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Artículo de método

Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

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DOI:

10.3791/61167

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10 de mayo de 2020

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1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

En este artículo

Resumen

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (<50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Resumen

El aislamiento de los miocitos cardíacos ventriculares de corazones animales y humanos es un método fundamental en la investigación cardíaca. Los cardiomiocitos animales son comúnmente aislados por perfusión coronaria con enzimas digestivas. Sin embargo, aislar los cardiomiocitos humanos es un reto porque los especímenes de miocardio humano generalmente no permiten la perfusión coronaria, y los protocolos de aislamiento alternativos resultan en rendimientos pobres de células viables. Además, los especímenes de miocardio humano son raros y solo están disponibles regularmente en instituciones con cirugía cardíaca in situ. Esto dificulta la traducción de los hallazgos de cardiomiocitos animales a humanos. Aquí se describe un protocolo fiable que permite el aislamiento eficiente de los miocitos ventriculares del miocardio humano y animal. Para aumentar la relación superficie-volumen y minimizar el daño celular, se generan rebanadas de tejido miocárdico de 300 m de espesor a partir de muestras de miocárdico con un vibratome. Las rodajas de tejido se digieren con proteasa y colagenasa. El miocardio de rata se utilizó para establecer el protocolo y cuantificar los rendimientos de miocitos viables y tolerantes al calcio mediante el recuento de células citométricas de flujo. La comparación con el método de trozos de tejido comúnmente utilizado mostró rendimientos significativamente más altos de los cardiomiocitos en forma de varilla (41,5 a 11,9 frente a 7,89 a 3,6%, p < 0,05). El protocolo se tradujo al miocardio humano en defecto y sin fallos, donde los rendimientos eran similares a los del miocardio de rata y, de nuevo, notablemente más altos que con el método de tejido-trozo (45,0 a 15,0 frente a 6,87 a 5,23 células/mg, p < 0,05). En particular, con el protocolo presentado es posible aislar un número razonable de cardiomiocitos humanos viables (9–200 células/mg) de cantidades mínimas de tejido (<50 mg). Por lo tanto, el método es aplicable al miocardio sano y en defecto de los corazones humanos y animales. Además, es posible aislar miocitos excitables y contráctiles de muestras de tejido humano almacenadas hasta 36 h en solución cardiopléjica en frío, haciendo que el método sea particularmente útil para laboratorios en instituciones sin cirugía cardíaca in situ.

Introducción

Una técnica seminal que ha allanado el camino a información importante sobre la fisiología cardiomiocitos es el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares vivos de corazones intactos1. Cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para estudiar la estructura celular normal y la función, o las consecuencias de los experimentos in vivo; por ejemplo, para evaluar los cambios en la electrofisiología celular o el acoplamiento excitación-contracción en modelos animales de enfermedad cardíaca. Además, los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para el cultivo celular, intervenciones farmacológicas, transferencia de genes, ingeniería de tejidos y muchas otras aplicaciones. Por lo tanto, los métodos eficientes para el aislamiento de cardiomiocitos son de valor fundamental para la investigación cardíaca básica y traslacional.

Los cardiomiocitos de pequeños mamíferos, como los roedores, y de mamíferos más grandes, como cerdos o perros, son comúnmente aislados por perfusión coronaria del corazón con soluciones que contienen colágenos crudos y/o proteasas. Esto ha sido descrito como el método "estándar de oro" para el aislamiento de cardiomiocitos, lo que resulta en rendimientos de hasta el 70% de las células viables2. El enfoque también se ha utilizado con los corazones humanos, lo que resulta en rendimientos de cardiomiocitos aceptables3,,4,5. Sin embargo, debido a que la perfusión coronaria sólo es factible si el corazón intacto o una cuña miocárdica grande que contiene una rama de la arteria coronaria está disponible, la mayoría de los especímenes cardíacos humanos no son adecuados para este enfoque debido a su pequeño tamaño y la falta de vasculatura adecuada. Por lo tanto, el aislamiento de los cardiomiocitos humanos es un desafío.

