Summary
该技术的目的是通过肺膨胀和通过肺动脉注射放射性不透明聚合物化合物，对早期产后小鼠和成年小鼠的肺动脉网络进行活体可视化。还讨论了铸造组织的潜在应用。
Abstract
血管在三维空间中形成复杂的网络。因此，很难通过观察组织表面来直观地理解血管网络是如何相互作用和表现的。该方法提供了一种可视化肺部复杂三维血管结构的方法。
为此，导管插入肺动脉，血管同时冲洗血液和化学扩张，以限制阻力。然后，肺以标准压力通过气管膨胀，聚合物化合物以标准流速注入血管床。一旦整个动脉网络被填充并允许治愈，肺血管可以直接可视化或在微CT （μCT） 扫描仪上成像。
当手术成功时，可以欣赏从产后早期到成人的小鼠肺动脉网络。此外，在肺动脉床中演示时，此方法可应用于任何具有优化导管放置和端点的血管床。
Introduction
该技术的重点是使用小鼠聚合物化合物的肺动脉结构可视化。虽然在脑、心脏,和肾脏,1、2、3、4、5,2,3等全身血管病床上进行了广泛的工作，但有关肺动脉网络的准备和填充的信息较少。4因此，本研究的目的是扩展先前的工作6，7，8，7,8并提供详细的书面和视觉参考，调查人员可以很容易地遵循，以产生肺动脉树的高分辨率图像。
虽然有许多方法存在标记和成像肺血管，如磁共振成像，超声心动图，或CT血管造影9,9，10，其中许多模式未能充分填充和/或捕获小血管，限制了可以研究的范围。串行分段和重建等方法提供高分辨率，但时间/劳动密集型11，12，13。,1311,在传统的腐蚀铸造10、13、14、15、16中10,13,14，周围的软组织,完整性受到损害。甚至动物的年龄和大小也成为因素，当试图引入导管或，分辨率是缺乏的。另一方面，聚合物注射技术将动脉填充到毛细管水平，当与 +CT 结合使用时，可实现无与伦比的分辨率 5。从小到产后第14天的小鼠肺部样本已成功施用8个，并在几个小时内得到处理。这些可以无限期地重新扫描，甚至发送组织学准备/电子显微镜（EM），而不损害现有的软组织17。此方法的主要限制是 CT 设备/软件的前期成本、准确监测血管内压力方面的挑战，以及无法在同一动物中纵向获取数据。
本文以现有工作为根据，进一步优化肺动脉注射技术，将年龄/尺寸相关边界推至产后第1天（P1），取得显著效果。对于想要研究动脉血管网络的团队来说，这是最有用的。因此，我们为导管放置/稳定提供新的指导，加强对填充率/体积的控制，并突出提高铸造成功率的显著缺陷。然后，结果铸件可用于未来的表征和形态分析。也许更重要的是，据我们所知，这是引导用户完成这个复杂过程的第一个视觉演示。
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Protocol
此处描述的所有方法都已获得国家心肺和血液研究所的机构动物护理和使用委员会 （ACUC） 的批准。
1. 准备
- 将小鼠内向注入肝素（1单位/克小鼠体重），并允许其调节2分钟。
- 在CO2室中对动物实施安乐死 。
- 将鼠标放在手术板上的超前位置，用胶带将四肢固定到手术板上。使用放大镜进行精细解剖。
2. 暴露肺部和气管
- 用70%乙醇喷洒小鼠的腹侧，以尽量减少头发干扰。
- 用钳子抓住腹部皮肤，在脐带区域用剪刀做一个小切口。将剪刀尖滑入腹部肌肉和皮肤之间的筋膜层，并开始分离两层。用玫瑰色，去除腹部、肋骨和颈部的皮肤。
- 用剪刀打开腹部肌肉，在两侧横向切割，直到隔膜暴露。
- 轻轻抓住西腓过程，稍微抬起肋骨，通过薄的半透明隔膜最大化肺的视图。小心地在西腓工艺下方的隔膜上做一个小切口。肺部会塌陷，从隔膜上缩回。将隔膜从肋骨上解剖，注意不要划破肺膜。
- 找到并切断劣质的维纳卡瓦 （IVC） 和食道， 在那里他们通过隔膜。使用纱布清理胸腔中任何汇集的血液，避免与肺部接触。
- 再次抓住西腓， 轻轻地抬起。双边切开肋骨（大致在中轴线），避免与肺部接触。完全拆下前肋骨，在毛骨之前沿胸角进行最后的切割。
- 使用预填充注射器，用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）自由湿润肺部，以防止干燥。在整个过程中继续此例程。
