Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Двойная прямая инъекция крови в Цистерна Магна как модель субарахноидового кровоизлияния

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

Мы описали в этом протоколе стандартизированную модель мыши субарахноидского кровоизлияния (SAH) путем двойной инъекции аутологичной цельной крови в цистерна-магна. Высокая степень стандартизации процедуры двойного впрыска представляет собой модель SAH со средней и острой степенью безопасности в отношении смертности.

Abstract

Среди инсультов, субарахноидового кровоизлияния (SAH) последовательных разрыву церебральной артериальной аневризмы составляет 5-9%, но отвечает за около 30% от общей смертности, связанной с инсультом с важной заболеваемости с точки зрения неврологических результатов. Задержка церебрального вазоспама (CVS) может возникать чаще всего в связи с задержкой ишемии головного мозга. Различные модели животных SAH в настоящее время используются в том числе эндоваскулярной перфорации и прямой инъекции крови в цистерна magna или даже прехиазматические цистерны, каждый из которых проявляет различные преимущества и недостатки. В этой статье представлена стандартизированная модель мыши SAH путем двойного прямого введения определенных объемов аутологичной цельной крови в цистерна-мага. Короче говоря, мышей взвешивали, а затем обезболили при вдыхании изофлурана. Затем животное было помещено в положение лежа на нагретом одеяле, поддерживая ректальную температуру 37 градусов по Цельсию и расположившись в стереотаксической раме с изгибом шейки матки около 30 градусов. После того, как на месте, кончик удлиненного стекла микропьетта заполнены гомологичной артериальной крови, взятой из сонной артерии другой мыши того же возраста и пола (C57Bl/6J) был расположен под прямым углом в контакте с атланто-затылочной мембраны с помощью микроманипулулятора. Затем 60 мл крови вводили в цистерна magna с последующим наклоном животного на 30 градусов вниз в течение 2 минут. Второй вливание 30 мл крови в цистерна-магна был выполнен 24 ч после первого. Индивидуальное наблюдение за каждым животным проводится ежедневно (тщательная оценка веса и благополучия). Эта процедура позволяет предсказуемое и высоко воспроизводимое распределение крови, вероятно, сопровождается внутричерепным повышением давления, которое может быть имитировано путем эквивалентной инъекции искусственной спинномозговой жидкости (CSF), и представляет собой острую и мягкую модель SAH вызывая низкую смертность.

Introduction

Субарахноидное кровоизлияние (SAH) составляет до 5% всех случаев инсульта и представляет собой относительно распространенную патологию с заболеваемостью от 7,2 до 9 пациентов на 100 000 в год, со смертностью 20%-60% в зависимости от исследования1,2,3. В острой фазе смертность объясняется тяжестью кровотечения, перетечения, церебрального вазоспама (CVS) и/или медицинских осложнений4. У выживших ранняя черепно-мозговая травма (EBI) связана с паронхимальным расширением кровоизлияния и резким увеличением внутричерепного давления, что может привести к первичной ишемии головного мозга5 и немедленной смерти примерно в 10%-15% случаев6. После начальной «острой» стадии САХ прогноз зависит от возникновения «вторичной» или задержки ишемии головного мозга (ДЦП), обнаруженного почти у 40% пациентов церебральной компьютерной компьютерной компьютерной томографией, а у 80% пациентов после магнитно-резонансной томографии (МРТ)7,,8. В дополнение к CVS происходит от 4 до 21 дней после разрыва аневризмы у большинства пациентов SAH, DCI9 может быть результатом многофакторных диффузных поражений головного мозга вторичного формирования микротермобоза, снижение мозгового перфузии, нейровоспаления, и коркового распространения депрессии (CSD)10,11,12,13. Это влияет на 30% выживших SAH и влияет на когнитивные функции, включая зрительную память, вербальную память, время реакции, и исполнительной, visuospatial и языковые функции14 нарушение повседневной жизни15. Текущие стандартные методы лечения для предотвращения CVS и / или бедных когнитивных результатов у пациентов САХ основаны на блокировании Ca2 "сигнализации и сосудосуживания с помощью Ca2 " ингибиторы канала, как Nimodipine. Тем не менее, более поздние клинические испытания, направленные на сосудосуживающие, выявили диссоциацию между неврологическим исходом пациента и профилактикой CVS16,что позволяет предположить более сложные патофизиологические механизмы, участвующие в долгосрочных последствиях SAH. Поэтому существует медицинская потребность в более широком понимании количества патологических явлений, сопровождающих SAH и разработки действительных и стандартизированных моделей животных для тестирования оригинальных терапевтических вмешательств.

