Summary
Målet med denne protokollen er å kontinuerlig overvåke dynamikken i den menneskelige bukspyttkjertelen og den medvirkende verten versus donorceller. Dette oppnås ved å transplantere menneskelige holmer inn i øyets fremre kammer (ACE) av et NOD. (Cg)-Gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/-mus mottaker etterfulgt av gjentatt 2-foton bildebehandling.
Abstract
Imaging betaceller er et viktig skritt mot å forstå holmetransplantasjon. Selv om ulike bildeplattformer for registrering av betacellebiologi er utviklet og benyttet in vivo,er de begrenset når det gjelder å tillate enkeltcelleoppløsning og kontinuerlige langsgående opptak. På grunn av gjennomsiktigheten av hornhinnen, er øyets fremre kammer (ACE) hos mus godt egnet til å studere menneskelig og mus bukspyttkjertelenseindøm. Her er en beskrivelse av hvordan denne tilnærmingen kan brukes til å utføre kontinuerlige langsgående opptak av pode og revaskularisering av individuelle menneskelige holmetransplantater. Menneskelige holmetransplantater settes inn i ACE ved hjelp av NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mus som mottakere. Dette gjør det mulig for undersøkelse av utvidelse av mottaker versus donorceller og bidrag fra mottakerceller i å fremme innkapsling og vaskularisering av transplantatet. Videre er en trinnvis tilnærming for bildeanalyse og kvantifisering av holmevolumet eller segmentert vaskulatur og holmekapseldannende mottakerceller skissert.
Introduction
Diabetes mellitus beskriver en gruppe metabolske sykdommer preget av forhøyede nivåer av blodsukker som følge av utilstrekkelig insulinproduksjon fra tap eller dysfunksjon av bukspyttkjertelens betaceller, ofte ledsaget av insulinresistens. Type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D) er komplekse sykdommer der den progressive dysfunksjonen av betacellene forårsaker sykdomsutvikling. T1D utløses av et autoimmunt angrep på betacellene, mens T2D anses å være drevet av metabolske faktorer, om enn med økende bevis på lavgradig systemisk betennelse1. Transplantasjon av donormenneskelige holmer, spesielt til T1D-pasienter, gir mulighet for å gi fysiologisk glykemisk kontroll. Mangel på vevsdonorer og dårlig holmegraftment har imidlertid forhindret at holmetransplantasjon blir et vanlig terapeutisk alternativ. En betydelig andel av det funksjonelle holmetransplantatet går tapt i den umiddelbare ettertransplantasjonsperioden (24–48 timer) på grunn av det hypoksiske, inflammatoriske, immunogene vertsmiljøet2,3. For å evaluere effektiviteten av intervensjonsmetoder for forbedring av holmeoverlevelse, er kontinuerlig overvåking av slike transplantasjoner nødvendig.
In vivo teknikker for å bilde og spore skjebnen til transplanterte menneskelige bukspyttkjertel holmer etter transplantasjon fortsatt en utfordring for diabetes forskning4,5. Hittil viser ikke-invasive bildeteknikker, inkludert positronutslippstomografi (PET), magnetisk resonansavbildning (MR) eller ultralyd (US) potensial for kvantifisering og funksjonell evaluering av transplanterte holmer under eksperimentelleforhold 5. Men gitt de små holmestørrelsene lider kvantitative målinger av disse modalitetene av utilstrekkelig oppløsning. Det fremre kammeret i øyet (ACE) som et transplantasjonssted for observasjon er en lovende ikke-invasiv bildebehandlingsløsning som tilbyr effektivt høyere romlig oppløsning og hyppig overvåking over lange tidsperioder6. Denne metoden har blitt vellykket utnyttet til å studere mus holme biologi (gjennomgått i Yang et al.7),autoimmuneimmunresponser 8, samt menneskelig holme pode9,10.
Her kombineres ACE-transplantasjonsmetoden med en 2-foton imaging tilnærming for å undersøke dynamikken i den menneskelige bukspyttkjertelen engraftment prosessen ved kontinuerlige og gjentatte opptak på individuelle holme grafts i opptil 10 måneder etter transplantasjon. Multiphoton bildeegenskaper av større bildedybder og redusert generell fotobleaching og fotoskade overvinne bildebegrensningene av konfokal mikroskopi11. Kvantifisering av fluorescerende bildebehandling innebærer flere stadier, inkludert preparat av holmeprøve, holmetransplantasjon, bildeinnsamling, bildefiltrering for å fjerne holmetøy eller bakgrunn, segmentering, kvantifisering og dataanalyse. Det mest utfordrende trinnet er vanligvis partisjonering eller segmentering av et bilde i flere deler eller regioner. Dette kan innebære å skille signal fra bakgrunnsstøy, eller klyngeområder av voxels basert på likheter i farge eller form for å oppdage og merke voxels av et 3D-volum som representerer holmevaskulatur, for eksempel. Når den er segmentert, er statistikk som objektvolumstørrelser vanligvis enkle å trekke ut. Forutsatt er en metode for kvantifisering og ekstraksjon av bildedata, for eksempel segmentering og datavisualisering. Spesiell oppmerksomhet er betalt for fjerning av autofluorescence i menneskelige holmer og skille mellom holme vaskulatur og holme kapsel danner mottakerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den regionale etikkkomiteen i Lund i Sverige godkjente studien etter loven om etisk gjennomgang av forskning som involverer mennesker. Dyreforsøk ble utført i henhold til den svenske etikken til dyreforsøk og godkjent av etikkkomiteene i Malmö og Lund. 6 til 8 uker gamle immunsviktede NOD. (Cg)-Gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/- (NIKK. ROSA- tomat. Rag2-/-) mottakermus ble brukt som mottakere for transplantasjon av menneskelige holmer10.