- 使用钳子，抓住毛化，轻轻地从身体中抬起。使用剪刀，将 1-2 mm 的横向切割到毛骨管，切断夹骨，然后取出。这将暴露下面的胸腺。
- 抓住胸腺的每个叶，拉开，然后取出。使用亚多膜腺体重复此过程。最后，去除覆盖气管的肌肉组织。
注：解剖后，心脏、升主动脉（AA）、肺动脉躯干（PAT）和气管应可见。确保主动脉从树干上没有分裂或受伤。
3. PA导管和血液灌注
- 组装单元 1，将 15 厘米 PE-10 管线连接到 30 G 针的轮毂上，并连接到 PBS 中预加 10-4 M 硝化钠 （SNP） 的 1 mL 注射器上。通过推进柱塞来为油管加上，直到从该装置中清除所有空气（图1）。
注意： 如果吞咽， Snp 是有毒的。避免接触皮肤和眼睛。处理后彻底清洗皮肤。穿戴适当的个人防护装备。- 或者，组装单元 2。对于产后第 7 天 （P7） 及以下小鼠，使用 hemostat 将额外的 30 G 针从轮毂中分离出来，然后将针头插入单元 1 的管材的开端（图 1）。
- 而不是针，使用弯曲锋利的钳子抓住一端10厘米长的7-0丝绸。穿透心脏的顶点从一侧进入，并通过肌肉和另一侧的钳子尖。用另一组钳子抓住丝绸，拉大约2厘米长，然后系上领带。以缝合线的剩余8厘米结束，用毛毛拉扯心脏，将手术板的端子卷到手术板上。
注：这将造成紧张，进一步暴露伟大的血管和连接心脏到位，使更容易放置导管在肺动脉。 - 在 AA 和 PAT 下钩住弯曲钳子的尖端。通过开口将 3 厘米长的 7- 0 丝拉回，并创建单掷松缝合线。
- 使用剪刀向心脏顶点切开 1-2 mm 的切口，穿透薄壁右心室 （RV），以便插入导管（单元 1）。插入之前，确认系统中没有空气。将底管引入右心室，轻轻推进到半透明薄壁 PAT 中。
- 目视验证导管未进进左肺或右肺支点，且未与肺动脉分支点并起。使用胶带，将管子的后半部分固定到手术板上。
注：要识别房车，请使用钳子捏住心脏的右侧。与左心室不同，RV 相对薄的自由壁应易于抓住。 - 对于小于 P7 的小鼠，将单元 2 连接到微操纵器上，并使用上述操作器将单元的针端引入 PAT 中。
- 目视验证导管未进进左肺或右肺支点，且未与肺动脉分支点并起。使用胶带，将管子的后半部分固定到手术板上。
- 轻轻拧紧两个大容器周围的松散缝合线，并切割步骤 3.2 中创建的 8 厘米长的缝合线，使心脏恢复自然静止位置。导管现在牢固地固定在 PAT 内。
- 夹住心脏的左尿，让香水退出系统。
- 将含有SNP的注射器（第1单元或2单元，大小取决于）固定在注射器泵中，以0.05 mL/min的速度对溶液进行吸附，以冲洗血液并最大地扩张血管。血液/香水会通过被夹住的尿道退出。继续灌注，直到灌注运行清晰（+200μL在成年小鼠，较少为年轻的动物）。
注：在高粘度PBS/SNP中，为了节省时间，使用相对较高的输液率。更粘稠的聚合物化合物以较慢的速度注入，以防止过度填充、破裂，并最大限度地控制端点。
4. 气管切除术和肺通货膨胀
- 构建肺膨胀单元（图2）。
- 将一个灵活的塑料 24 G 静脉注射 （IV） 导管（取出针头）/蝴蝶输液设置为插管，连接到打开的 50 mL 注射器（无柱塞）。将注射器从环架上吊上。
- 向注射器中加入10%缓冲的甲醛。打开塞子，允许甲醛进入油管，并清除系统中的所有空气。关闭止毒针并提高注射器，直到半月板高于气管820厘米。
注意：甲醛是易燃、致癌、摄入时剧毒的，并引起皮肤刺激、严重眼部损伤、皮肤敏感和生殖细胞诱变。避免摄入和接触皮肤和眼睛。避免吸入蒸汽或雾气。远离点火源。穿戴适当的个人防护装备。
- 将两个松散的缝合线放在低于小软骨的 2-4 mm 之间。
- 使用剪刀，使一个小切口在小切口的肌腱韧带优于缝合线。
- 将 IV 导管插入开口，将尖端推进到两个松动的缝合线之外。
- 拧紧气管周围的缝合线，然后打开止损器。允许甲醛通过重力进入肺部，等待5分钟，让肺部完全膨胀。如果肺在通货膨胀期间粘附在肋骨上，用钝尖钳抓住肋骨的外方，并向各个方向移动，以帮助释放叶。不要直接接触肺部。
- 5分钟后，将静脉导管放回第一缝合线和粘液线之外。对第二个缝合重复。肺部现在以封闭、加压状态膨胀。