Разрыв внутричерепной аневризмы в основном отвечает за SAH у людей, вероятно, трудно имитировать в доклинических моделей животных. В настоящее время разрыв аневризмы и SAH ситуации могут быть предварительно проверены перфорации средней мозговой артерии (эндоваскулярная модель прокола), ответственных за CVS и чувствительностиомоторных дисфункций у мышей17,18. Из-за отсутствия какого-либо возможного контроля за наступлением кровотечения и диффузии крови в этой модели, другие методы были разработаны у грызунов для генерации моделей SAH без эндоваскулярного разрыва. Точнее, они состоят из прямого введения артериальной крови в субарахноидовое пространство через одну или двойную инъекцию в великой цистерне19 или одну инъекцию в пречиазматическую цистерну20. Основным преимуществом этих моделей мышей без эндоваскулярного разрыва является возможность воспроизведения хирургической процедуры и качества и количества инъекционного образца крови. Еще одним преимуществом этой модели по сравнению с эндоваскулярной перфорацией, в частности, является сохранение общего благополучия животного. На самом деле, эта операция является менее инвазивным и технически менее сложным, чем требуется для создания сонной стены разрыва. В этой последней модели животное должно быть интубировано и механически проветриваемо, в то время как монофиламент вставляется во внешнюю сонную артерию и переходит во внутреннюю сонную артерию. Это, вероятно, приводит к переходной ишемии из-за обструкции сосудов по проволочной дорожке. Следовательно, со-заболеваемость (умирающее состояние, важная боль и смерть), связанная с хирургией, менее важна в модели двойной инъекции по сравнению с эндоваскулярной перфорационной моделью. В дополнение к более последовательной SAH, двойной метод прямого впрыска соответствует благополучию животных в исследованиях и тестировании (сокращенное время под наркозом, боль от нарушения тканей в хирургии и бедствия) и приводит к минимальному общему количеству животных, используемых для исследования протокола и подготовки персонала.

Кроме того, это позволяет реализовать тот же протокол для трансгенных мышей, что приводит к оптимизированному патологическому пониманию САХ и возможности сравнительного тестирования потенциальных терапевтических соединений. Здесь мы представляем стандартизированную модель мыши субарахноидального кровоизлияния (SAH) путем двойной ежедневной последовательной инъекции аутологичной артериальной крови в цистерна-мага в 6-8 недель-старый мужчина C57Bl/6J мышей. Основным преимуществом данной модели является контроль объема кровотечения по сравнению с эндоваскулярной перфорационной моделью, а также усиление кровотечения без резкого увеличения внутричерепного давления21. В последнее время двойная прямая инъекция крови в цистерна-магна была хорошо описана на экспериментальных и физиопатологических проблем у мышей. Действительно, недавно мы продемонстрировали CVS крупных мозговых артерий (базиляр (BA), средний (MCA) и передние (ACA) мозговые артерии), цереброваскулярные фибрин осаждения и клеточного апоптоза с 3 дня (D3) до 10 (D10), дефекты циркуляции парасосудистой спинномозговой спинномозговой жидкости сопровождается измененным чувствительностью и когнитивными функциями у мышей, 10 дней после SAH в этоймодели. Таким образом, это делает эту модель освоенной, проверенной и охарактеризованной для краткосрочных и долгосрочных событий после SAH. Он должен быть идеально подходит для перспективного определения новых целей и для исследований по мощным и эффективным терапевтическим стратегиям против SAH-ассоциированных осложнений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры были выполнены под наблюдением Х. Кастеля в соответствии с Французским комитетом по этике и руководящими принципами Директивы Европейского парламента 2010/63/EU и Совета по защите животных, используемых в научных целях. Этот проект был одобрен местными CENOMEXA и национальными комитетами по этике по исследованиям и тестированию животных. Мышей C57Bl/6J Rj (Janvier), в возрасте 8-12 недель, размещались в контролируемых стандартных условиях окружающей среды: 22 градуса по Цельсию, 12 часов/12 часов светового/темного цикла, а также воду и пищу, доступные ad libitum.