1. Holmepreparat for transplantasjon
- Kulturmenneskelige holmer i CMRL 1066 supplert med 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 μg/ml gentamycin, 0,25 μg/ml soppsone, 20 μg/ml ciproxfloxacin, 10 mM nikotinamimid (NIC) og 10 % varmeinaktivert humant serum ved 37 °C i 5 % CO2 og fuktig luft frem til transplantasjon, som beskrevettidligere 12.
MERK: Holmer skal være fri for eksokrinvev og ikke berøre hverandre i kulturen. Eksokrinvev vises gjennomskinnelig. - På transplantasjonsdagen overfører du kulturmedier som inneholder holmene til en ny petriskål ved hjelp av en aspiratorrørenhet koblet til en trukket glasskapillær.
MERK: Bruk alternativt en pipette på 200 μL. Faring på baksiden av petriskålen bidrar til å gjøre holmene lettere å skille seg under stereomikroskopet. - Bruk et stereomikroskop til å velge ~20–40 holmer per transplantasjon og overføre til et 1,5 ml rør. Fyll røret til toppen med kulturmedier fra inkubatoren.
- Forsegle rørene med parafinfilm og lagre på is til transplantasjon. Forbered en passende mengde for antall transplantasjoner utført.
- Alternativt må du sørge for at en CO2 inkubator er tilgjengelig i operasjonsrommet for å holde holmer i kultur og plukke dem umiddelbart før hver transplantasjon.
2. Utarbeidelse av transplantasjonsutstyr og operasjonstabell
MERK: Alle kirurgiske verktøy skal autoklaveres, og operasjonstabellen og instrumentene desinfiseres med 70% alkohol.
- Koble en stereotaksisk hodeholder til anestesi via en nesemaske og slå på varmeputen.
- Koble en gasstett Hamilton sprøyte til polyetylen rør og en stump end eye cannula.
MERK: Det anbefales å fylle alle deler med PBS før montering. Se etter fanget luftbobler og fjern hvis det er til stede. - Fest Hamilton-sprøyten tett til bordet (figur 1a) eller en bevegelig base (figur 1e) og fest slangen til stereomikroskopet, med kanylen hengende ned (det vil si ventestilling).
MERK: Bruk kirurgisk tape, fordi det er enkelt å fjerne og feste på nytt. - Forbered en 1 ml sprøyte koblet til en 30 G kanyle fylt med 0,1 mg/kg buprenorfinoppløsning.
- Forbered en sprøyte med steril PBS. Alternativt kan du bruke en pipette.
- Sett til side et rent vekkebur med varmelampe.
3. Anestesi og posisjonering av mottakermus for kirurgi
MERK: Alle dyr ble avlet og vedlikeholdt i et patogenfritt miljø ved dyreanleggene ved Lunds universitet.
- Bedøve musen i et kammer fylt med 40% O2/ 60% N2/ 3% isofluran og overføre bedøvet musen til hodeholderen plattform på en varm varmepute (Figur 1a). Se etter mangel på pedalreflekser.
MERK: Isofluran anestesi er den foretrukne metoden for anestesi for rask gjenoppretting etter operasjonen. Mikroskoprommet må ventileres riktig for å bruke isofluran. - Plasser snuten av musen i anestesimasken koblet til 40% O2/ 60% N2/ 0,9% -1,5% isofluran anestesi maskin. Bruk tommelen og fingeren til å løfte hodet litt opp og feste det ved hjelp av metallbitene på sidene. Pass på at øretelefonene fikser hodet rett under ørene. Injiser 0,1 mg/kg buprenorfinoppløsning subkutant på baksiden av musen.
MERK: Buprenorfin brukes som smertestillende. - Vipp hodet slik at øyet som skal betjenes på, vender oppover og er nær forskeren.
- Trekk forsiktig tilbake øyelokkene i øyet som skal transplanteres ved hjelp av stumpe pinsett, pop øyet ut og løs fikse med et par pinsett. Pass på at tuppene på pinsettene er dekket med et polyetenrør festet til hodeholderplattformen (figur 1a, innsats).
- Hold alltid begge øynene våte ved å påføre en dråpe steril PBS på øyet.
- Overfør de menneskelige holmene fra det forseglede 1,5 ml røret (avsnitt 1) til en petriskål med steril PBS og sørg for at holmene er nær hverandre for å minimere mengden cellekulturmedier som overføres (figur 1c).
