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Neuroscience

Doppia iniezione diretta di sangue nella Cisterna Magna come modello di emorragia subarachnoide

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

Abbiamo descritto in questo protocollo un modello di topo standardizzato di emorragia subarnoide (SAH) con una doppia iniezione di sangue intero autologo nella cisterna magna. L'elevato grado di standardizzazione della procedura a doppia iniezione rappresenta un modello medio-acuto di SAH con relativa sicurezza per quanto riguarda la mortalità.

Abstract

Tra i ictus, l'emorragia subaracnoidea (SAH) consecutiva alla rottura di un aneurisma arteriosa cerebrale rappresenta il 5-9%, ma è responsabile di circa il 30% della mortalità totale correlata all'ictus con un'importante morbilità in termini di esito neurologico. Un vasospasma cerebrale ritardato (CVS) può verificarsi più spesso in associazione con un'ischemia cerebrale ritardata. Diversi modelli animali di SAH sono ora utilizzati tra cui perforazione endovascolare e iniezione diretta di sangue nella cisterna magna o anche la cisterna prechiasmatica, ognuna con vantaggi e svantaggi distinti. In questo articolo, viene presentato un modello di topo standardizzato di SAH mediante doppia iniezione diretta di volumi determinati di sangue intero autologo nella cisterna magna. In breve, i topi sono stati pesati e poi anetiti con inalazione isoflurana. Poi, l'animale è stato posto in una posizione reclinata su una coperta riscaldata mantenendo una temperatura rettale di 37 gradi centigradi e posizionato in un telaio stereotattico con una curva cervicale di circa 30 gradi. Una volta in posizione, la punta di una micropipetta di vetro allungata riempita con il sangue arterioso omologato prelevato dall'arteria carotidea di un altro topo della stessa età e sesso (C57Bl/6J) è stata posizionata ad angolo retto a contatto con la membrana alanto-occipitale per mezzo di un micromanipolatore. Poi 60 L di sangue è stato iniettato nella cisterna magna seguita da un'inclinazione verso il basso di 30 gradi dell'animale per 2 minuti. La seconda infusione di 30 L di sangue nella cisterna magna è stata eseguita 24 h dopo la prima. Il follow-up individuale di ogni animale viene effettuato giornalmente (attenta valutazione del peso e del benessere). Questa procedura consente una distribuzione prevedibile e altamente riproducibile del sangue, probabilmente accompagnata da un'elevazione della pressione intratrattale che può essere imitata da un'iniezione equivalente di un fluido spinale cerebrale artificiale (CSF), e rappresenta un modello acuto a lieve di SAH che induce una bassa mortalità.

Introduction

L'emorragia subarachnoide (SAH) rappresenta fino al 5% di tutti i casi di ictus e costituisce una patologia relativamente comune con un'incidenza di 7,2-9 pazienti ogni 100.000all'anno,con un tasso di mortalità del 20%-60% a seconda dello studio1,2,3 . Nella fase acuta, la mortalità è attribuibile alla gravità del sanguinamento, del sanguinamento, del vasospasmo cerebrale (CVS) e/o delle complicazioni mediche4. Nei sopravvissuti, la lesione cerebrale precoce (EBI) è associata all'estensione parenchimale dell'emorragia e al brusco aumento della pressione intratrattale, che può provocare ischemia cerebraleprimaria 5 e morte immediata in circa il 10%-15% dei casi6. Dopo lo stadio "acuto" iniziale di SAH, la prognosi dipende dall'insorgenza di ischemia cerebrale "secondaria" o ritardata (DCI), rilevata in quasi il 40% dei pazienti dalla tomografia computerizzata cerebrale e in fino all'80% dei pazienti dopo la risonanza magnetica(RMI) 7,8. Oltre al CVS che si verifica tra 4 e 21 giorni dopo la rottura dell'aneurisma nella maggior parte dei pazienti affetti da SAH, la DCI9 può derivare da lesioni cerebrali diffuse multifattoriali secondarie alla formazione di microtrombosi, ridotta perfusione cerebrale, neuroinfiammazione e depressione corticale (CSD)10,11,12,13. Questo colpisce il 30% dei sopravvissuti SAH e influisce sulle funzioni cognitive, tra cui la memoria visiva, la memoria verbale, il tempo di reazione e le funzioni esecutive, visuospatiali elinguistiche 14 che compromettono la vitaquotidiana 15. Le attuali terapie standard per prevenire il CVS e/o gli scarsi risultati cognitivi nei pazienti affetti da SAH si basano sul blocco della segnalazione e della vasoconstriction di Ca2 utilizzandoinibitori del canale Ca 2 come Nimodipine. Tuttavia, studi clinici più recenti mirati alla vasoconstriction hanno rivelato la dissociazione tra l'esito neurologico del paziente e la prevenzione del CVS16, suggerendo meccanismi patofisiologici più complessi coinvolti nelle conseguenze a lungo termine di SAH. Pertanto, vi è una necessità medica di una maggiore comprensione del numero di eventi patologici che accompagnano SAH e lo sviluppo di modelli animali validi e standardizzati per testare gli interventi terapeutici originali.