1. Настройка SAH хирургии и подготовки к инъекциям

  1. Перед началом операции, потяните достаточное количество стеклянных капилляров с помощью микропиетт шкив. Впрысковый пипетки должен быть внутреннего диаметра 0,86 мм, а внешний - 1,5 мм.
  2. Подготовка искусственной спинномозговой жидкости (aCSF) для фиктивного состояния.
    1. Подготовьте раствор с 119 мМ NaCl, 2,5 мМ ККл, 1 мМ НаГ2PO4,1,3 мм MgCl2, 10 мМ глюкозы, 26,2 мМ NaHCO3 в H2O, рН 7.4.
    2. Газ aCSF с 95% O2 и 5% CO2 в течение 15 мин, а затем добавить 2,5 мМ CaCl2.
    3. Стерилизовать оксигенированный aCSF с помощью фильтра 0,22 мкм аппарата. Решение aCSF может быть стабильным в течение 3-4 недель при 4 градусах Цельсия. Если загрязнение (раствор становится облачным) или образование месторождения появился, отбросить и сделать свежие aCSF.
  3. Сбор крови от гомологичного донора мыши
    1. Изолировать сонную артерию вдоль трахеи и собрать максимальное количество крови путем прокола сонной артерии.
    2. На практике поместите мышь в анестезирую камеру и загрузите камеру 5% изофлураном до тех пор, пока животное не потеряет сознание.
    3. Проверьте отсутствие рефлексов, зажимая одну из двух задних конечностей, чтобы позволить установку хирургической экспериментальной процедуры.
    4. Пальто 1 мл шприц с раствором гепарина с помощью 26 G иглы (гепарин натрия). Это предотвратит свертывание крови во время следующих шагов.
    5. Установите животное, расположенное в спинном декубите с размывыми ногами, и нос в анестезию (поддержание анестезии с 2 до 2,5% изофлурана).
    6. Изолировать сонную артерию вдоль трахеи путем вскрытия омохоидной мышцы продольно. После изоляции артерии вставьте иглу к сердцу с помощью микродиссетких крючка и щипцов и соберите максимум крови через прокол сонной артерии (60 мл необходимо для мыши SAH).
    7. Пожертвовать обезболивающей донорской мыши сразу после сбора крови с помощью шейки матки вывих.

2. Препарат для животных (8-10-недельный C57BL/6J самец мышей)

  1. Взвешивать каждую мышь точно с помощью электронного баланса. В текущем исследовании, мыши будут иметь вес тела в пределах от 20 до 25 граммов непосредственно перед операцией.
  2. Как ранее объяснялось (см. шаги 1.3.2 и 1.3.3), индуцируют анестезию мышей для операции.
  3. Бритье шеи и пространство между ушами с подходящим электрическим клипером.
  4. Установите животное, расположенное в брюшном декубите с размывными ногами и носом, в анестезию (поддержание анестезии с 2 и 2,5% изофлурана) на стереотаксическую рамку.
  5. Убедитесь, что мышь спит и что его голова правильно заблокирована.
  6. Подкожно впрыснуть 100 мл бупренорфина (0,1 мг/кг) с иглой 26 Г в нижней части спины, чтобы избежать боли после пробуждения.
  7. Предотвратить сухие глаза с помощью защитного жидкого геля и поддерживать внутриректную температуру 37 градусов по Цельсию с помощью автоматического регулирования электрического одеяла.
  8. Лечить заднюю шею бритой области с антисептическим раствором (povidone-йод или хлоргексидин с помощью стерильной хлопчатобумажной дороге).
  9. Предварительно стерилизовать все инструменты, касаясь подготовленной кожи / подкожной ткани (нагрев до 200 градусов по Цельсию в течение 2 часов) и обрабатывать асептически.