- Plukk opp ~ 20-30 holmer i øyet kanyle koblet via polyeten rør til Hamilton sprøyten.
MERK: Ta opp så lite væske som mulig med holmene. - Heng slangen opp ned og fest til stereomikroskopet (figur 1d). Tape slangen forsiktig for å la holmene synke til enden av røret mot kanylen.
4. Transplantasjon prosedyre
MERK: Denne metoden har tidligere blitt beskrevet for transplantasjon av muse holmer6. En litt modifisert prosedyre presenteres her.
- Klyp putene på bakbenene for å være sikker på at musen sover.
- Stram tangen som begrenser øyet uten å forstyrre blodstrømmen og påfør en dråpe steril PBS på øyet.
- Bruk en 25 G nål som skalpell, skråkant oppover, trenger forsiktig inn bare halvparten av spissen i hornhinnen og gjør et enkelt lateralt snitt. Gjør hullet i en oppadgående vinkel; hullet vil forsegle lettere etter transplantasjonen (Figur 1f).
- Løft forsiktig opp hornhinnen med kanylen forhåndslastet med holmer og påfør langsomt holmer i øyet. Unngå innsetting av kanylen i fremre kammer for å forhindre skade på iris, men heller presse forsiktig mot hornhinnen åpningen (Figur 1g). Trekk kanylen langsomt tilbake fra ACE.
MERK: Sikt på et injeksjonsvolum på 3–8 μL. Hvis volumet er for stort, vil det utsette øyet for unødvendig høyt intraokulært trykk og kan føre til refluks av de injiserte holmene ut av fremre kammer. - Når du står overfor vanskeligheter med innsetting av holmene på grunn av økt trykk i øyekammeret, forstørre snittstedet ved å forsterke sideskjæringsstedet og bruke holmer på nytt.
MERK: Av og til kan introduserte luftbobler brukes som romholdere. - Påfør øyegelen på øyet, løsne øye-begrensende tang og la musen på isofluran i samme posisjon i 8-10 min for å la holmene sette.
- Fjern tangen som holder øyelokket og sett øyelokket tilbake til sin normale posisjon.
- Fjern musen fra hodeholderen og overfør den til et vekkebur.
- Når musen er våken og beveger seg, overføre den tilbake til det opprinnelige buret og holde i dyrehuset til skanning (minst 5 dager anbefales).
5. Avbildning av implanterte menneskelige holmer med 2-fotonmikroskopi
MERK: Å ta oversiktsbilder av øyet ved hjelp av et fluorescensstereoskopisk mikroskop (figur 2a–c) 4–5 dager etter transplantasjon før 2-fotonavbildning anbefales å lokalisere interesse holmene. Unngå å begrense øyet for tett så tidlig etter transplantasjon. Bruk 2-foton bildebehandling 6-7 dager ettertransplantasjon.
- Start programvare for bildeanskaffelse (se Materialtabell). I menyen "Laser" aktivere Mai Tai laser (Power "ON") og i"Light Path"menyen sett bølgelengden til 900 nm og bruke en minimal overføring lasereffekt starter med 5%-10% lasereffekt (bruk glidebrytere).
MERK: Juster lasereffekten etter behov under skanning. - Angi grønne, oransje og røde kanaler. Samle utslippslys samtidig på tre ikke-kantede detektorer (NDD) ved hjelp av et dichronic speil (LBF 760) og utslipp filterinformasjon som følger: Rød / Angiosense 680, 690-730 nm; Grønn/Autofluorescence, 500–550 nm; og oransje/tomat, 565–610nm (figur 2d).
- Plasser hodeholderstadiet på det motoriserte mikroskopstadiet og koble gassmasken til slangen til anestesimaskinen og slangen som er koblet til ventilasjonssystemet. Slå på varmeputen.
- Bedøve mottakermusen, overfør til hodeholderplattformen, hold øye for bildebehandling og administrer buprenorfinoppløsningen som beskrevet ovenfor (trinn 3.1–3.5).
- Juster isoflurandamper etter behov. En pustehastighet på ~55–65 åndedrag per minutt (bpm) indikerer optimal anestesi. Hvis anestesi er for dyp, vil hastigheten være <50 bpm med tung pust eller gisper; hvis det er for lett, vil hastigheten være > 70 bpm med overfladisk pusting. Nøye overvåke mus under anestesi ved visuell inspeksjon hver 15 min.
MERK: Bedøvelse varierer fra mus til mus, mellom musestammer, og etter hvert som tiden under anestesi utvikler seg13. - Administrer nok øyegel på øyet som en nedsenkingsvæske mellom hornhinnen og linsen, slik at den sakte akkumuleres (Figur 2f, innsats). Unngå luftbobler.
MERK: Sidebelysning med en fleksibel metallslangelampe anbefales å justere fokus og lokalisere holmetransplantater. - For å visualisere blodkar, administrer 100 μL av bildemidlet (f.eks Angiosense 680) intravenøst inn i halevenen ved hjelp av en engangsinsulin 30 G sprøyte.