5. 铸造血管
- 在1.5 mL管中，准备1 mL的8：1：1溶液8 的聚合物：稀释剂：固化剂，并轻轻反转几次，以确保良好的混合。
- 从 1 cc 注射器中取出柱塞，用戴手套的手指盖住对方端，然后将聚合物化合物倒入注射器中。小心地重新插入柱塞，反转，并推进柱塞，以去除所有空气，并在注射器尖端形成半月板。
- 从针头轮毂上取出 SNP/PBS 注射器，将额外的 PBS 滴入轮毂以创建半月板。仔细检查轮毂是否被困空气，必要时进行开气，并改造半月板。将轮毂加入充满聚合物化合物的注射器。
注：在两端创建半月板会显著减少空气进入系统的机会。 - 将聚合物化合物填充注射器连接到注射器泵，并在 0.02 mL/min 时注入。
注意：对于较小的肺，较慢的速度可以帮助防止过度填充，但不是必要的。 - 监测化合物，因为它自由向下移动PE管，并注意到注射器体积，因为它进入PAT。继续填充，直到所有叶完全填充到毛细管水平，并停止注射器泵。再次检查注射器体积。
注：多次运行后，估计体积可用于测量近似端点（成人鼠标为±35 μL，P1幼崽为±5μL）。泵停止后，系统中的残余压力将继续将聚合物化合物推入肺动脉。所有肺叶应以类似的速度填充。 - 用光纤清洁擦拭覆盖肺部，自由应用 PBS，让尸体在室温下不受干扰地坐 30-40 分钟。在此期间，聚合物化合物将固化和硬化。
- 拆下导管，切断鼠标的手臂/下半部分，将头/胸部分放入一个 50 mL 圆锥体中，圆锥体中填充 10% 缓冲的甲醛过夜。
- 固定后，抓住气管，轻轻地将心肺单元与剩余的肋骨笼和胸部分离。将心/肺块放在填充的符号瓶中。丢弃其余的。
6. 铸造的替代血管床（表1）
注：每个靶点血管床可能需要不同的导管放置、输液率和最佳填充时间。因此，需要多种动物来铸造多个器官。
- 对于高于或低于隔膜的全身血管床，请遵循上述步骤1.1-2.5。请参阅门户系统和隔膜上的其他注释（表 1）。
- 抓住西腓过程与海莫斯特和削减肋骨双边（大致在中轴线）之前的内部胸动脉。
- 折叠仍然连接的肋骨，使其靠在动物的颈部/头部，完全暴露胸腔。
- 按照上面的步骤3.1，然后切除肺部。一旦胸大项大项 （TA） 可见，将弯曲钳子的尖端钩在它下面，比隔膜高 10 mm。抓住一个3厘米长的7-0丝绸，拉回通过TA下的开口，并创建一个单掷松散缝合线。重复此过程 ，在隔膜上方 8 mm。
- 对于优于隔膜的结构，使用弹簧剪刀在 TA 的腹体部分创建一个小孔（占总周长的 ±30），比步骤 6.4 中放置的松散缝合线低 2 mm。
- 对于低于隔膜的结构，则创建一个比松散缝合线优于 2 mm 的小孔。
- 根据动物的大小，将1号或2号单元引入容器中，超越松动的缝合线前进，轻轻将容器压上。
- 按照步骤 3.7，将注射器泵设置为 1.0 mL/min，并至少吸5 mL。香水将退出通过 IVC。
- 按照步骤 5.1 - 5.4 将输液率调整为 0.05 mL/min，实时直观地监控目标组织。
注：输液量将是器官和动物年龄的特异性。通过连接动脉分支导致非靶向血管床（即大脑、肝脏、肾脏、肠道）的连结，可以进一步限制体积。 - 遵循 5.6，然后取出目标组织并放在形式素中。
7. 微CT的样品安装、扫描和重建
- 使用石蜡薄膜，在扫描床上创建一个平面，并在此表面上将湿样品居中（图3A）。
注：如果检测到运动伪影，样品可能需要进一步稳定。 - 用额外的石蜡膜轻轻帐篷/盖样品，以防止脱水。特别注意不要将石蜡膜放在样品上，导致组织变形（图3B）。
- 使用表 2 中概述的 设置扫描示例 ，并在给定实验中标准化这些参数。
注意：这与实验/终结点相关。标准化所选参数，以便于比较样本。 - 转移重建的扫描以进行后期处理和分析。
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Representative Results
一个成功的演员将展示整个肺动脉网络的均匀填充。我们在C57Bl/6J小鼠中演示了这一点：产后一天P90（图4A）、P30（图4B）、P7（图4C）和P1（图4D）。通过控制流量和目视监测填充的实时，最远程血管的可靠终点实现了（图5A）。