3. ИНДУКЦИя SAH

  1. В первый день (D-1)
    1. Вырезать 1 см разрез с тонкими ножницами в задней шее, а затем разделение мышц вдоль средней линии, чтобы получить доступ к цистерна magna.
    2. Вырежьте кончик пустого стеклянного пипетки тонкими ножницами. Затем адаптируйтесь к шприцу, подключенному к гибкому силиконовому разъему.
    3. Передача 60 МЛ крови или aCSF (для SAH или фиктивного состояния, соответственно) в трубке 0,5 мл с помощью точного микропиетты.
    4. Вса сосут в стеклянный пипетки 60 МЛ крови для состояния SAH или 60 мл aCSF для фиктивного состояния.
    5. Для инъекций установите пипетки на стереотаксическую рамку с помощью кольца или синего-такса и медленно доведите наконечник пипетки к мембране при интерфейсе с цистерной магне.
    6. Медленно вставьте наконечник пипетки через атланто-затылочной мембраны в цистерна magna, используя микро-манипулятор стереотаксической рамы.
    7. Подключите пипетки, ранее заполненные кровью или aCSF, к шприцу, готовому к индукции давления.
    8. Впрысните путем нажатия поршеня с низкой скоростью около 10 мл/мин, чтобы избежать острого внутричерепного давления.
    9. Во время инъекций внимательно следите за частотой дыхания и ректальной температурой.
    10. В конце инъекции, тщательно снять пипетка через микро-манипулятор и визуально убедитесь, что нет утечки во время вывода.
    11. Достичь гемостаза с помощью абсорбируемого гемостата и запустить два шва с плетеными неабсорбируемой шовной нитью.
    12. Сразу после операции, изолировать и расположить мышь в упадке decubitus и покрыть его одеялом выживания в открытую коробку на время восстановления.
  2. Второй день индукции (D0)
    1. Через 24 часа индуцировать анестезию (см. шаги 1.3.2 и 1.3.3). Подкожно впрыснуть 100 мл бупренорфина снова (0,1 мг/кг) и предотвратить сухость глаз с помощью защитного жидкого геля (см. шаги 2.7 и 2.8).
    2. Установите животное на стереотаксическую рамку, как и накануне.
    3. Аккуратно удалите швы с помощью микросцисссоров.
    4. Приготовьте атланто-затылочной мембраны, как и раньше, и нанесите антисептический препарат на бритую область шеи стерильным хлопчатобумажным стержнем.
    5. Введите 30 МЛ крови или aCSF с низкой скоростью (см. шаги 3.1.2 до 3.1.8). Мониторинг частоты дыхания и температуры прямой кишки.
    6. В конце инъекции аккуратно снимайте пипетки и контролируйте отсутствие утечки крови во время отвода.
    7. Достичь гемостаза и запустить два шва с плетеной абсорбируемой затуманивать нить.

4. Послеоперационное наблюдение и окончание эксперимента

  1. Сразу же после операции, изолировать и положение мыши в упадке decubitus с выживания одеяло на спине в открытой коробке во время восстановления.
  2. Взвешивать и внимательно наблюдать за поведением каждой мыши до жертвоприношения (например, D7 после операции).
  3. Среди гуманных конечных точек, значительная потеря веса (йgt;15% от веса) классически заметил. Поза «сгорбленной спины», медленные движения, прострация, аномальные вокализации боли и/или значительного агрессивного поведения также являются важными признаками страданий животных. Если какой-либо из этих признаков или сочетание признаков появляется, мониторинг животного усиливается в течение нескольких часов после их появления. Если благосостояние животного ухудшается или не улучшается в течение 48 часов, будет считаться, что уровень невыносимых страданий достигается, и проводится эвтаназия.
  4. Во время выбора, жертвовать под наркозом мышей путем обезглавливания, и урожай мозга для дальнейшего анализа.
  5. Выполните эвтаназию (обезглавливание) после изофлурановой анестезии (5%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспериментальная хронология, процедура, наблюдение и смертность
Рисунок 1A и рисунок 1B обобщают протокол модели SAH путем двойной внутринацесонной инъекции крови. Короче говоря, в первый день индукции SAH (D-1), 60 мл крови, изъятой из гомологичной мыши или 60 мл искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) были введены в цистерна magna в SAH или фиктивных условиях, соответственно. На следующий день (D0), 30 МЛ крови, изъятой из гомологичной мыши или 30 мл aCSF были введены в цистерна magna в условиях SAH или Sham, соответственно. Двадцать четыре часа после операции, убийство мыши и анализ мозга позволили наблюдать распределение крови в параваскулярных пространств, как показано на рисунке 1C. В качестве чувствительного индикатора для общего благосостояния от D1 к жертве, вес тела ежедневно оценивался от D1 до D8 и показал значительное снижение веса тела в SAH по сравнению с фиктивными животными от D1 до D8 (Рисунок 1D), предлагая длительный процесс восстановления и длительные патологические события после SAH. Послеоперационная смертность составила 26,7% на D7 с большинством животных, умирающих на D1 или D4 после операции(Рисунок 1D). Транскардиальная перфузия индийских чернил на D5 позволила наблюдать макроскопического CVS, как показано на рисунке 1C.