Los especímenes de miocardio humano consisten principalmente en trozos de tejido de tamaño variable (aproximadamente 0,5 x 0,5 x 0,5 cm a 2 x 2 x 2 cm), obtenidos a través de biopsias endomiocardiales6, miectomies septal7, implantaciones de VAD8, o de corazones explantados9. Los procedimientos más comunes para el aislamiento de cardiomiocitos comienzan con la picadura del tejido usando tijeras o un bisturí. Los contactos de célula a célula se interrumpen por inmersión en tampones libres de calcio o de bajo contenido de calcio. Esto es seguido por múltiples pasos de digestión con extractos de enzimas brutas o enzimas purificadas como proteasas (por ejemplo, tripina), colagenasa, hialuronidasa, o elastasa, lo que resulta en una desintegración de la matriz extracelular y la liberación de los cardiomiocitos. En un paso final y crítico, una concentración fisiológica de calcio tiene que ser restaurada cuidadosamente, o el daño celular puede ocurrir debido a la paradoja de calcio10,11,12. Este enfoque de aislamiento es conveniente, pero generalmente ineficiente. Por ejemplo, un estudio encontró que casi 1 g de tejido miocárdico era necesario para obtener un número suficiente de cardiomiocitos adecuado para experimentos posteriores13. Una posible razón para los bajos rendimientos es el método relativamente duro de picar el tejido. Esto puede dañar particularmente los cardiomiocitos ubicados en los bordes de los trozos, aunque estos miocitos son más propensos a ser liberados por digestión enzimática.

Otro aspecto que puede influir en la eficiencia del aislamiento y la calidad de las células obtenidas de muestras humanas es la duración de la isquemia tisular. La mayoría de los protocolos mencionan los tiempos de transporte cortos al laboratorio como un requisito previo para obtener buenos resultados. Esto restringe el estudio de cardiomiocitos ventriculares humanos a laboratorios con instalaciones de cirugía cardíaca cercanas. Juntos, estas restricciones dificultan la verificación de hallazgos importantes de modelos animales en cardiomiocitos humanos. Por lo tanto, son deseables protocolos de aislamiento mejorados que permiten altos rendimientos de cardiomiocitos a partir de pequeñas cantidades de tejido, preferiblemente sin daños graves después de tiempos de transporte prolongados.

Aquí se describe un protocolo de aislamiento basado en la digestión enzimática de las rebanadas de tejido miocárdico delgado generadas con un vibratoma14,,15. Demostramos que el aislamiento de las rodajas de tejido es mucho más eficiente que el de los trozos de tejido picados con tijeras. El método descrito no sólo permite altos rendimientos de cardiomiocitos humanos viables a partir de pequeñas cantidades de tejido miocárdico, sino que también es aplicable a muestras almacenadas o transportadas en solución cardiopléjica en frío hasta 36 h.

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Protocolo

Todos los experimentos con ratas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Mittelfranken, Baviera, Alemania. La recolección y el uso de muestras de tejido cardíaco humano fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Erlangen-Núremberg y el Ruhr-Universidad Bochum. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.

Las ratas Wistar hembras (150–200 g) se obtuvieron comercialmente, anestesiadas mediante la inyección de 100 mg/kg de tiopental-sodio intraperitonealmente, y eutanasiadas por dislocación cervical seguida de toracotomía y escisión del corazón. Las muestras de tejido cardíaco humano se recogieron del núcleo apical ventricular izquierdo durante la implantación de dispositivos de asistencia mecánica, de la miectomía septal, de la tetralogía de la cirugía correctiva de Fallot o de la pared ventricular izquierda libre de corazones explantados. El siguiente protocolo describe el aislamiento del tejido ventricular humano. El aislamiento de los cardiomiocitos de rata se realizó en consecuencia, pero con diferentes enzimas (ver Tabla de Materiales). Un flujo de trabajo esquemático del protocolo se ilustra en la Figura 1.

