Aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos de rebanadas de miocardio de corte de vibratome

Resumen

Presentado es un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares humanos y animales de rodajas de miocardio cortados por vibratome. Se pueden obtener altos rendimientos de células tolerantes al calcio (hasta 200 células/mg) a partir de pequeñas cantidades de tejido (<50 mg). El protocolo es aplicable al miocardio expuesto a isquemia fría durante un máximo de 36 h.

Resumen

El aislamiento de los miocitos cardíacos ventriculares de corazones animales y humanos es un método fundamental en la investigación cardíaca. Los cardiomiocitos animales son comúnmente aislados por perfusión coronaria con enzimas digestivas. Sin embargo, aislar los cardiomiocitos humanos es un reto porque los especímenes de miocardio humano generalmente no permiten la perfusión coronaria, y los protocolos de aislamiento alternativos resultan en rendimientos pobres de células viables. Además, los especímenes de miocardio humano son raros y solo están disponibles regularmente en instituciones con cirugía cardíaca in situ. Esto dificulta la traducción de los hallazgos de cardiomiocitos animales a humanos. Aquí se describe un protocolo fiable que permite el aislamiento eficiente de los miocitos ventriculares del miocardio humano y animal. Para aumentar la relación superficie-volumen y minimizar el daño celular, se generan rebanadas de tejido miocárdico de 300 m de espesor a partir de muestras de miocárdico con un vibratome. Las rodajas de tejido se digieren con proteasa y colagenasa. El miocardio de rata se utilizó para establecer el protocolo y cuantificar los rendimientos de miocitos viables y tolerantes al calcio mediante el recuento de células citométricas de flujo. La comparación con el método de trozos de tejido comúnmente utilizado mostró rendimientos significativamente más altos de los cardiomiocitos en forma de varilla (41,5 a 11,9 frente a 7,89 a 3,6%, p < 0,05). El protocolo se tradujo al miocardio humano en defecto y sin fallos, donde los rendimientos eran similares a los del miocardio de rata y, de nuevo, notablemente más altos que con el método de tejido-trozo (45,0 a 15,0 frente a 6,87 a 5,23 células/mg, p < 0,05). En particular, con el protocolo presentado es posible aislar un número razonable de cardiomiocitos humanos viables (9–200 células/mg) de cantidades mínimas de tejido (<50 mg). Por lo tanto, el método es aplicable al miocardio sano y en defecto de los corazones humanos y animales. Además, es posible aislar miocitos excitables y contráctiles de muestras de tejido humano almacenadas hasta 36 h en solución cardiopléjica en frío, haciendo que el método sea particularmente útil para laboratorios en instituciones sin cirugía cardíaca in situ.

Introducción

Una técnica seminal que ha allanado el camino a información importante sobre la fisiología cardiomiocitos es el aislamiento de cardiomiocitos ventriculares vivos de corazones intactos¹. Cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para estudiar la estructura celular normal y la función, o las consecuencias de los experimentos in vivo; por ejemplo, para evaluar los cambios en la electrofisiología celular o el acoplamiento excitación-contracción en modelos animales de enfermedad cardíaca. Además, los cardiomiocitos aislados se pueden utilizar para el cultivo celular, intervenciones farmacológicas, transferencia de genes, ingeniería de tejidos y muc....

Protocolo

Todos los experimentos con ratas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Mittelfranken, Baviera, Alemania. La recolección y el uso de muestras de tejido cardíaco humano fueron aprobados por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Erlangen-Núremberg y el Ruhr-Universidad Bochum. Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.

Las ratas Wistar hembras (150–200 g) se obtuvieron comercialmente, anestesiadas mediante la inyección de 100 mg/kg de tiopental-sodio intrap....

Resultados

Para verificar la eficiencia del aislamiento, el protocolo se utilizó con miocardio de rata y el número resultante de miocitos viables se comparó con los números obtenidos por aislamiento a través de perfusión coronaria y por aislamiento de pequeños trozos de tejido (aislamiento de trozos, Figura 2). El aislamiento de los trozos y el aislamiento de las rebanadas de tejido se realizaron desde los mismos corazones. Para el aislamiento a través de perfusión coronaria, sin embargo, se utilizó to.......

Discusión

Aunque el aislamiento de los cardiomiocitos vivos se estableció hace más de 40 años y sigue siendo un requisito previo para muchos enfoques experimentales en la investigación cardíaca, sigue siendo una técnica difícil con resultados impredecibles. El aislamiento de cardiomiocitos a través de la perfusión de las arterias coronarias con solución enzimática se utiliza comúnmente para corazones de animales pequeños y produce un gran número de células viables. Sin embargo, esto requiere un sistema y experiencia relativamente .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
químicos
2,3-butanedionemonoxi	Carl Roth	3494.1	Pureza>99%
Albúmina sérica bovina	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatina monohidrato	Alfa Aesar	B250009
Glucosa	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3 KCl
	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
Ácido L-glutámico	Fluka Biochemica	49450
Agarosa de bajo punto de fusión	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehído	Sigma Aldrich	P6148
Taurina	Sigma Aldrich	T8691
Tintes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzimas
Colagenasa CLS tipo I	Worthington LS004196		Utilizada para tejido humano a 4 mg/mL (actividad: 280 U/mg)
Colagenasa CLS tipo II	Worthington	LS004176	Utilizada para tejido de rata a 1,5 mg/mL (actividad 330 U/mg)
Proteasa XIV	Sigma Aldrich	P8038	Utilizada para tejido de rata a 0,5 mg/mL (actividad ≥ 3,5 U/mg)
Proteinasa XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Se utiliza para tejido humano a 0,5 mg/mL (actividad: 7-14 U/mg)
< material fuerte/> células fuertes
centrífuga, 15 mL	Corning	430790
Tubo de centrífuga, 50	mL Corning	430829
	Edmund Bü control hler	KS-15 B	Dirección de agitación: horizontal
Pipetas pasteur de plástico desechables	Carl Roth	EA65.1	Para la trituración de células, utilice únicamente pipetas con un diámetro de punta interior ≥
Pinza	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Filtro de red de nylon, 180 y micro; m	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Estándar	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Estándar	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Estándar	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Incluye VibroCheck para la corrección asistida por infrarrojos de la deflexión z

(LSR Fortessa)BD Bioscience 649225 Tubo de Agitador compacto de 2 mm