Церебральный вазоспазм после SAH
Как показали El Amki et al.22, CVS базилярной артерии (BA), средней мозговой артерии (MCA) и передней мозговой артерии (ACA) присутствовал в модели SAH путем двойной внутринацесальной инъекции крови в ACA, MCA или BA от D3 до D10 после операции. Кратко (Рисунок 2A), после жертвы мыши и обезглавливания, мозги были собраны и пост-фиксированной в 4% параформальдегида (PFA), а затем заморожены при -80 градусов по Цельсию, прежде чем нарезать на 20 м поперечного ломтика с помощью криостата. Гематоксилин и эозин окрашивание было выполнено для БА (межауральные 0,40 мм; bregma -3.40 мм), MCA (межауревая 2,58 мм; bregma -1.22 мм) и ACA (межауревая 4,90 мм; bregma 1.10 мм) позволяет идентифицировать CVS с помощью систематического приобретения изображения цветных ломтиков с помощью камеры, установленной под микроскопом. Для того, чтобы оценить отсутствие или наличие макроскопических CVS, просвет области / стены толщина соотношение было рассчитано для каждой окрашенной артерии. Чем ниже коэффициент, тем серьезнее CVS. Таким образом, CVS произошло в БА в мозге SAH по сравнению с мозгом фиктивных мышей(Рисунок 2B), но и в других крупных мозговых артерий (MCA, ACA, данные не показали22).

Чувствительностьгомоторные дисфункции после SAH
Измерение специфических дефицитов двигателя, хорошо описанное в этой модели SAH El Amki et al.22 и Clavier et al.23, может рассматриваться в качестве основного критерия оценки результатов для проверки конкретных терапевтических целей, регулирующих эти долгосрочные эффекты, связанные с SAH. Кратко(Рисунок 3A), на D6 после операции, каждая мышь была оценена в открытом поле испытания в течение 10 минут. С помощью ANY-лабиринт программной версии 4.99, расстояние, охватываемое и количество воспитания и опираясь были записаны. Двадцать четыре часа после открытого поля испытания, каждая мышь приняла участие в трех последовательных сессий пучка ходьбы тест с участием, после устройства habituation период, измерение общего времени ходьбы, время, чтобы достичь платформы и количество поездок. Результаты были выражены в качестве среднего из трех сессий. Как показано На Эль Amki и др.22, чувствительностиомоторных дисфункций оценивается луч ходьбе тест на D10 после операции было показано, что присутствует в модели SAH (Рисунок 3B). На D9, спонтанная активность мышей оценивается в открытом поле испытания в течение 10 минут, также значительно повлияло на SAH, как обнаружено расстояние пересек и вертикальной активности по сравнению с фиктивным состоянием (Рисунок 3C).