常见的挑战包括肺部损伤、灌装不全、灌装不足或过度填充、导管粘附和动物体型。
如果肺部/气道受损，小泄漏会阻止肺部保持压力（图5B，C）。C在没有完全通货膨胀的情况下，很难对样本进行准确的定量和空间比较。为了尽量减少对肺皮瘤的风险，在切除肋骨时避免切得太紧，并在整个过程中使用PBS保持肺部湿润，以避免脱水和坚持周围的结构。如果在通货膨胀期间叶粘附在肋骨笼上，用钳子轻轻抓住肋骨（远离肺）的外方，并朝一个方向移动以释放叶。或者，具有平滑边缘的钝器（如铲子）可用于将膨胀的肺抬离或推开肋骨。当充气肺部时，坚持建议的压力参数，避免过度膨胀，因为这可能导致气道破裂。最后，在固定完成后，不要从胸腔中去除肺部。气管、肺和心脏应从胸腔的剩余部分整体中切除。
斑块（图5D）或不完整（图5E）灌装可能产生于"气闸"，其中空气通过导管引入血管系统，阻塞化合物的下游流动。为了尽量减少气闸的机会，在插入前（步骤 3.4）和注射器从 SNP/PBS 过渡到聚合物化合物期间，请警惕地清除导管尖端的空气。如果填充物仍然零碎或不完整，它可能是由于焦点/长段狭窄或折磨而增加血管阻力的迹象。血块也可能导致不完全的填充物，并很容易避免使用肝素在手术前。
注塑量不当会导致注油不足或过度灌装。当将化合物引入血管时，发生填充不足的情况（图5F）。或者，过度填充或过快引入太多聚合物化合物可能导致动脉破裂（图5G），或者更常见的是静脉过境（图5H）。使用注射器泵可以缓解这两个问题。调查人员应严格遵守建议的费率和数量限制，或根据其特定模型和优化确定自己的费率。在放大下实时监测聚合物化合物灌注至关重要，应将小动脉/毛细血管的填充用作终点。
将导管推进到肺干箱下太远会导致尖端楔入一个肺动脉分支，并造成流量不平衡。因此，一侧填充速度比另一侧快（图5I），这经常导致一个肺过度填充，另一侧填充不足。虽然导管粘附是这种情况下最可能的原因，但"气闸"和肝素的缺乏也是促成因素。
最后，较小的动物提出了自己的一系列额外的障碍。年轻的动物需要稳定的手，小错误就不那么宽容了。高品质的仪器，专为显微外科设计，在产后早期时间点变得更加重要。使用微操纵器不仅有助于放置，而且有助于防止导管脱位。利用小动物的注射器泵精确控制和管理端点也至关重要。
虽然特别显示肺血管，这个程序可以很容易地应用于系统靶血管床以及（表1）。除了上述挑战之外，选择正确的切入点也至关重要。通过胸大动脉铸造，为大多数血管床产生出色的效果。但是，应当指出，尽可能将导管插入目标站点，并连接非目标血管有助于流量和体积控制。这些改进与对近端血管端点的适当直接监测（图6A-F）和标准输液率相结合，优化了灌装。Figure 6A这种铸造方法的许多例子存在于文献中，而且太多，无法完全引用。不过，其他细节可详可寻于器官的具体文本，例如4、5、7、18、19、20、21,7,18,19,20,21等。4,
铸造后，样品可处理为+CT扫描（图7A，B）。B对于后处理，商业软件包（见材料表）产生了肺血管树的3D体积渲染，呈现为静止图像（图7C），或电影。还可以进行进一步的统计分析，探索血管特征，如段长度和数量、侵权度、顺序（生成或等级）、体积和街机长度。除了μCT扫描，铸造的样品也可以被清除，以获得毛图像或处理和切割组织学分析8。
图1：导管和针头设置。 注射器与附带的管子和针头（单元1和单元2）一起显示。插入：针头和管子的特写。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：肺通货膨胀设置。 环架、夹子、装满甲醛的注射器和带导管的导管。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：微CT样品制备预扫描. （A） 这里样品以石蜡膜基座为中心，（B） 这里样品居中，覆盖在石蜡基座上。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：血管铸造的肺在不同的发育阶段从3个月到1天大。 肺的肺视图， （A） P90 ， （B） P30 、 （C） P7 和 （ D ）P1请 点击这里查看这个数字的较大版本。