- I "Oppkjøpsmodus" justere rammestørrelsen til 512 x 512 og skannehastigheten.
MERK: Langsommere skanninger (dvs. økende oppholdstid) vil forbedre signal-til-støy-forholdet. - I menyen "Kanaler" justerer du Master Gain for hver PMT i Volts for å forsterke signalet til et bilde vises på skjermen i Live-skannemodus. Live Jo høyere denne verdien er, desto mer følsom blir detektoren til signal og støy.
MERK: Hold fortrinnsvis verdier mellom 500–800 V. - I menyen "Z-stack" definerer du begynnelsen og slutten av z-stakken ved å flytte fokuset manuelt til toppen av holmetransplantaten. Lagre posisjon ved å velge "Still inn først". Flytt til det siste bunnplanet som kan fokuseres i holmetransplantatet og lagre posisjon ved å velge"Angi siste". Bruk en z-trinns størrelse på 2 μm.
- Samle den endelige bildestakken ved å klikke på"Start Experiment" -fanen og lagre som 8-biters CZI (det vil si Carl Zeiss-format) fil.
6. Avbildning av implanterte menneskelige holmer ved konfokal mikroskopi
MERK: Det totale volumet, morfologien og plastisiteten til transplanterte holmer kan vurderes ved å overvåke in vivo-spredningssignalet i en egen skanning (det vil si separat spor) ved påvisning av laserbackscatter lys10. in vivo
- Ta ut hovedbjelkesplitteren (det vil si LBF Filter) og i dialogboksen"Light Path"satt opp et eget spor for konfokal bildebehandling. Velg Argon laser med bølgelengde på 633 nm og deteksjon på samme bølgelengde som laserlyset. Z-stabler er anskaffet med en trinnstørrelse på 2–3 μm for bakgrunnssekklyssignal.
- Juster z-stack-innstillingene på nytt for å sikre at du registrerer hele holmen (se trinn 5.10).
- Hent bildestakken og lagre som 8-biters CZI-fil.
7. Bildeanalyse
MERK: Kommersiell programvare (se Materials tabell) ble brukt for dette trinnet.
- Fjerne autofluorescence av holmen (figur 3b)
- I kategorien "Bildebehandling" velger du "Channel aritmetikk" og skriv "ch1-ch2". Dette oppretter en ny kanal 4 (ch 4); endre navn som "Vaskulatur".
MERK: Den grønne/autofluorescence-kanalen trekkes fra Rød/Angiosense-kanal. - Gjenta forrige trinn og skriv inn "ch3-ch2" for å opprette en ny kanal (5 lm); endre navn som "Tomat (alle)".
MERK: Kanalen Grønn/Autofluorescence trekkes fra Orange/Tomato-kanalen.
- I kategorien "Bildebehandling" velger du "Channel aritmetikk" og skriv "ch1-ch2". Dette oppretter en ny kanal 4 (ch 4); endre navn som "Vaskulatur".
- Definere holmemaske ved manuell tegning (figur 3c)
- Opprett en ny overflate (blått symbol) og velg " Redigermanuelt". Hold pekeren i"Velg" -modusog i 3D-visning unclick "Volume" (under Scene) for å visualisere seksjoner.
- For enklere diskriminering av holmer, aktiver alle kanaler, inkludert ch 1–ch 3.
MERK: Orange/Tomato-kanalen er nyttig for å definere holmekanter ved hjelp av tomatkapselsignalet. Alternativt kan du øke kanalintensiteten for å bruke flerkanals holme autofluorescence og detektor bakgrunnssignal som veiledning. - I kategorien"Tegning"velger du "Contour" og klikker "Tegn" for å begynne å tegne konturer rundt holmekantlinjen som starter i skiveposisjon 1.
- Gå til en ny skiveposisjon og gjenta tegnekonturer. Avslutt med den siste skiven på toppen av holmen og avslutt ved å klikke på"Opprett overflate"kategorien. Vanligvis er det nok å tegneth konturer hver 10.
- Segmentering av "Holmevaskulatur" og "Holme tomat" fluorescens ved hjelp av holme maske (Figur 3d).
- Velg det tidligere definerte"Holmemaske"-objektet,gå til redigeringsfanen (blyantsymbol), og klikk på fanen "Masker alle" , som åpner et nytt vindu.
- Velg den tidligere navngitte kanalen "Vaskulatur" (ch 4) i rullegardinmenyen for kanalvalg og aktiver alternativer "Dupliser kanal før du bruker maske", " Konstant inne /utsiden", og sett voxels utenfor overflaten til "0,000", som skaper en ny kanal; omdøpe som" Holmevaskulatur" (6 lm).
- Gjenta trinn 7.3.1 og 7.3.2 og velg den tidligere opprettede kanalen "Tomato (alle)" (ch 5) i rullegardinmenyen for kanalvalg for å opprette den nye kanalen; omdøpe som" Holme tomat" (7 lm).