Figure 1
Рисунок 1. Экспериментальный дизайн, хирургическая процедура, распределение крови, макроскопический вазоспазм, масса тела и смертность после SAH. () Схематическаядиаграмма, показывающая экспериментальную конструкцию этого протокола. D-1 и D0 представляют собой дни операции с двойной инъекцией 60 и 30 МЛ aCSF (Шам) или крови (SAH) в цистерна-магна, соответственно. От D1 до D8, мышей ежедневно наблюдали и взвешивали. В D1, мозги были собраны для наблюдения за распределением крови в параваскулярных пространств(C). D6 и D7 были выбраны в качестве оптимизированного временного окна для поведенческого анализа, включая открытые полевые и лучовые ходьбы. На D8, мозги были отобраны для оценки CVS, как показано макроскопически в (C). (B) Хирургическая процедура инъекции крови в цистерна magna. Кровь была собрана из сонной артерии гомологичной мыши. После подготовки животного и установки на стереотаксическую раму был проведен разрез затылка в задней шее, задние мышцы были разделены, а затем основные мышцы были вскрыты, чтобы открыть доступ к сосудистой мембраны делимитации цистерна magna. Пипет был вставлен в цистерна-магна перед инъекцией крови. (C) Иллюстрация распределения крови в параваскулярных пространствах двадцать четыре часа после операции и макроскопических CVS после транскардиальной перфузии индийских чернил через пять дней после операции в SAH по сравнению с состоянием Шама. (D) Эволюция веса от D-1 до D8 после операции в Шаме (n'10) и SAH C57Bl/6J (n'15) мышей. Мыши SAH показали уменьшение процента увеличения массы тела от D1 до D8 сравнены с фиктивными мышами (p'lt;0.01). ANOVA с пост-специальным тестом Bonferroni для нескольких сравнительных тестов. Кривая выживания после операции в фиктивных (n'10) и SAH C57Bl/6J (n'15) мышах. Данные были выражены как кривые Kaplan Meier. Мыши SAH показали более важную смертность на D7 после операции по сравнению с фиктивными мышами (p'lt;0.05). Тест Мантеля-Кокса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Экспериментальный дизайн для церебрального вазоспазма и временного курса церебрального вазоспазма в базилярной артерии после SAH. () Схематическаядиаграмма, показывающая экспериментальную конструкцию протокола для количественной оценки CVS. После постфиксации на 4% PFA, замороженные мозги были последовательно нарезанные с помощью криостата в 20 мкм поперечной ломтиками на желатин-покрытых стеклянными горками. Гематоксилин и эозин (Н И Е) окрашивание было выполнено из ломтиков мозга, несущих ACA, MCA и BA. Микрофотографии были приобретены с помощью микроскопа установленной камеры на 200x увеличение. Область lumen и толщина стены сосуда были оценены используя ImageJ простым слепым методом. (B)Время курс CVS в BA после SAH. Представитель микрофотографии Н И E окрашивания показаны BA морфологии (люмен области и толщины стены) в обмане и SAH мозга ломтиками на D7 пост-SAH. Количественная гистограмма просвета/коэффициент толщины стены, показывающая CVS в БА от D3 до D10 после операции (з, p'lt;0.05). Данные были выражены в качестве среднего - SEM. n'6/condition. ANOVA с пост-специальным тестом Bonferroni для нескольких сравнений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Экспериментальный дизайн для поведенческого анализа долгосрочного чувствительность-дефицит после SAH. () Схематическаядиаграмма, показывающая экспериментальную конструкцию протокола поведенческого анализа после SAH. Короче говоря, в D6 после операции, двигательная активность поведение мышей была оценена открытого поля испытания в течение 10 минут, в котором пройденное расстояние и количество воспитания и наклона было записано. После 24 ч периода отдыха, чувствительность поведение мышей была оценена луч ходьбе тест, в котором время ходьбы, время достижения платформы и количество поездок были записаны. (B) От Эль-Амки и др.22: В луче ходьбе тест, SAH мышей показали увеличение числа поездок по сравнению с элементами управления на D7 (Я, p'lt;0.01), D10 (, p'lt;0.001) и D14 (Я, p'lt;0.05) и с фиктивными мышами на D10 (, p'lt;0.05). (C) От Эль-Амки и др.22: SAH мышей выставлены меньшее расстояние перешли (яп. 0, 0,05) и вертикальной активности по сравнению с Шам мышей на D9 (З, p'lt; 0,01). ANOVA следуют Сидак несколько сравнений тест. Данные были выражены в качестве среднего - SEM. n-10-12/condition. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на интенсивность исследований в области SAH и развитие терапевтических стратегий, таких как эндоваскулярные и фармакологические варианты лечения растет за последние двадцать лет, смертность остается высокой в течение первой недели госпитализации и достигает около 50% в течение следующих 6месяцев 24,25. Эта текущая доклиническая модель ежедневной двойной инъекцией гомологичной артериальной крови в цистерна-магна была признана за ее действительность и связь с низким уровнем смертности. Действительно, среди моделей грызунов SAH, широкий спектр показателей смертности был зарегистрирован: 0-16% смертности с одной инъекции крови в цистерна магн26,27,28,29,30,31,32,33,,34,35, 10-33% смертности с инъекцией крови в прехиазматический цистер20,27,37,3 6,37, 16-66% смертность в модели по эндоваскулярной перфорации38,39,40,41,42,43,44,45 и 0-43% с моделью путем двойной инъекции крови в цистерна magna34,35,46,47,48., Низкий уровень смертности в модели (9% или 27%, в зависимости от возраста мышей) может быть результатом слабого количества инъекций крови, медленной продолжительности инъекций и наклона животного, избегающего локализованного давления на ствол мозга, по сравнению с другими моделями двойных инъекций. У пациентов САГ окно возникновения CVS классически обнаруживается при пост-кровоизлиянии D4-D10. Тем не менее, у животных, время начала и продолжительность CVS менее изучены и могут варьироваться между моделями HSA, вероятно, в зависимости от экспериментальных протоколов и видов животных21.