1. Preparación de tampones, soluciones y enzimas

  1. Prepare los buffers y las soluciones como se indica en la Tabla 1.
  2. Calentar las soluciones 1, 2, 3 y la solución modificada de Tyrode a 37 oC. Conservar la solución de corte a 4oC hasta su uso.
    NOTA: Para 1-2 rebanadas de miocardio se requieren un total de aproximadamente 15 ml, 8 ml y 5 ml de las soluciones 1, 2 y 3 para el aislamiento en un plato de cultivo de tejido de 35 mm. Amplíe en consecuencia para los aislamientos simultáneos de miocitos en varios platos. La solución de corte se puede congelar y mantener a -20 oC durante varios meses.
  3. Pesar 1 mg de proteinasa XXIV (ver Tabla de Materiales)en un tubo centrífugo prechilled de 15 ml y conservar en hielo hasta su uso. Esto es para procesar una muestra. Amplíe la cantidad en consecuencia. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
  4. Pesar 8 mg de colagenasa CLSI (ver Tabla de Materiales)en un tubo centrífugo prechilled de 15 ml y conservar en hielo hasta su uso. Esto es para procesar una muestra. Amplíe la cantidad en consecuencia. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
    ADVERTENCIA: Use una mascarilla facial o trabaje bajo una campana de humo para evitar la inhalación de polvo enzimático.
    NOTA: La actividad enzimática puede variar en diferentes lotes. Por lo tanto, la concentración óptima puede diferir y debe determinarse con cada enzima recién adquirida16.

2. Almacenamiento y transporte de tejido miocárdico

  1. Almacenar y transportar muestras cardíacas humanas en solución de corte enfriada de 4oC(Tabla 1).
  2. Utilice la misma solución para el procesamiento de tejidos adicionales y el corte de vibratomas.
    NOTA: Las biopsias y las muestras quirúrgicas del corazón deben transferirse inmediatamente a la solución de corte a 4 oC y luego pueden almacenarse o transportarse a 4 oC durante un máximo de 36 h antes de la aplicación de este protocolo.

3. Procesamiento y corte del tejido

NOTA: El protocolo para el corte de tejidos sigue Fischer et al.15.

  1. Recorte del bloque de tejido
    ADVERTENCIA: El tejido cardíaco humano es potencialmente infeccioso. Utilice siempre el desgaste protector y siga las normas de seguridad de su institución. Manipule cuidadosamente las cuchillas usadas y deseche en contenedores de seguridad.
    1. Colocar la muestra en un plato de cultivo de tejido de 100 mm lleno de solución de corte en frío de 20 ml y mantener en una placa enfriada de 4 oC.
    2. Retire el exceso de tejido fibroso y la grasa epicardial con un bisturí. En caso de una muestra transmuros, retire las trabeculas y las capas de tejido cerca del endocardio.
      NOTA: El tejido fibroso es rígido y aparece blanco. La grasa es típicamente suave y aparece de color blanco a amarillo. Las capas de trabeculas y tejido endocardial se pueden identificar a partir de su composición de tejido suelto y una orientación de fibra no alineada en comparación con el miocardio de las capas epicardiales
    3. Para un procesamiento óptimo del vibratoma, corte bloques de tejido rectangular de aproximadamente 8 mm x 8 mm x 8 mm con un bisturí de una muestra de tejido más grande. Para biopsias más pequeñas, omita este paso y pase a la incrustación de agarosa.
  2. Incorporación de tejido cardíaco en agarosa de punto de fusión bajo
    1. Hervir 400 mg de agarosa de punto de fusión baja en 10 ml de solución de corte en un vaso de precipitados de vidrio.
      ADVERTENCIA: Use guantes y gafas de seguridad para evitar quemaduras. Manipule la cristalería caliente solo con desgaste de protección contra el calor.
    2. Llene una jeringa de 10 ml con el gel de agarosa caliente y disuelto. Selle la jeringa y deje que la agarosa se equilibre en un baño de agua de 37 oC durante al menos 15 minutos.
    3. Utilice fórceps para colocar la muestra cardíaca recortada o una biopsia en una placa limpia de cultivo de tejido de 35 mm con el epicardium hacia abajo y eliminar el exceso de líquido con un hisopo estéril.
    4. Vierta la agarosa equilibrada (paso 3.2.2) sobre el tejido vaciando la jeringa. Asegure el tejido contra el movimiento con fórceps mientras vierte la agarosa. Asegúrese de que el tejido esté completamente sumergido en agarosa.
    5. Coloque inmediatamente el plato sobre hielo y deje que la agarosa se solidifique durante 10 minutos.
  3. Cortar el miocardio
    1. Monte una nueva cuchilla de afeitar en el soporte de la hoja del vibratome y calibre el vibratomo ajustando la desviación z de la cuchilla si es posible.
      NOTA: Este protocolo utiliza un vibratome con un dispositivo de calibración asistido por infrarrojos para alinear la hoja en una posición horizontal con una desviación z mínima (desviación medida <0,1 m).
    2. Usa un bisturí para extirpar un bloque de tejido agarosa que se ajuste al soporte de la muestra del vibratomo. Para garantizar la estabilidad, asegúrese de que el tejido esté suficientemente sumergido en agarosa (márgenes de agarosa a 8 mm).
    3. Fije el bloque de agarosa al soporte de la muestra con una fina capa de pegamento de cianoacrilato y una presión suave.
    4. Coloque el soporte de la muestra con el tejido en el baño del vibratomo. Llene el baño con solución de corte y manténgalo a 4-6 oC durante todo el procesamiento con hielo triturado, rellenando el tanque de enfriamiento exterior del vibratomo.
    5. Genere rodajas de 300 m de espesor con una velocidad de avance de 0,1 mm/s, una frecuencia oscilante de 80 Hz, una amplitud lateral de 1,5 mm y un ángulo de hoja de 15o. Cuando manipule las rodajas, sostenga la agarosa en lugar del tejido en sí para evitar daños en los tejidos. Conservar las rodajas en la solución de corte a 4oC durante un máximo de 2 h, si es necesario.
      NOTA: Los cardiomiocitos están orientados en paralelo al epicardio. Por lo tanto, es importante cortar en paralelo al epicardio para evitar daños excesivos en miocitos. Se recomienda desechar los primeros 1-3 cortes, ya que solo se deben utilizar rebanadas uniformes de espesor constante para el aislamiento. Para biopsias de tejido pequeño, sin embargo, sólo deseche la primera rebanada.
    6. Compruebe la alineación de los cardiomiocitos bajo un microscopio de luz estándar con un aumento de 40-100x.

