal.

Resumen

Los cilios primarios se regulan dinámicamente durante la progresión del ciclo celular, específicamente durante las fases G0/G1 del ciclo celular, siendo reabsorbidos antes de la mitosis. Los cilios primarios se pueden visualizar con métodos altamente sofisticados, incluyendo microscopía electrónica de transmisión, imágenes 3D o el uso de software para la detección automática de cilios primarios. Sin embargo, la tinción inmunofluorescente de los cilios primarios es necesaria para realizar estos métodos. Esta publicación describe un protocolo para la fácil detección de cilios primarios in vitro mediante la tinción de la tubulina alfa acetilada (axoneme) y la tubulina gamma (cuerpo basal). Este protocolo de tinción inmunofluorescente es relativamente simple y da como resultado imágenes de alta calidad. El presente protocolo describe cómo cuatro líneas celulares (C2C12, MEF, NHLF y fibroblastos cutáneos) que expresaban cilios primarios fueron fijadas, inmunotendadas e imágenes con un microscopio fluorescente o confocal.

Introducción

Los cilios primarios son estructuras sensoriales, solitarias, ligadas a la membrana y no móviles asociadas con el centriole maternés de la célula. Los cilios primarios se encuentran en la mayoría de las células vertebradas con la excepción de los glóbulos rojos, adipocitos¹y hepatocitos^2. Los cilios primarios se forman como un axonemo alargado compuesto por microtúbulos, cuyo componente principal es la tubulina. El axonemo crece a partir del cuerpo basal, que está estructurado a partir de la tubulina. La longitud de los cilios primarios varía entre 2–10 m; sin embargo, sus dimensiones pueden cambiar durante la glicación,....

Protocolo

1. Preparación de medios de cultivo, soluciones y platos

1. Autoclave los cubreobjetos (22 x 22 mm). Prepare 6 placas de pozo. Descongelar el suero bovino fetal (FBS) y la penicilina/estreptomicina antibiótica y calentar el cultivo a temperatura media a ambiente (RT). Usar trypsin-EDTA (0,25%) y 1x PBS (solución salina tamponada de fosfato con calcio y magnesio) para pasar las células.
2. Preparar paraformaldehído fresco 4% (PFA) en dH₂O (800 mg de PFA en 20 ml de dH₂O). El PFA debe estar recién preparado para cada experimento. Revuelva y caliente la solución a 55 oC durante 30 minutos en el capó. Enfríe a RT. Añadir 1 M de hidróxid....

Resultados

La tinción inmunofluorescente de los cilios primarios es un procedimiento relativamente simple que da como resultado imágenes de alta calidad. En estos experimentos, los fibroblastos que expresaban cilios primarios fueron fijos, inmunotuvistedos e imágenes en un microscopio fluorescente o confocal siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El cilium primario se detectó utilizando la tubulina acetilada y la tubulina. La evaluación de los cilios primarios se puede realizar en varios niveles y cualquier cambio en este s.......

Discusión

Varios autores han descrito diversos métodos para la detección de cilios primarios, a veces también describiendo varios métodos de fijación que pueden afectar a su detección^{6,,20,,21,,22}. A pesar de todo, es difícil encontrar un protocolo completo y directo para la detección. La disponibilidad de tal método sería sin duda de gran ayuda para el estudio de la investigación de cilios primarios, es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 6 pocillos	TPP	92406	Dimensiones 128x86x22 mm
Alexa Fluor488	Jackson ImmunoResearch	111-546-047	AffiniPure F(ab')? Fragmento de cabra anti-conejo IgG
anti-Tubulina y gamma;	Sigma-Aldrich	T5192	Conejo policlonal anti-ratón IgG2a
C2C12	ATCC	CRL-1772	Mioblasto (ratón)
Cy3	Sigma-Aldrich	C2181	Anti-ratón IgG (molécula entera) F(ab′)2 fragmento– Anticuerpo Cy3 producido en ovejas
Dapi (4′,6-Diamidino-2-fenilindol diclorhidrato)	Sigma-Aldrich	D9542
Dulbecco&agudo; s Águila modificada y aguda; s medio	Thermo Scientific	11960044	Alto contenido de glucosa, Sin glutamina, Gibco
Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	D8662	con MgCl2 y CaCl2, Filtrado estéril, Apto para cultivo celular
Suero fetal bovino	Thermo Scientific	16000044	Estéril Filtrado, Gibco
L-Glutamina	Sigma-Aldrich	G7513
MEF	ATCC	SCRC-1039	Fibroblasto embrionario de ratón
Tubulina monoclonal antiacetilada	Sigma-Aldrich	T7451	Anticuerpo monoclonal antiacetilado Tubulina producido en ratón
NHLF	Lonza	CC-2512	Fibroblastos pulmonares primarios (humanos)
Suero normal de cabra	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	158127-500G	Polvo
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	P0781	10.000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina por ml en NaCl al 0,9%, Sterile-Filtered
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961
Fibroblastos de la piel	Amablemente obsequiado por la Universidad Charles, Facultad de Medicina en Hradec Krá amoré.
Cubreobjetos cuadrados	Thermo Scientific	22X22-1.5	Vidrio de borosilicato, 22x22mm, cuadrado
Triton X-100	Sigma-Aldrich	11332481001
Tripsina-EDTA (0.25%)	Thermo Scientific	25200072	Con filtro estéril, Gibco