图5：聚合物化合物输液过程中理想 灌装和常见误差的例子。（A） 当达到灌装终点时，观察到一个坚固而精细的血管网络。（B） 完全膨胀的甲醛肺由白色虚线表示， （C） 低充气/放气的肺显示。由于肺气道受损，观察到了这一点。原始膨胀的位置由白色虚线表示，放气位置由黑色虚线表示， （D） 斑块填充：叶部分的血管保持未填充，而其他区域完全填充， （E） 不完全填充：聚合物化合物未能穿透肺的整个部分，（F） 下填：聚合物化合物未能填充远方血管，（ G） 特卢普：箭头指向从血管中挤出的聚合物化合物，（H） 静脉填充：注意指向动脉部分的箭头完全填充并延伸到静脉系统。静脉和静脉的口径要大得多， （I） 导管楔子：在这里，导管被分流到一条动脉中，防止右叶的血管完全填充，而左叶被过度填充。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6.血管铸造和端点在额外的器官。 （A） 肾：球状中聚合物化合物的蓬酸外观提供了终点。（B） 肝脏：注意在器官边缘可见的小血管。（C） 胃：小容器是可见的，并充满。（D） 大肠：小血管很容易辨认和填充。（E） 隔膜：这里的肌肉很薄，半透明，小填充血管明显。（F） 大脑：在皮层中可以看到小血管. 请单击此处查看此图的较大版本。
图 7.聚合物复合肺的CT图像和3D体积渲染。 （A） 单灰量重建肺片， （B） 这是由聚合物充注肺产生的CT扫描的最大强度投影， （C） 血管拱廊的3D体积渲染是使用市售软件制作的（ 见材料表）。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 目标动脉血管床 | 导管放置 | 输液方向 | 输液率 | 笔记 |
| 大脑 | 胸大动脉指向颅骨 | 逆行到卡罗蒂德 | .05 毫升/分钟 | 可调节胸大干，将鼠标翻转到易发位置，打开头皮，通过头骨直观地监测聚合物的进度。 |
| 隔膜 | 左文特 | 反降解到内部胸腔、咽癌和间层 | .05 毫升/分钟 | 打开肋骨侧面的窗口，使大部分肋骨和隔膜完好无损。 可调节左心室，夹住右心房，并监控隔膜的孔面的进度。 |
| 上肢肌肉 | 胸大动脉指向颅骨 | 逆行到胸腔和左亚克拉维安 | .02 毫升/分钟 | 为了优化肢体流动，系上肌状动脉并去除肢体皮肤，以便对聚合物进入肢体肌肉进行视觉监测。 |
| 肾 | 胸腔大项大马指向审计 | 动脉的逆向 | .05 毫升/分钟 | 内部血管被盲目填充。 为了避免静脉过境，当聚合物在肾脏上以均匀的蓬酸盐模式可见时停止注射。 |
| 门户系统 | 门户脉络 | 进入门户系统 | .02 毫升/分钟 | 轻轻折叠肝脏以暴露门户静脉。 |
| 肝 | 胸腔大项大马指向审计 | 血管硬化进入肝动脉 | .05 毫升/分钟 | 输液前系上入口静脉，避免肠道静脉转流到肝脏。 |
| 胃/肠 | 胸腔大项大马指向审计 | 进入腹腔，上位肠和/或低劣的内肠 | .05 毫升/分钟 | 肠道的一些区域由多条动脉提供，并可能在不同的时间填充。 为了避免静脉过境，请系上感兴趣区域不需要的动脉，并直观地监控聚合物的进度。 |
| 腹内脂肪垫 | 胸腔大项大马指向审计 | 血管， 但容器取决于正在研究的脂肪垫 | .05 毫升/分钟 | 脂肪垫由多个动脉提供，并可能在不同的时间填充。 为了避免静脉过境，请将动脉系上精确感兴趣区域所需的动脉，并直观地监控聚合物的进度。 |
| 下肢肌肉 | 红外大项大肛门指向审计 | 进入股动脉的动脉 | .02 毫升/分钟 | 去除肢体皮肤，以便视觉监测聚合物进入肢体肌肉。 |
表1.铸造替代血管床。
| CT 设置 | |
| kvp | 90 |
| 目标材料 | 钨 |
| 权力 | 8W |
| 过滤 | Cu 0.06 mm = Al 0.5 mm |
| 投影编号 | 6424 |
| 探测器尺寸 | 平板 CMOS - 2944 x 2352 像素 |
| 视场 （FOV） | 36 毫米 |