La rottura di un aneurisma intracranico per lo più responsabile di SAH negli esseri umani è probabilmente difficile da imitare nei modelli animali preclinici. Attualmente, la rottura dell'aneurisma e la situazione SAH possono essere provvisoriamente testati dalla perforazione dell'arteria cerebrale media (modello di puntura endovascolare) responsabile delle disfunzioni CVS e sensibilizzanti neitopi 17,18. A causa della mancanza di un possibile controllo sull'insorgenza del sanguinamento e della diffusione del sangue in questo modello, sono stati sviluppati altri metodi nei roditori per generare modelli SAH senza rottura endovascolare. Più precisamente, consistono nella somministrazione diretta di sangue arteriosa nello spazio subarachnoid attraverso una singola o una doppia iniezione nella magna cisterna19 o una singola iniezione nella cisterna prechiastmatica20. Il vantaggio principale di questi modelli murini senza rottura endovascolare è la possibilità di padroneggiare in modo riproducibile la procedura chirurgica e la qualità e la quantità del campione di sangue iniettato. Un altro vantaggio di questo modello rispetto al modello mediante perforazione endovascolare in particolare è la conservazione del benessere generale dell'animale. Infatti, questa chirurgia è meno invasiva e tecnicamente meno impegnativa di quella necessaria per generare una rottura della parete carotide. In quest'ultimo modello, l'animale deve essere intubato e ventilato meccanicamente, mentre un monofilamento viene inserito nell'arteria carotide esterna e avanzato nell'arteria carotidea interna. Questo probabilmente porta a ischemia transitoria a causa di ostruzione del vaso dal percorso di filo. Di conseguenza, la co-morbidità (stato moribondo, dolore importante e morte) associata alla chirurgia è meno importante nel modello di doppia iniezione rispetto al modello di perforazione endovascolare. Oltre ad essere un SAH più coerente, il metodo di doppia iniezione diretta è conforme al benessere degli animali nella ricerca e nei test (riduzione del tempo in anestesia, dolore da interruzione dei tessuti in chirurgia e disagio) e porta ad un numero totale minimo di animali utilizzati per lo studio del protocollo e la formazione del personale.

Inoltre, ciò consente l'implementazione dello stesso protocollo ai topi transgenici, portando ad una comprensione patologica ottimizzata del SAH e alla possibilità di test comparativi di potenziali composti terapeutici. Qui, presentiamo un modello di topo standardizzato di emorragia subarnoide (SAH) con una doppia iniezione consecutiva giornaliera di sangue arterioso autologo nella cisterna magna in topi maschi C57Bl/6J maschi di 6-8 settimane. Il vantaggio principale di questo modello è il controllo del volume di sanguinamento rispetto al modello di perforazione endovascolare, e il rafforzamento dell'evento di sanguinamento senza un drastico aumento della pressione intraranziale21. Recentemente, la doppia iniezione diretta di sangue nella cisterna magna è stata ben descritta sui problemi sperimentali e fisiologici nei topi. Infatti, abbiamo recentemente dimostrato CVS di grandi arterie cerebrali (basilar (BA), intermedie (MCA) e arterie cerebrali anteriore (ACA), deposizione di fibrina cerebrovascolare e apoptosi cellulare dal giorno 3 (D3) al 10 (D10), difetti di circolazione del liquido cerebrobroale paravascolare accompagnato da alterate funzioni sensibilizzanti e cognitive nei topi, 10 giorni dopo SAH in questo modello22. Così, rende questo modello padroneggiato, convalidato e caratterizzato per eventi a breve termine e di lunga durata post-SAH. Dovrebbe essere ideale per l'identificazione prospettiche di nuovi obiettivi e per gli studi su strategie terapeutiche potenti ed efficienti contro le complicanze associate al SAH.