- Overflategjengivelse av holmevaskulatur (figur 3e)
- Opprett en ny overflate i"Scene"-menyen, og velg " Automatiskoppretting".
- Sett kildekanalen til tidligere opprettet "Holmevaskulatur" (ch 6) og velg subtraksjon i bakgrunnen. Automatisk terskelestimering kan justeres om nødvendig. Sammenlign med den responderende fluorescenskanalen (f.eks. ved å blande inn/ut den nyopprettede overflatefanen). Fortsett i veiviseren.
- Du kan eventuelt bruke filtre. Velg for eksempel"Volum"og juster filteret (gult) i vinduet, som kan fjerne valgte overflateobjekter. Fullfør veiviseren og gi navn til det nyeoverflateobjektet " Holmevaskulatur".
- Segmentering av "Holme tomat vaskulatur" fluorescens signal (Figur 3f)
- I det tidligere opprettede"Islet vaskulatur" overflateobjektet, gå til redigering kategorien og klikk på "Maske alle" kategorien, som åpner et nytt vindu.
- Velg den tidligere navngitte kanalen "Holme tomat" (ch 7) i kanalen utvalg rullegardinmenyen og sett voxels utenfor overflaten til "10.000", som skaper den nye kanalen; omdøpe som" Holme tomat vaskulatur" (ch 8).
- Segmentering av "Tomatkapsel" fluorescens signal (Figur 3g)
- Velg "Channel Aritmetikk "ikategorien "Bildebehandling" og skriv "ch7-ch8", opprette den nye kanalen; omdøpe som "Tomatkapsel" (ch 9).
MERK:"Holmetomatvaskulatur" fluorescenssignal trekkes fra det totale "Holmetomat" fluorescenssignal.
- Velg "Channel Aritmetikk "ikategorien "Bildebehandling" og skriv "ch7-ch8", opprette den nye kanalen; omdøpe som "Tomatkapsel" (ch 9).
- Overflategjengivelse av "Holmetomatvaskulatur" og "Tomatkapsel"(Figur 3h)
- Følg trinn 7.4, og i veiviseren velger du kildekanaler "Holmetomatvaskulatur" (ch 8) eller "Tomatkapsel" (ch 9) for å lage nye overflateobjekter tilsvarende.
- Overflategjengivelse av total holmeoverflate (figur 3i)
- Åpne islet backscatter-filen og opprett en ny overflate.
- I veiviseren velger du " Automatiskoppretting" og definerer "Interesseområde".
MERK: "Interesseområde" brukes til å skille signalene fra flere holmer og definere dybden på holmen som skal analyseres (f.eks. topp 75 μm). - I "Absolutt intensitet" justere terskelen om nødvendig. Overflateobjektet kan klikkes på eller av for å krysssjekke med tilsvarende kanalintensitet. Lukk veiviseren.
- Kvantifisering (figur 3j)
- Velg et opprettet overflateobjekt i"Scene"-menyen og gå tilkategorien "Statistikk".
- Hvis du vil hente detaljerte volumdata i det valgte overflateobjektet,velgerdu kategorien " Detaljert " og velger "Spesifikke verdier" og "Volum" fra rullegardinmenyen. Hvis du vil hente en total volumverdi for det valgte overflateobjektet, går du til kategorien"Detaljert"og velger" Gjennomsnittsverdier".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ikke-merkede menneskelige holmer ble transplantert inn i ACE av 8 uker gamle kvinnelige NOD. (Cg)-Gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/-(NIKK. ROSA-tomat. Rag2−/−) mottakermus. For å forhindre menneskelig vevsavvisning ble immunsviktulære Rag2 knockout-mus valgt som mottakere. I disse transgene musene uttrykte alle celler og vev et membranmålrettet tomatfluorescensprotein (mT) som muliggjør klar identifisering av mottakeren og donorvevet. Gjentatt avbildning av holmetransplantater ved høyoppløselig 2-fotonmikroskopi kan identifisere mT+ mottakerceller som er involvert i engraftmentprosessen og deres dynamiske migrasjonsmønster.
Generelt var transplantasjonsoppsettet av menneskelige holmer i ACE av mottakermusene (figur 1a) lik syngeneiske muse holmetransplantasjoner med hensyn til holmeform og størrelse (figur 1b,c). Figur 1d, e viser en typisk transplantasjon med en detaljert skjematisk som viser sidesnittstedet (figur 1f) og spredning avholmer inn i øyekammeret (figur 1g) og et representativt utfall av injiserte muse holmer (figur 1h) eller menneskelige holmer (figur 1i). Graftingsraten for menneskelige holmer var generelt lavere (~30 %) enn for muse holmer (50–70 %). En mulig årsak til denne uoverensstemmelsen er at tilgjengeligheten av menneskelige holmer er uforutsigbar, vanligvis med bare en 1 dagers varsel, og også at de oppnådde holmene varierer i giveralder, donor BMI, renhet (45%-86%), og etterisolasjon kulturtid (2-5 dager). I motsetning kan holmeisolasjoner fra mus enkelt planlegges. Disse ble isolert fra 6–8 uker gamle (f.eks. unge voksne) mus med høy renhet og korte kulturtider over natten. Disse avvikene mellom mus og menneskelig holme grafts bør vurderes når du tolker resultatene.