4. Digestión de tejidos

  1. Coloque la placa de calor en la coctelera de laboratorio y caléctela a 37 oC. Encienda el agitador de laboratorio a 65 rpm.
  2. Disolver la proteinasa (preparada en el paso 1.3) en 2 ml de la solución 1 (paso 1.1 y 1.2) e incubar a 37oC hasta su uso. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
  3. Disolver la colagenasa (preparada en el paso 1.4) en 2 ml de la solución 1 (paso 1.1 y 1.2) e incubar a 37oC hasta su uso. No mezcle la proteinasa y la colagenasa.
    ADVERTENCIA: Use gafas y guantes protectores, ya que las enzimas disueltas pueden causar lesiones en la piel y los ojos.
  4. Añadir cloruro de calcio (CaCl2) a la solución que contiene colagenasa (preparada en el paso 4.3) a una concentración final de 5 oM.
  5. Utilice fórceps para transferir una rebanada de tejido del baño de vibratoma a un plato de cultivo de tejido limpio de 60 mm lleno de 5 ml de solución de corte prechilled (paso 1.1 y 1.2) y mantener en hielo.
  6. Retire cuidadosamente la agarosa del tejido miocárdico con cuchilla o fórceps.
    NOTA: Evite el exceso de tensión y tensión de cizallamiento en las rodajas de miocárdico, ya que pueden dañar los cardiomiocitos.
  7. Para realizar el lavado inicial, coloque un plato de cultivo de tejido limpio de 35 mm en la placa de calor y llénelo con 2 ml de solución precalentada (37 oC) 1. Transfiera 1–2 rodajas de miocardio al plato preparado con fórceps. Aspirar la solución con una pipeta de 1 ml y realizar los pasos de lavado 2x para eliminar los restos de solución de corte.
    NOTA: No aspire las rodajas cardíacas. Las soluciones y las rodajas deben permanecer a una temperatura constante de 35 oC en la placa de calor agitada. Ajuste la temperatura de la placa de calor si es necesario.
  8. Retire la solución 1 del plato y añada 2 ml de la solución proteasa (paso 4.2). Incubar durante 12 min en la placa de calor a 65 rpm.
  9. Lavar 2x con 2 ml de solución precalentada 1 (37oC).
  10. Retire la solución 1 del plato y añada 2 ml de solución de colagenasa (pasos 4.3 y 4.4). Incubar al menos 30 min en la placa de calor a 65 rpm.
  11. Compruebe si hay miocitos individuales gratuitos a 30, 35, 40 minutos, etc., colocando el plato bajo un microscopio ligero. Trabaje rápidamente para evitar el enfriamiento significativo de la solución.
    NOTA: El tiempo de digestión requerido puede variar dependiendo de la constitución del tejido y el grado de fibrosis. Tan pronto como el tejido se vuelve visiblemente suave y se disocia fácilmente cuando se tira suavemente, se ha alcanzado el tiempo óptimo de digestión. Si hay suficiente tejido disponible, se pueden digerir varias rodajas en paralelo con diferentes tiempos de digestión.
  12. Cuando se digiere el tejido y los miocitos individuales son visibles (paso 4.11), lavar 2x con 2 ml de solución precalentada 2 (37 oC) y llenar de nuevo con 2 ml.