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Protocol

Tutte le procedure sono state eseguite sotto la supervisione di H. Castel in conformità con il Comitato etico francese e le linee guida della direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio per la protezione degli animali utilizzati per scopi scientifici. Questo progetto è stato approvato dal CENOMEXA locale e dai comitati nazionali di etica per la ricerca e la sperimentazione sugli animali. I topi maschi C57Bl/6J Rj (Janvier), di età compresa tra 8 e 12 settimane, erano alloggiati in condizioni ambientali standard controllate: 22 gradi centigradi, 12 ore/12 ciclo di luce/scuro, e acqua e cibo disponibili al libitum.

1. Impostazione della chirurgia SAH e preparazione per l'iniezione

  1. Prima dell'inizio dell'intervento chirurgico, tirare un numero adeguato di capillari di vetro utilizzando un puller di micropipette. La pipetta di iniezione deve presentare un diametro interno di 0,86 mm e un diametro esterno di 1,5 mm.
  2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) per la condizione farsa.
    1. Preparare una soluzione con 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glucosio, 26,2 mM NaHCO3 in H2O, pH 7.4.
    2. Gas aCSF con 95% O2 e 5% CO2 per 15 min, quindi aggiungere 2,5 mM CaCl2.
    3. Sterilizzare l'aCSF ossigenato con un apparato filtrante di 0,22 m. La soluzione aCSF può essere stabile per 3-4 settimane a 4 gradi centigradi. Se è apparsa la contaminazione (soluzione che diventa torbid) o una formazione di deposito, scartare e fare aCSF fresco.
  3. Raccolta di sangue da un donatore di topi omologhi
    1. Isolare l'arteria carotide lungo la trachea e raccogliere la quantità massima di sangue mediante foratura dell'arteria carotidea.
    2. In pratica, mettere il topo in una camera di anestesia e caricare la camera con 5% isoflurane fino a quando l'animale perde conoscenza.
    3. Controllare la mancanza di riflessi bloccando uno dei due arti posteriori per consentire l'impostazione della procedura sperimentale chirurgica.
    4. Rivestire una siringa da 1 mL con una soluzione di epatina utilizzando un ago da 26 G (sodio di eparla). Questo impedirà la coagulazione del sangue durante i prossimi passi.
    5. Installare l'animale posizionato in decubito dorsale con le gambe distanti, e il naso in una maschera di anestesia (manutenzione dell'anestesia con 2 a 2,5% isoflurane).
    6. Isolare l'arteria carotide lungo la trachea sezionando il muscolo omoidoide longitudinalmente. Una volta isolata l'arteria, inserire l'ago verso il cuore con l'aiuto del gancio e delle forature e raccogliere il massimo del sangue tramite la puntura dell'arteria carotide (è necessario 60 L per topo SAH).
    7. Sacrificare il topo donatore anetizzato subito dopo la raccolta del sangue utilizzando la lussazione cervicale.

2. Preparazione degli animali (topi maschi C57BL/6J di 8-10 settimane)

  1. Pesare con precisione ogni mouse utilizzando un equilibrio elettronico. Nello studio corrente, i topi avrebbero peso corporeo nell'intervallo di 20 a 25 grammi appena prima dell'intervento chirurgico.
  2. Come spiegato in precedenza (c'è la procedura 1.3.2 e 1.3.3), indurre l'anestesia dei topi ad essere operati.
  3. Rasare il collo e lo spazio tra le orecchie con un taglia-elettrico adatto.
  4. Installare l'animale posizionato in decubito ventrale con le gambe distanti e il naso in una maschera di anestesia (manutenzione dell'anestesia con 2 e 2,5% isoflurane) su un telaio stereotattico.
  5. Controllare che il mouse dormi e che la sua testa sia correttamente bloccata.
  6. Iniettare sottocutaneamente 100 L di buprenorfina (0,1 mg/kg) con un ago da 26 G nella parte bassa della schiena, per evitare dolore dopo il risveglio.
  7. Prevenire gli occhi asciutti utilizzando gel liquido protettivo e mantenere una temperatura intrarettale di 37 gradi centigradi utilizzando una coperta elettrica auto-regolata.
  8. Trattare l'area rasata del collo posteriore con una soluzione antisettica (povidone-iodio o clorexidina utilizzando una strada di cotone sterile).
  9. Pre-sterilizzare tutti gli strumenti che toccano la pelle/tessuto sottocutaneo preparato (riscaldamento a 200 gradi centigradi per 2 ore) e maneggiare asepticamente.