| 体美音大小 | 72 μm |
| 空间分辨率 | 体美音大小 x 1.5 |
| 采集时间 | 14 分钟 |
| 重建 | FBP 和商业算法 |
| 装箱 | 1x1 |
表2.•CT扫描参数。
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Discussion
正确执行，这种方法产生肺动脉网络的惊人图像，允许在啮齿动物模型中进行比较和实验。沿途的几个关键步骤确保了成功。首先，调查人员必须在准备阶段对动物进行肝素化，以防止血块在肺血管和心脏腔室中形成。这允许聚合物化合物的完全动脉传递。其次，当刺穿隔膜和去除肋骨时，注意保护肺部免受意外伤害、割伤或伤害。气道中的任何泄漏都会防止完全膨胀，使样品之间的比较不准确。第三，将心脏系在顶点有助于导管放置。第四，使用强血管扩张剂，如SNP将有助于去除血液和彻底填充动脉和毛细血管5,5，8。第五，当将导管放入 PAT 时，注意不要将导管埋在分叉中。这会导致流量不平衡，将聚合物化合物分流到左侧或右侧，从而产生不等的压力梯度。第六，使用注射器泵将允许用户控制速率和滴度体积到小鼠应变和年龄。最后，将心脏/肺附着在胸腔的剩余部分，过夜修复，第二天取出。肺部将修复良好，分离过程中意外刻痕导致通货紧缩的可能性将降至最低。
虽然此方法实现了预期的结果，但替代技术可能对某些用户有所帮助。为了帮助导管的放置，可以使用微操纵器。我们选择了具有小轮廓和磁性底座的版本，以最大限度地减少在已经有限的工作区域的侵蚀，同时提供稳定的底座（如果使用磁性底座，请确保在工作空间下放置一个钢板，以便磁体接合）。这允许用户精确地将导管尖端放在 PAT 中，其角度遵循动脉的自然轨迹。此外，导管是安全的，被脱落的风险较小。另一种选择是使用喇叭导管尖端8。虽然创建不是微不足道的，但喇叭导管更安全，更不倾向于意外地滑出 PAT。 改变聚合物的比例：稀释剂会改变粘度和小容器的填充方便程度。根据目标血管和实验终点，这可能是一个有价值的考虑因素。通过CO2 安乐死可能导致一小部分动物的肺出血，并且是菌株依赖22。如果这会影响实验端点，请考虑另一种安乐死协议。当膨胀肺部时，使用甲醛有助于在给定压力下固定器官。如果外围容器需要填充未固定状态，可以替代生理中性缓冲液。如果输液率和控制对于给定的实验来说不那么重要，那么用手灌注也是可能的。手部注射需要在放大倍率下进行练习和实时监测，以避免过度填充或容器破裂8。最后，我们用于本文的组织安装/条件、扫描参数和最小的后处理应仅作为一个起点。不同的扫描仪、组织、实验端点/用户需求可能需要其他参数。
虽然从这种技术生成的血管图像是令人印象深刻的，有局限性。首先，由于输液期间无法监测和控制血管内压力，上述方法对测量血管口径不理想。其他组通过监测驱动压力4，23，在系统血管中设法解决这些4,压力问题，然而，由于肺动脉壁相对薄，由于压力24小的变化，以及无法精确测量和静态控制肺血管内压力，这些担忧在肺侧进一步放大。
这种方法的第二个限制是，它仍然是一个死后，单时间点实验，限制它在需要真正生理条件或时间课程的研究效用。其他活的动物措施，如CT肺血管造影术（CTPA）或对比增强型+CT（CE-CT）提供了功能和形态测量的可能性。反复扫描/纵向研究，以及测量在心脏/肺周期的不同点，可以探索10，25，26，27，28。,25,26,27,28除了超声心动图外，这些方法还可以可靠地用于测量动脉口径。然而，CTPA和超声心动图测量目前仅限于对近位血管的评估。对于超声心动图，评估仅限于肺干，而CTPA允许充分计算分支肺动脉口径可能进一步1-2命令，但分辨率是有限的，掩盖血管7的远点部分。辐射剂量也是一个问题，在使用CT时，特别是多扫描纵向研究29，30时，应仔细监测。对于其中任何一个应用，μCT 设备、扫描时间和分析软件可能非常昂贵，需要专门的员工培训。一些机构的动物成像核心设施可能会减轻这一负担。