5. Disociación de tejidos

  1. Disociar las rodajas de tejido digerido con fórceps tirando cuidadosamente de las fibras.
  2. Pipeta cuidadosamente varias veces con una pipeta Pasteur de un solo uso (diámetro de apertura >2 mm).
    NOTA: El uso de fórceps y pipeteo puede inducir estrés mecánico y causar daño cardiomiocitos. Sin embargo, es un paso crucial para la separación de las células. Utilice fórceps finos para minimizar el daño celular y disociar cuidadosamente las rebanadas en trozos más pequeños.
  3. Compruebe si hay cardiomiocitos liberados en forma de varilla bajo el microscopio de luz.

6. Reintroducción de la concentración fisiológica de calcio

  1. Aumente lentamente la concentración de calcio de 5 a 1,5 mM mientras agita a 35 oC en la placa de calor. Utilice soluciones de stock de 10 mM y 100 mM CaCl2. Pasos recomendados: 20, 40, 80, 100, 150, 200, 400, 800, 1.200, 1.500 m. Permiten que las células se adapten al aumento de los niveles de calcio en intervalos de incubación de 5 minutos entre cada paso.
  2. Retire los trozos de tejido no digeridos cuidadosamente con fórceps o filtre la suspensión celular a través de una malla de nylon con un tamaño de poro de 180 m al final del aumento de calcio.

7. Eliminación del agente mecánico de desacoplamiento

  1. Detenga la agitación y retire lentamente un tercio de la solución (700 l) de la parte superior con una pipeta de 1.000 l. Evitar la aspiración de los cardiomiocitos.
    NOTA: Si se extrajo tejido no digerido, los cardiomiocitos se acumularán en el centro del plato, lo que facilita la aspiración de una solución libre de células. Si no es así, transfiera la solución celular a un tubo centrífugo de 15 ml y permita que las células se sedimenten durante 10 min a 35 oC, luego aspire 700 ml del sobrenadante y deseche, resusptale las células, transfiera de nuevo a un plato de cultivo de tejido de 35 mm y proceda con el paso 7.2.
  2. Añadir 700 l de solución 3 a las células, reanudar la agitación en la placa de calor e incubar durante 10 min.
  3. Repita los pasos 7.1 y 7.2.
  4. Transfiera la solución a un tubo centrífugo de 15 ml y permita que los cardiomiocitos sedimenten durante un mínimo de 10 min y un máximo de 30 min a temperatura ambiente o giren a 50 x g durante 1 min. Retire el sobrenadante por completo y resuspendir en la solución modificada de Tyrode o en el búfer de experimentación deseado.
    NOTA: Los cardiomiocitos se pueden almacenar en la solución modificada de Tyrode (Tabla 1) durante varias horas a 37 oC y 5% de CO2 antes de su uso.
  5. Verifique la calidad celular con un microscopio de luz estándar a 40x y 200x de aumento.
    NOTA: Alrededor del 30-50% de los cardiomiocitos deben tener forma de varilla, lisas sin manchas de membrana, y mostrar claras estrías cruzadas. Sólo entre el 5 y el 10% de las células viables deben mostrar contracciones espontáneas.

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Resultados

Para verificar la eficiencia del aislamiento, el protocolo se utilizó con miocardio de rata y el número resultante de miocitos viables se comparó con los números obtenidos por aislamiento a través de perfusión coronaria y por aislamiento de pequeños trozos de tejido (aislamiento de trozos, Figura 2). El aislamiento de los trozos y el aislamiento de las rebanadas de tejido se realizaron desde los mismos corazones. Para el aislamiento a través de perfusión coronaria, sin embargo, se utilizó to...