3. Induzione SAH

  1. Il primo giorno (D-1)
    1. Tagliare un'incisione di 1 cm con forbici sottili nel collo posteriore, seguita dalla separazione dei muscoli lungo la linea mediana per accedere alla cisterna magna.
    2. Tagliare la punta della pipetta di vetro vuota con forbici sottili. Quindi, adattarsi a una siringa collegata a un connettore in silicone flessibile.
    3. Trasferire 60 L di sangue o aCSF (rispettivamente per SAH o finto) in un tubo da 0,5 mL utilizzando una micropipetta di precisione.
    4. Succhiare nella pipetta di vetro il 60 L di sangue per la condizione SAH o 60 L di aCSF per la condizione di finto.
    5. Per l'iniezione, installare la pipetta sul telaio stereotattico utilizzando un anello o un blu-virata e portare lentamente la punta della pipetta alla membrana all'interfaccia con la cisterna magna.
    6. Inserire lentamente la punta della pipetta attraverso la membrana alanto-occipitale nella cisterna magna, utilizzando un micro-manipolatore del telaio stereotattico.
    7. Collegare la pipetta precedentemente riempita con sangue o aCSF alla siringa pronta per l'induzione della pressione.
    8. Iniettare premendo lo stantuffo ad un tasso basso di circa 10 L/min, per evitare una pressione intratrattale acuta.
    9. Durante l'iniezione, monitorare attentamente la frequenza respiratoria e la temperatura rettale.
    10. Al termine dell'iniezione, togliere con attenzione la pipetta tramite il micro-manipolatore e assicurarsi visivamente che non vi sia alcuna perdita durante il ritiro.
    11. Raggiungi l'emostasi usando un emostatico assorbibile ed esegui due suture con filo di sutura intrecciato non assorbibile.
    12. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, isolare e posizionare il topo in declino decubito e coprirlo con una coperta di sopravvivenza in una scatola aperta per tutta la durata del recupero.
  2. Secondo giorno di induzione (D0)
    1. Dopo 24 ore, indurre l'anestesia (vedere i punti 1.3.2 e 1.3.3). Iniettare di nuovo 100 L di buprenorfina (0,1 mg/kg) e prevenire gli occhi asciutti utilizzando gel liquido protettivo (c'è la procedura 2.7 e 2.8).
    2. Installare l'animale sul telaio stereotattico come il giorno prima.
    3. Rimuovere con cura le suture con microscissori.
    4. Preparare la membrana alanto-occipitale come prima e applicare la preparazione antisettica sulla zona rasata del collo con un'asta di cotone sterile.
    5. Iniettare 30 L di sangue o aCSF a un tasso basso (c'è la procedura da 3.1.2 a 3.1.8). Monitorare la frequenza respiratoria e la temperatura rettale.
    6. Al termine dell'iniezione, togliere con attenzione la pipetta e controllare l'assenza di perdita di sangue durante il ritiro.
    7. Raggiungi l'emostasi ed esegui due suture con filo di sutura assorbibile intrecciato.

4. Follow-up postoperatorio e fine dell'esperimento

  1. Immediatamente dopo l'intervento chirurgico, isolare e posizionare il topo in declino decubitus con una coperta di sopravvivenza sulla schiena in una scatola aperta durante il recupero.
  2. Pesare e osservare con attenzione il comportamento quotidiano di ogni topo fino al sacrificio (ad esempio, D7 post-chirurgia).
  3. Tra i punti finali umani, una significativa perdita di peso (>15% del peso) è classicamente notato. Una postura "hunched back", movimenti lenti, prostrazione, vocalizzazioni anomale di dolore e/o comportamento aggressivo significativo sono anche segni importanti di sofferenza animale. Se uno di questi segni o una combinazione di segni appare, il monitoraggio dell'animale viene rafforzato entro poche ore dal loro aspetto. Se il benessere dell'animale peggiora o non migliora entro 48 ore, si considererà che viene raggiunto un livello di sofferenza intollerabile e viene eseguita l'eutanasia.
  4. Al momento della scelta, sacrificare i topi anetitizzati per decapitazione, e raccogliere cervelli per ulteriori analisi.
  5. Eseguire l'eutanasia (decapitazione) dopo l'anestesia isoflurana (5%).