作为这种化合物的替代品，一些组采用传统的腐蚀铸造技术，伴随着软组织去除3131，32。32这些方法产生的结果类似于这种聚合物化合物，但最终产品是脆的，导致潜在的工件15。此外，切除软组织消除了未来组织学33的潜力。另一种选择是保持软组织完好无损，并执行后续步骤，其中软组织被"清除"，使样品几乎透明34，35。34,组织清除使用户能够在样本中更深入地查看，但总的来说，它仍然不如 +CT，因为它无法提供相同的 3D 可视化效果。串行组织分段和阵列断层扫描是提供超高分辨率的方法。虽然这种技术为令人兴奋的新的可能性打开了大门，但工作量呈指数级增长，对大群体11、12,并不特别有利。3D X射线组织学是一种非破坏性的方法，将+C和传统组织学，甚至EM 36，37，38。,37,38它采取更高水平的病理学视图，利用+C在全球范围内识别和准确地侦察感兴趣的区域，然后跟进常规组织学39。将低分辨率对比剂（或在某些情况下无对比度）与聚合物化合物替代到血管中，可能有助于尽可能提升这两种技术。另一种计算密集型的非破坏性方法是相位检索 +CT 成像40，41。当在对比度较弱或不可能的嘈杂数据上使用时，此方法可能很有价值。然而，该技术采用的聚合物化合物并没有受到这种限制。也就是说，在聚合物化合物可能稀释时，相位检索可能很有用，例如在近层血管43中。最后，立体学是肺定量结构分析的标准，44年来。它使用随机的，系统的采样对组织的横截面，作出三D推论，假设选定的样本有足够的代表性。虽然是一个强大的工具，它有可能导致错误和偏见。然而，将CT成像与立体学相结合，大有可为。
概述的方法相对简单，培训成功率为 >90%。一旦掌握，它允许完整和可靠的肺血管铸造。在固定剂中，组织和聚合物在未来的扫描、潜在组织学或EM46、47中保持无限期稳定。我们已经表明，这种技术可用于动物，像P1到成年，并相信胚胎铸造，通过肺动脉，是触手可及的。应该注意的是，这种技术可以简单地改变导管入口点并确定适当的端点，几乎应用于任何其他血管床。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
这项研究部分得到了NHLBI校内研究计划（DIR HL-006247）的支持。我们要感谢NIH鼠标成像设施在图像采集和分析方面的指导。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1cc syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml Glass Scintillation Vials | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL conical tubes | Cornin | 352098 | For sample Storage and scanning |
| 60cc syringe | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 silk suture | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 Software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | Primary Software |
| Amira 6.7 Software | Thermo Scientific | N/A | Alternative Sofware |
| CeramaCut Scissors 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| Ceramic Coated Curved Forceps | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 Tank | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| Dual syringe pump | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont Mini-Forceps | Fine Science tools | 11200-14 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Formalin | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| Gauze | Covidien | 441215 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13013-14 | |
| Heparin (1000USP Units/ml) | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos Software | Horos Project | N/A | Alternative Sofware |
| induction chamber | n/a | n/a | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | fiber optic cleaning wipe |
| Labelling Tape | Fisher | 15966 | |
| Magnetic Base | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT system | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil (Polymer Compound) | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 oz. of MV compound; 8 oz. of diluent; MV-Curing Agent |
| Micromanipulator | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml Insulin Syringe | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon Forceps Straight Teeth | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 tubing | Instech | BTPE-10 | |
| Phospahte buffered Saline | BioRad | #161-0780 | |
| Ring Stand | Fisher | S13747 | Height 24in. |
| Sodium Nitroprusside | sigma | 71778-25G | |
| Steel Plate | N/A | N/A | 16 x 16 in. area, 1/16 in thick |
| Straight Spring Scissors | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G Teflon I.V. Catheter | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| Surgical Board | Fisher | 12-587-20 | This is a converted slide holder |
| Universal 3-prong clamp | Fisher | S24280 | |
| Winged Inf. Set 25X3/4, 12" Tubing | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 Dissection Scope | Zeiss | n/a |
References
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