In vivo fluorescens avbildning av menneskelige holme grafts ble kompromittert av betydelig interferens fra vev autofluorescens (figur 4). Visualiseringen av revaskulariseringsprosessen av ACE-transplanterte menneskelige holmetransplantater ved hjelp av avbildningsmidler ved hjelp av tradisjonelle bølgelengder i det synlige spekteret ble hindret av et lavt signal-til-støy-forhold og høyt nivå av naturlig holme autofluorescence, illustrert av bilder av en λ-skanning i spektralområdet på 500–700 nm (figur 4a) eller av den følsomme, ikke-kantede PMT-detektoren med filter for påvisning av dextran TR (610–675 nm) (figur 4b). Denne høye bakgrunnen ble ikke observert i muse holme grafts (Figur 4c). NIR-avgiret Angiosense 680 viste et synlig høyere signal-til-bakgrunn-forhold på grunn av reduksjon i bakgrunnsstøy i NIR-området 690–730 nm (figur 4d, figur 3a). Den ekstra innspillingen av en "ubrukt" kanal (det vil si 500–550 nm) kan brukes i et senere bildebehandlingstrinn for å fjerne gjenværende bakgrunnsstøy forårsaket av naturlig holme autofluorescence. Den 2-foton / confocal imaging oppsett (Figur 2d-f) ligner på tidligere beskrevetde 6, lagre for bruk av 900 nm 2-foton excitation og fluorescens påvisning av Angiosense 680, autofluorescence, og tomatkanaler med nondescanned PMTs 1-3 (Figur 2d). Det anbefales å måle laserutgangseffekten som når prøven for hvert mikroskopoppsett (figur 2e). Videre anbefales det å først bilde de podede holmene med stereomoskopi (Figur 2a-c), som vil bidra til å velge holmer av interesse og unngå 2-foton mikroskopibilder av en mislykket transplantasjon.
Formålet med å trekke ut kvantitative data fra mange bilder var å fjerne potensielle skjevheter i datavalg og å oppnå den statistiske kraften som er nødvendig for å oppdage en legitim effekt når man sammenligner eksperimenter. Kvantifisering fra fluorescerende avbildning av bukspyttkjerteløyer involvert flere trinn, som hver kan ha påvirket resultatene i en annen. Her ble interaktiv bildebehandlingsprogramvare brukt. Den inneholder funksjoner som tillater visualisering av volumbilder og objekter og identifisering av objekter i henhold til deres morfologi eller intensitet. Figur 3 illustrerer de forskjellige trinnene i bildesegmentering. Fjerning av autofluorescence ved subtraksjon av "autofluorescence" kanalen forbedret signal-til-støy forholdet (Figur 3a,b). Holmegrensen kalt "holmemaske" (figur 3c) og tilsvarende kanaler (figur 3d) ble definert manuelt. Segmenteringen av tomatsignalet i holmevaskulaturen og holmekapselen (figur 3f,g) og endelig overflategjengivelse (figur 3e,h, i ) ble brukttilå trekke ut kvantitative data.
Figur 5 viser en representativ langsgående bildebehandlingsøkt av samme humane holmetransplantat ved 2 uker, 2 måneder, 5 måneder og 8 måneder ettertransplantasjon i ACE av et NOD. ROSA-tomat. Rag2-/- mottaker mus. Illustrert er bilder med maksimal intensitet (MIP) av opprinnelig innspilte RAW-data (figur 5a), bearbeidede bilder etter fjerning av holmeausorescence (Figur 5b–e, f– i ),ogsegmenterte holmeobjekter, inkludert kapsel (figur 5j,m) eller holmevaskulatur som danner mT+ mottakerceller (rød, figur 5n–q) og total holmevaskulatur (grønn, figur 5n–q).
Figur 1: Transplantasjon av bukspyttkjerteløyer inn i øyets fremre kammer.
(a)Transplantasjon oppsett som viser bedøvet mus fast i stereotaksisk hodeholder og eksponert øye (inntrekt) ved siden av forberedt Hamilton sprøyte festet til bordet og stereomicroscope klar til å plukke muse holmer (b) eller menneskelige holmer (c). (d)Venteposisjon av øye kanylen lastet med holmer. (e) Transplantasjon i prosessen, og (f) skjematisk tegning av et enkelt lateralt snitt som brukes til å løfte hornhinnen forsiktig med tuppen av øyekanylen og dispensere holmer inn i fremre kammer (g). Bilde av øyet umiddelbart etter injeksjon av muse holmer (h) eller menneskelige holmer (i). Skala bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Avbildning av ACE-implanterte pankreasøyetransplantater.