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Representative Results

Sequenza temporale sperimentale, procedura, follow-up e mortalità
Figura 1A e Figura 1B riepilogare il protocollo del modello SAH mediante doppia iniezione intracisterna di sangue. In breve, il primo giorno di induzione di SAH (D-1), 60 L di sangue prelevato da un topo omologa o 60 L di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sono stati iniettati nella cisterna magna in SAH o condizioni di finzione, rispettivamente. Il giorno successivo (D0), 30 L di sangue prelevato da un topo omologa o 30 L di aCSF sono stati iniettati nella cisterna magna in condizioni di SAH o Sham, rispettivamente. Ventiquattro ore dopo l'intervento chirurgico, l'uccisione dei topi e l'analisi del cervello hanno permesso di osservare la distribuzione del sangue negli spazi paravascolari come illustrato nella Figura 1C. Come indicatore sensibile per il benessere generale da D1 a sacrificio, il peso corporeo è stato valutato quotidianamente dal D1 al D8 e ha mostrato un significativo aumento di peso corporeo ridotto in SAH rispetto agli animali finti da D1 a D8 (Figura 1D), suggerendo un processo di recupero di lunga durata ed eventi patologici prolungati post-SAH. La mortalità post-operatoria è stata del 26,7% a D7, con la maggior parte degli animali che muoiono su D1 o D4 dopo l'intervento chirurgico(Figura 1D). La perfusione transcardile dell'inchiostro indiano a D5 ha consentito l'osservazione di CVS macroscopico, come illustrato nella Figura 1C.

Vasospasm cerebrale dopo SAH
Come mostrato da El Amki et al.22, CVS dell'arteria basilare (BA), dell'arteria cerebrale media (MCA) e dell'arteria cerebrale anteriore (ACA) era presente nel modello SAH mediante doppia iniezione intracisternale di sangue in ACA, MCA o BA da D3 a D10 post-chirurgia. Brevemente (Figura 2A), dopo il sacrificio e la decapitazione dei topi, i cervelli sono stati raccolti e post-fissi in paraformaldeide del 4% (PFA), e poi congelati a -80 gradi centigradi, prima di essere tagliati in fette trasversali di 20 m utilizzando un criostato. La colorazione dell'ematossina e dell'eosin è stata eseguita per BA (interaurale 0,40 mm; bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; bregma -1,22 mm) e ACA (interaural 4,90 mm; bregma 1,10 mm) per consentire l'identificazione CVS attraverso l'acquisizione sistematica di fette colorate utilizzando una telecamera montata al microscopio. Al fine di valutare l'assenza o la presenza di CVS macroscopici, è stato calcolato il rapporto di spessore dell'area del lume/parete per ogni arteria macchiata. Il più basso è il rapporto, il più grave è il CVS. Così, un CVS si è verificato in BA nel cervello SAH rispetto al cervello di topo finto (Figura 2B) ma anche in altre grandi arterie cerebrali (MCA, ACA, dati nonmostrati 22).

Disfunzioni Disfunzioni Sensibilitomotor dopo SAH
La misurazione di specifici disavanzi motori, ben descritta in questo modello SAH da El Amki et al.22 e Clavier et al.23, può essere considerata come un criterio di valutazione principale del risultato per testare specifici obiettivi terapeutici che regolano questi effetti a lungo termine associati alla SAH. Brevemente (Figura 3A), in D6 dopo l'intervento chirurgico, ogni topo è stato valutato nel test a campo aperto per 10 minuti. Tramite la versione 4.99 del software ANY-laze, sono stati registrati la distanza percorsa e il numero di allevamento e pendente. Ventiquattro ore dopo il test a campo aperto, ogni mouse ha preso parte a tre sessioni successive del test di camminata del fascio che hanno coinvolto, dopo un periodo di assu usbazione del dispositivo, la misurazione del tempo totale di camminata, il tempo per raggiungere la piattaforma e il numero di viaggi. I risultati sono stati espressi in media di tre sessioni. Come mostrato da El Amki et al.22, le disfunzioni sensibilizzanti valutate dal test di camminata del fascio a D10 post-chirurgia sono state mostrate per essere presenti nel modello SAH (Figura 3B). Al D9, l'attività spontanea dei topi valutati dal test in campo aperto durante 10 minuti, è stata anche significativamente influenzata da SAH come rilevato dalla distanza attraversata e dall'attività verticale rispetto alla condizione fittizia (Figura 3C).