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Discusión

Aunque el aislamiento de los cardiomiocitos vivos se estableció hace más de 40 años y sigue siendo un requisito previo para muchos enfoques experimentales en la investigación cardíaca, sigue siendo una técnica difícil con resultados impredecibles. El aislamiento de cardiomiocitos a través de la perfusión de las arterias coronarias con solución enzimática se utiliza comúnmente para corazones de animales pequeños y produce un gran número de células viables. Sin embargo, esto requiere un sistema y experiencia relativamente ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a Andreas Dendorfer, del Centro Walter-Brendel de Medicina Experimental, LMU Munich, por su ayuda con el protocolo de corte. Por proporcionar muestras de tejido miocárdico humano, nos gustaría agradecer a Ghazali Minabari y Christian Heim del Departamento de Cirugía Cardíaca, Hospital Universitario Erlangen, Hendrik Milting del Instituto Erich & Hanna Klessmann, Ruhr-University Bochum y Muhannad Alkassar del Departamento de Cardiología Pediátrica, Hospital Universitario Erlangen. Para el apoyo con la citometría de flujo, nos gustaría dar las gracias a Simon V-ll y a sus colegas del Centro de Investigación Traslacional (TRC), Hospital Universitario Erlangen. También nos gustaría dar las gracias a Lorenz McCargo y a Celine Gracianinger del Instituto de Fisiología Celular y Molecular de Erlangen por su excelente apoyo técnico.

Este trabajo fue apoyado por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) en el Hospital Universitario de la Universidad de Erlangen-Núremberg, y la Universidad erlangen-Núremberg.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
químicos
2,3-butanedionemonoxiCarl Roth3494.1Pureza>99%
Albúmina sérica bovinaCarl Roth163.2
CaCl2Carl Roth5239.2
Creatina monohidratoAlfa AesarB250009
GlucosaMerck50-99-7
HEPESCarl Roth9105.3 KCl
Carl RothP017.1
KH2PO4Carl Roth3904.2
Ácido L-glutámicoFluka Biochemica49450
Agarosa de bajo punto de fusiónCarl Roth6351.5
MgCl2 x 6H2OCarl RothA537.1
MgSO4Sigma AldrichM-7506
NaClCarl Roth9265.1
NaHCO3Carl Roth8551.2
ParaformaldehídoSigma AldrichP6148
TaurinaSigma AldrichT8691
Tintes
Di-8-ANEPPSThermo Fisher ScientificD3167
Fluo-4 AMThermo Fisher ScientificF14201
FluoVoltThermo Fisher ScientificF10488
Enzimas
Colagenasa CLS tipo IWorthington LS004196Utilizada para tejido humano a 4 mg/mL
(actividad: 280 U/mg)
Colagenasa CLS tipo IIWorthingtonLS004176Utilizada para tejido de rata a 1,5 mg/mL
(actividad 330 U/mg)
Proteasa XIVSigma AldrichP8038Utilizada para tejido de rata a 0,5 mg/mL
(actividad ≥ 3,5 U/mg)
Proteinasa XXIVSigma AldrichP5147Se utiliza para tejido humano a 0,5 mg/mL
(actividad: 7-14 U/mg)
< material fuerte/> células fuertes
centrífuga, 15 mLCorning430790
Tubo de centrífuga, 50mL Corning430829
Edmund Bü control hlerKS-15 BDirección de agitación: horizontal
Pipetas pasteur de plástico desechablesCarl RothEA65.1Para la trituración de células, utilice únicamente pipetas con un diámetro de punta interior ≥
PinzaFST11271-30
HeatblockVWRBARN88880030
Filtro de red de nylon, 180 y micro; mMerckNY8H04700
TC Dish 100, EstándarSarstedt83.3902
TC Dish 35, EstándarSarstedt83.3900
TC Dish 60, EstándarSarstedt83.3901
Vibratome (VT1200S)Leica1491200S001Incluye VibroCheck para la corrección asistida por infrarrojos de la deflexión z
(LSR Fortessa)BD Bioscience 649225 Tubo de Agitador compacto de 2 mm

Referencias

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