(a)Eksperimentell fluorescerende stereomikroskopbildeoppsett. Widefield (b) eller fluorescerende bilde (c) av B6. ROSA-tomat holme grafts. (d)Forenklet ordning av utslippslysbanen. LBF: Laserblokkerende filter (hovedstrålesplitter); LP: Lang pass; BP: Band pass; PMT: Fotomultiplier. (e) Laserutgangseffekten avhenger sterkt av bølgelengden. Diagrammet viser faktisk laserutgangseffekt i watt (W) relatert til effektnivået til laserstrålen (%), målt for mikroskopoppsettet. Sirkel: 800 nm, rute: 900 nm, trekant: 1000 nm. (f)Eksperimentelt bildeoppsett som viser mottakermusen med ACE-transplanterte holmer (sett inn) montert på det motoriserte stadiet et kommersielt mikroskop. Skala bar = 100 μm Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bildesegmentering av en menneskelig holme podet i ACE av et NOD. ROSA-tomat. Rag2-/- mottaker mus.
(a)Original opptak: Vist er en 3D-gjengivelse av en bildestakk av en menneskelig holme med sammenslåtte kanaler eller optiske deler av delte kanaler Angiosense 680 (ch 1), autofluorescence (ch 2) og tomat (ch 3). (b) 3D gjengivelse av bildestakken med sammenslåtte kanaler eller optiske seksjoner med delte kanaler "Vaskulatur" (ch 4) og "Tomat (alle)" (ch 5) etter autofluorescence fjerning. (c) Holmemaske (gul). (d) 3D gjengivelse av bildestakken med sammenslåtte eller delte kanaler "holme vaskulatur" (6 lm, hvit), "holme tomat" (7 lm, rød). (e) Overflateobjekt "holmevaskulatur" laget fra 6. (f) 3D gjengivelse av bildestakken med sammenslåtte kanaler "holme vaskulatur" (6 lm, grønn) og "holme tomat vaskulatur" (8 lm, rød). (g) 3D-gjengivelse av "tomatkapsel" (lm 9) etter kanalundertraksjons lm 7–lm 8 eller optisk seksjon med sammenslåttekanaler" tomatkapsel " (9 lm, hvit), holmetomatvaskulatur (8 lm, rød) og holmevaskulatur (6 lm, grønn). (h)Overflategjengivelse av tomatkapsel (laget av 9 lm) og holmetomatvaskulatur (laget av 8 lm). (i) Holmesegmentering fra menneskelig holme ryggskjør signal som viser valg av "Region av interesse"(venstre) og segmentert overflateobjekt (midten) sammenlignet med kanalintensiteten (høyre). (j) Henting av data fra statistikkfanen. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Autofluorescence av menneskelige holmer.
Menneskelige holmer (a,b,d) eller B6 muse holmer (c) ble transplantert inn i ACE av NOD. Rag2-/- eller B6 mottaker mus og injisert med dextran TR(a-c) eller Angiosense 680 bildebehandlingsmiddel (d) for visualisering av blodkar. (a) λ-skanning av menneskelig holme pode i området fra 500-700 nm med 2-foton eksitasjon ved 900 nm. Maksimalt bildeprojeksjon (MIP) bilde av menneskelig (b) eller muse holme graft (c) spent på 900 nm og oppdaget med TR filteret (610-675 nm) av NDD. (d) MIP av en menneskelig holme pode spent på 900 nm og deteksjon med Angiosense 680 filter (690-730 nm) av NDD. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Transplanterte menneskelige holmer blir gradvis revaskularisert og innkapslet av mT som uttrykker celler av mottakeropprinnelse.
Menneskelige holmer transplantert inn i det fremre øyekammeret i NOD. ROSA-tomat. Rag2−/− mottakermus ble avbildet gjentatte ganger i opptil 8 måneder. Angiosense 680 ble injisert for visualisering av vaskulatur. (a)Maksimal intensitetsprojeksjoner (MIP) av originale registrerte RAW-data for split (vaskulatur, autofluorescence, mT) eller sammenslåtte kanaler og backscatter lyssignal ved 5 måneder ettertransplantasjon. MIPS av total vaskulatur alene(b–e) eller fusjonert med membran-målrettet tomatfluorescens (mT) (f– i )etterfjerning av holme automatiskflourescens (grønn, a). 3D-gjengivelser av segmenterte holmetomatkapsel(j–m) og holmetomatvaskulatur (rød) eller total holmevaskulatur (grønn) (n–q) ved angitte tidspunkter ettertransplantasjon. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode presenteres for å studere den menneskelige pankreasevevecelletransplantingsprosessen ved å observere involvering av mottaker og donorvev. Etter en minimal invasiv kirurgi implanterer menneskelige holmer inn i fremre kammer av et immunsviktfullt museøye, gjenoppretter musen raskt i løpet av minutter etter operasjonen. Prosedyren utføres på ett øye. Vanligvis, fra 5-7 dager postimplantasjon og utover hornhinnen er tilstrekkelig helbredet til å utføre intravital avbildning.