Figure 1
come illustrato nella figura 1. Progettazione sperimentale, procedura chirurgica, distribuzione del sangue, vasospasmo macroscopico, peso corporeo e mortalità dopo SAH. (A) Diagramma schematico che mostra la progettazione sperimentale di questo protocollo. D-1 e D0 rappresentano i giorni di intervento con una doppia iniezione di 60 e 30 L di aCSF (Sham) o sangue (SAH) nella cisterna magna, rispettivamente. Da D1 a D8, i topi sono stati osservati e pesati quotidianamente. A D1, i cervelli sono stati raccolti per osservare la distribuzione del sangue in spazi paravascolari (C). D6 e D7 sono stati scelti come intervallo di tempo ottimizzato per le analisi comportamentali, tra cui test di campo aperto e travi. Al D8, i cervelli sono stati campionati per valutare CVS, come mostrato macroscopicamente in (C). (B) Procedura chirurgica di iniezione di sangue nella cisterna magna. Il sangue è stato raccolto dall'arteria carotide di un topo omologato. Dopo la preparazione e l'installazione degli animali su telaio stereotattico, è stata effettuata un'incisione della nuca nel collo posteriore, i muscoli posteri sono stati separati, e poi i muscoli sottostanti sono stati sezionati per aprire un accesso alla membrana vascolarizzata che delimita la cisterna magna. La pipetta è stata inserita nella cisterna magna prima dell'iniezione di sangue. (C) Illustrazione della distribuzione del sangue in spazi paravascolari ventiquattro ore dopo l'intervento chirurgico e di CVS macroscopico dopo la perfusione di inchiostro indiano cinque giorni dopo l'intervento chirurgico in SAH rispetto alla condizione Sham. (D) Evoluzione del peso da D-1 a D8 post-chirurgia in Sham (n.10) e SAH C57Bl/6J (n-15) topi. I topi SAH hanno mostrato una diminuzione della percentuale di aumento di peso corporeo da D1 a D8 rispetto ai topi fittizi (p<0.01). ANOVA con il test post hoc di Bonferroni per più test di confronto. Curva di sopravvivenza a seguito di un intervento chirurgico in topi finti (n.10) e SAH C57Bl/6J (n.15). I dati sono stati espressi come curve Kaplan Meier. I topi SAH hanno mostrato una mortalità più importante al D7 dopo l'intervento chirurgico rispetto ai topi finti (p<0.05). Test Mantel-Cox. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Progettazione sperimentale per l'analisi del vasospasmo cerebrale e il corso del tempo del vasospasmo cerebrale nell'arteria basilare dopo SAH. (A) Diagramma schematico che mostra la progettazione sperimentale del protocollo per la quantificazione CVS. Dopo la post-fissazione da parte del 4%PFA, i cervelli congelati sono stati tagliati in modo seriale utilizzando un criostato in fette trasversali di 20 m su vetrini rivestiti di gelatina. La colorazione Ematossilina ed Eosin (H&E) è stata eseguita da fette cerebrali recanti ACA, MCA e BA. Le microfotografie sono state acquisite utilizzando una fotocamera montata al microscopio con un ingrandimento 200x. L'area di Lumen e lo spessore della parete della nave sono stati quantificati utilizzando ImageJ con un semplice metodo cieco. (B) Corso di tempo di CVS in BA dopo SAH. Microfotografie rappresentative della colorazione H&E che mostrano la morfologia BA (zona lumen e spessore della parete) in finte e SAH fette cerebrali a D7 post-SAH. Istogrammi di quantificazione del rapporto di spessore dell'area di lume/parete che mostra CVS nella BA da D3 a D10 post-chirurgia (sezione , p<0.05). I dati sono stati espressi come media : SEM. n. 6/condizione. ANOVA con il test post hoc di Bonferroni per confronti multipli. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. Progettazione sperimentale per l'analisi comportamentale dei deficit di sensibilità a lungo termine dopo SAH. (A) Diagramma schematico che mostra la progettazione sperimentale del protocollo di analisi comportamentale dopo SAH. In breve, al D6 dopo l'intervento chirurgico, il comportamento dell'attività motoria dei topi è stato valutato da un test a campo aperto per 10 minuti, in cui è stata registrata la distanza coperta e il numero di allevamento e pendente. Dopo un periodo di riposo di 24 ore, il comportamento sensibile dei topi è stato valutato dal test di camminata del fascio, in cui sono stati registrati il tempo di per camminare, il tempo di raggiungere la piattaforma e il numero di viaggi. (B) Da El Amki et al.22: Nel test di camminata del fascio, i topi SAH hanno mostrato un numero maggiore di viaggi rispetto ai controlli in D7 (sezione , p<0.01), D10 (Sezione , p<0.001) e D14 (sezione , p <0.05) e con topi fittizi a D10 (z, p<0.05). (C) Da El Amki et al.22: I topi SAH hanno mostrato una distanza ridotta attraversata (Sezione , p < 0,05) e l'attività verticale rispetto ai topi Sham a D9 (Sezione , p < 0.01). ANOVA seguito dal test di confronto multiplo di Sidak. I dati sono stati espressi come media : SEM. n- 10-12/condizione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Nonostante l'intensità della ricerca nel campo della SAH e lo sviluppo di strategie terapeutiche come le opzioni di trattamento endovascolare e farmacologico in aumento negli ultimi vent'anni, la mortalità rimane elevata entro la prima settimana di ricovero ospedaliero e raggiunge circa il 50% nei successivi 6 mesi24,25. Questo modello preclinico attuale da doppia iniezione giornaliera di sangue arterioso omologa nella cisterna magna è stato riconosciuto per la sua validità e la sua associazione con un basso tasso di mortalità. Infatti, tra i modelli di roditori SAH, è stata segnalata una vasta gamma di tassi di mortalità: 0-16% di mortalità con singola iniezione di sangue in cisterna magn26,27,28,29,30,31,,3333,34,35, 10-33% mortalità con iniezione di sangue in cister prechiamatico20,27,36,37, 16-66% mortalità nel modello per perforazione endovascolare38,39,40,41,42,43,44,45 e 0-43% con il modello da doppia iniezione di sangue in cisterna magna34,35,46,47,,,48. Il basso tasso di mortalità nel modello (9% o 27%, a seconda dell'età dei topi) può derivare dalla debole quantità di sangue iniettato, dalla lentezza dell'iniezione e dall'inclinazione dell'animale evitando una pressione localizzata sul tronco encefalico, rispetto ad altri modelli di doppia iniezione. Nei pazienti affetti da SAH, la finestra di occorrenza di CVS viene rilevata classicamente a D4-D10 dopo l'emorragia. Tuttavia, negli animali, il tempo di esordio e la durata del CVS sono meno studiati e possono variare tra i modelli HSA, probabilmente a seconda dei protocolli sperimentali e delle specie animali21.