I denne protokollen er kvaliteten på de menneskelige holmetransplantater kritisk. Menneskelig holmekvalitet og dermed transplantasjonsutfall kan variere avhengig av donorens alder, BMI og isolasjonsprosess, samt tid for holmekultur før og etter ankomst. Menneskelige holmer behandlet fra organdonorpankreaser godkjent for klinisk transplantasjon og forskningsformål ble brukt med samtykke fra donorene. De ble oppnådd etter en prosess med bukspyttkjertel fordøyelse og holmerensing beskrevet andre steder12. I likhet med isolerte murine holmer gjennomgår disse holmene en rekke cellulære angrep som iskemi, mekanisk stress, tap av kjellerproteiner og delvis forstyrrelse av intra-holme endotelceller (EC) under enzymatisk fordøyelse trinn14,15. Til tross for stadig bedre kulturforhold og utvinning av et stort antall høykvalitets menneskelige holmer, er tiden til transplantasjon fortsatt en kritisk faktor. I løpet av de første dagene av kulturen viser menneskelige holmer et betydelig tap av intra-holme ECer og ved seks dager med kultur kan bare små endotelstrukturer i holmekjernen oppdages16. Dette tapet av intra-holme endotelceller kan utgjøre en kritisk faktor i redusert pode av menneskelige holmer, fordi donor holme ECer er viktige aktører i revaskulariseringsprosessen17.
Opprettholde sterilitet under transplantasjon prosedyren er avgjørende for å unngå øyeinfeksjoner i immunkompromitterte NOD. ROSA-tomat. Rag2-/- mus. Vanligvis utføres transplantasjonsprosedyrer under rene forhold ved hjelp av hansker, labfrakk, hodedeksel og munnmaske, men ikke inne i et biosikkerhetsskap. Alle brukte løsninger er sterile filtrerte, og sprøyter, kanyle, rør og gasbind skylles i 70% etanol. Oppvåkne bur er autoklavet. Selv om full sterilitet ikke kan garanteres på grunn av manuell håndtering av musen under prosedyren, har holmeforurensning eller øyeinfeksjoner ikke vært problemer med denne prosedyren.
Stabil og tilstrekkelig anestesi er en viktig og kritisk faktor for å redusere øyebevegelser og drift under lav bildefrekvens datainnsamling, og effektiviteten kan variere mellom ulike bedøvelsesmidler18. Under lys, generell isofluran anestesi beveger øyet av og til seg en langsom rullende måte og økt dybde av anestesi (fra 1–2 %) kan generelt redusere øyebevegelser. Den klare fordelen med å bruke inhalerbar anestesi er den raske effekten og gjenopprettingstiden. Det bør imidlertid påpekes at bruk av isofluran kan endre insulinsekresjon19.
Bildeanalyse og segmentering, eller partisjonering av et bilde i flere områder, er utfordrende og underlagt potensielle skjevheter i datavalg20. Segmentering tar sikte på å identifisere objekter som "holmevaskulaturen" for kvantifisering. Her ble metoder basert på intensitetsterskelen brukt på utvalgte områder (det vil si "absolutt intensitet") eller intensitetsforskjeller for å finne kanter (det vil si "bakgrunnsundertraksjon"). For tiden er det ingen universelle løsninger for segmentering i fluorescerende mikroskopi. En tilnærming er å eksperimentere med kommersiell programvare som støtter en rekke metoder. Hvis terskelen mislykkes på grunn av variasjonen i bakgrunnsintensiteten, kan små endringer i innstillingene for bildeopptak forbedre segmenteringsresultatene.
En begrensning av metoden ligger i det faktum at det menneskelige transplantatet blir raskere erstattet av mottakerceller og faktisk helt rekonstituert av mus mottaker endotelceller. Dette ville utelukke studier av menneskelige celleinteraksjoner hvis målet er å studere adoptivt overførte humane immunceller som migrerer inn i holmen parenchyma via interaksjoner med humane endotelceller. Men både i mus og menneskelig holme grafts oppstår lignende revaskularisering fra mottakeren og følger den forskjellige anatomiske 3D-planen som er spesifikk for arten.
Suksessratene for betacelleerstatningsterapi har fortsatt å forbedreseg . Likevel forblir ulike utfordringer med å evaluere effektiviteten av holmepode og overlevelse in vivo uløst på grunn av mangel på passende intravital bildeteknologi. Det fremre øyekammeret er et nyttig transplantasjonssted, som støtter gjentatt og langsiktig in vivo-avbildning av holmeceller for studiet av holmemorfologi, vaskulariseringsmønstre, betacellefunksjon og betacelledød ved en cellulær oppløsning.
Protokollen for å studere podeprosessen av humane holmetransplantasjoner i ACE-transplantasjonsstedet som rapporteres her, gir mulighet for langsgående overvåking av menneskelige holmer grafts med betydelig høyere oppløsning enn det som oppnås med andre alternative langsgående plattformer som MR21,22, PET23,SPECT24eller Bioluminescence25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Det svenske forskningsrådet, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, Det svenske stiftelsen for strategisk forskning Dnr IRC15-0067 til LUDC-IRC, Royal Physiographic Society i Lund, Diabetesförbundet og Barndiabetesförbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al.
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