In questo contesto, il modello qui assomiglia alla fisiopatologia clinica SAH in termini di CVS associata a SAH. In generale, nel modello di perforazione endovascolare, CVS si verifica in MCA e BA dopo 1 ora nei ratti40 e dopo 3 giorni nei topi17. Nel modello per iniezione di sangue nella cisterna prechiasmatica, l'occorrenza di CVS è stata mostratatra due 49 eotto giorni 37 nei ratti. Nel modello di doppia iniezione in cisterna magna nei ratti, CVS si sviluppa tra 10 minuti29 e 3 giorni31. Siamo i primi a descrivere cinetica dell'aspetto del CVS in un modello murino di SAH per doppia iniezione, stabilendo CVS nelle principali arterie cerebrali (ACA, MCA e BA) da 3 giorni e subendo fino al decimo giorno post-SAH22, vicino a ciò che si osserva nei pazienti affetti da SAH. Quest'ultimo modello potrebbe essere definito come un modello esperto di SAH, abbastanza grave senza mortalità, consentendo lo esame di meccanismi e terapie mirati CVS.

Tuttavia, questo modello SAH del mouse può anche presentare alcuni limiti. Il primo punto è la mancanza di rottura della parete del vaso, come forse riprodotto nel modello SAH indotto dal collagene, attraverso la distruzione/digestione della lamina basale dei vasisanguigni 50. Per quanto riguarda l'insorgenza di CVS macroscopico, ridotto flusso sanguigno cerebrale (CBF) in alcuni territori cerebrali non è sistematicamente correlato con l'esito neurologico, quindi CBF dovrebbe essere valutato in questo modello proposto di SAH. Precedenti studi sui ratti che utilizzano laser Doppler Flowmetry in un modello SAH di doppia iniezione hanno dimostrato la diminuzione acuta CBF al 30-52% dal basale dopo la prima iniezione, con un ritorno alla linea di base dopo 2 o 3 giorni dopol'iniezione 51,52,53. D'accordo, è stato dimostrato da MRI una diminuzione di CBF del 33-50% a D3 e 27-44% a D5 dopo l'induzione SAH nei modelli a doppia iniezioneratto 54,55. La doppia iniezione nella cisterna magna consente una distribuzione prevedibile del sangue lungo lo spazio subarachnoid, risultante soprattutto nei coaguli di sangue intorno alla circolazione posteriore, ma può introdurre variazioni nei parametri fisiologici. Per evitare che la pressione intraranziale (ICP) si alzerà con il volume di sangue iniettato che entra nel canale spinale, entrambi con confusione con lemenomazioni funzionali 56, la scelta di rimuovere un volume equivalente di liquido cerebrospinale potrebbe essere fatta, come precedentemente fatto in altri modelli30,51. Nel modello qui, i topi finti hanno ricevuto un volume equivalente di aCSF o fisiologico 0,9% NaCl, a seconda dell'esperimento, ovviamente portando ad un aumento di ICP. Così, un aumento acuto di ICP si traduce in un aumento da 18 mmHg a 120 mmHg27,48,53 nella singola iniezione di sangue nel modello cisterna magna, da 46 a 107 mmHg27,37,49 nel modello di iniezione di sangue cisterna prechiasmatica, e da 27 a 110 mmHg 39,40,53,57,58 nel modello di perforazione endovascolare. Al contrario, la doppia iniezione di sangue in cisterna magna è stata associata ad un aumento ICP più piccolo da 60 a 67 mmHg48,53. Inoltre, l'azione di rimozione del CSF modificherebbe anche l'ICP e modificherebbe il CSF. Nel modello SAH qui, la decisione è stata di non rimuovere la CSF prima dell'iniezione di sangue, ma di accompagnare l'intervento chirurgico con una procedura che consiste nell'eseguire l'ittazione della testa dell'animale da 30 gradi. L'obiettivo è quello di attenuare l'ICP consentendo la distribuzione del sangue nella circolazione anteriore, un passo importante e necessario per imitare la fisiopatologia umana SAH. Nei pazienti affetti da SAH, viene rilevato un forte aumento dell'ICP ed è associato a un'ischemia cerebrale globaletransitoria 59, probabilmente contribuendo a una compromissione sostenuta dell'autoregulation e della perdita precoce delle cellule neuronali60. Tuttavia, dopo il primo evento post-SAH, un drenaggio ventricolare esterno precoce è spesso adottato per i pazienti affetti da SAH, per evitare il gonfiore cerebrale e l'idrocefalo61. Qui, il modello SAH a doppia iniezione potrebbe non essere grave al primo evento di sanguinamento per provocare le conseguenze dipendenti da ICP osservate nei pazienti, ma probabilmente riprodurre un ICP potenziato sostenuto e lieve per giorni post-SAH.

Inoltre, un altro parametro incontrollato nel modello SAH qui era le potenziali variazioni della pressione sanguigna arteriosa media (MABP) indotta da una procedura di iniezione di sangueeccessivamente rapida 27. Infatti, MABP in genere aumenta acutamente dopo SAH sperimentale per preservare la pressione di perfusione cerebrale e successivamente, cade al basale. Nel modello SAH qui, abbiamo iniettato sangue o aCSF (10 l/min) ad un tasso basso per evitare queste variazioni MABP. Per quanto riguarda gli eventi neurobiologici in questo modello imitando quelli osservati negli esseri umani, abbiamo precedentemente mostrato che il modello di doppia iniezione di sangue di SAH induce CVS di lunga durata, formazione di microtrombosi e danni cerebrali tra cui difetto nella potenziale diffusione paravascolare dal giorno 3 al giorno 10 post-SAH22. Tuttavia, dati recenti che descrivono che la CSD è coinvolta nella DCI13 associata a SAH sostengono fortemente il perseguimento di questo tipo di indagini nel modello murino di doppia iniezione. Ciò dovrebbe consentire scoperte scientifiche sull'impatto benefico delle nuove terapie mirate alla CSD.

Per concludere, il modello di doppia iniezione di sangue arteriosa intero nella cisterna magna è un modello master che permette un modo semplice per imitare la fisiopatologia SAH umana tra cui CVS, microtrombosi, infiammazione vascolare, deficit neurologici e tasso di mortalità. Rappresenta un modello convalidato per testare nuovi approcci terapeutici per il trattamento della morbi-mortalità associata a SAH.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo la piattaforma PRIMACEN (Normandie Rouen University, Francia) per le apparecchiature di imaging e Arnaud Arabo, la signora Julie Maucotel e la signora Martine Dubois, per l'alloggio e la cura degli animali. Ringraziamo la signora Celeste Nicola per aver prestato la sua voce alle riprese del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di maturazione Seinari Normandy, Fondation AVC sotto l'egida della FRM, Normandie Rouen University e Inserm. La regione della Normandia e l'Unione europea (progetto 3R). L'Europa è coinvolta in Normandia con il Fondo europeo di sviluppo regionale (ERDF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

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Neuroscienze Emissione 162 Emorragia subarachnoide cisterna magna topo vasospasm modello animale test sensitivo-motorio sangue
Doppia iniezione diretta di sangue nella Cisterna Magna come modello di emorragia subarachnoide
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Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

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