В этом контексте модель здесь напоминает клиническую физиопатологию SAH с точки зрения SAH-ассоциированных CVS. В целом, в эндоваскулярной перфорации модели, CVS происходит в MCA и BA после 1 часа у крыс40 и после 3 дней у мышей17. В модели путем инъекций крови в прехиазматической цистерны, CVS возникновения было показано между двумя49 и восемь дней37 у крыс. В модели двойной инъекции в цистерна magna у крыс, CVS развивается между 10 минут29 и 3 дней31. Мы первыми описываем кинетическое появление CVS в мышиной модели SAH путем двойной инъекции, устанавливая CVS в основных мозговых артериях (ACA, MCA и BA) с 3 дней и сохраняем до 10-го дня после SAH22,близко к тому, что наблюдается у пациентов SAH. Эта последняя модель может быть определена как квалифицированная модель SAH, достаточно серьезная без смертности, что позволяет исследовать механизмы и терапии ориентации CVS.

Тем не менее, эта модель мыши SAH может также представить некоторые пределы. Первый момент является отсутствие разрыва стенки сосуда, как, возможно, воспроизводится в коллагеназе индуцированной модели SAH, через разрушение / переваривание кровеносных сосудов базальныйламина 50. Что касается возникновения макроскопического CVS, снижение мозгового кровотока (CBF) на некоторых территориях мозга систематически не коррелирует с неврологическим исходом, поэтому CBF следует оценивать в предлагаемой модели SAH. Предыдущие исследования крыс с использованием лазерной доплеровской flowmetry в модели SAH двойной инъекции продемонстрировали резкое снижение CBF до 30-52% от базового после первой инъекции, с возвращением к базовому после 2 до 3 дней после инъекции51,52,53. В согласии, было показано МРТ снижение CBF 33-50% на D3 и 27-44% на D5 после индукции SAH в крысы двойной инъекции моделей54,55. Двойная инъекция в цистерна-магна позволяет предсказуемое распределение крови вдоль субарахноидного пространства, в результате чего особенно в сгустки крови вокруг заднего кровообращения, но может ввести изменения в физиологических параметров. Чтобы избежать внутричерепного давления (ICP) от роста с объемом впрыской крови, поступающей в спинномозговой канал, как приводит к путанице функциональных нарушений56, выбор для удаления эквивалентного объема спинномозговой жидкости может быть сделано, как это было ранее сделано в других моделях30,51. В модели здесь, фиктивные мыши получили эквивалентный объем aCSF или физиологические 0.9% NaCl, в зависимости от эксперимента, очевидно, что приводит к росту ICP. Таким образом, резкое увеличение ПМС приводит к увеличению с 18 мм рт. ст. до 120 мм рт.ст. 27,,48,,53 при однократной инъекции крови в модели цистерна-магна, от 46 до 107 мм рт.ст. 27,,37,,49 в прехиазматической модели инъекций крови, и от 27 до 110 мм Ртг 39,40,53,,57,,58 в эндоваскулярной перфорации модели. В отличие от двойной инъекции крови в цистерна magna был связан с меньшим увеличением ICP с 60 до 67 mmHg48,53. Кроме того, действия по удалению CSF также изменят МСП и изменят CSF. В модели SAH здесь, решение было не удалить CSF до инъекции крови, но сопровождать операцию процедурой, состоящей в рукоятке головы животного от 30 ". Цель состоит в том, чтобы одритировать ПМС, позволяя распределение крови в передней циркуляции, важный и необходимый шаг, чтобы имитировать человека SAH физиопатологии. У пациентов САГ, резкий рост ПМС обнаруживается и связан с переходной глобальной ишемии головного мозга59, вероятно, способствует устойчивому нарушению ауторегуляции и ранней потери нейрональных клеток60. Однако, после первого события после SAH, ранний внешний желудочковый дренаж часто принимается для заинтересованных пациентов SAH, чтобы избежать отеков мозга и гидроцефалии61. Здесь, двойная инъекция SAH модель не может быть серьезным при первом событии кровотечения, чтобы спровоцировать ICP-зависимых последствий наблюдается у пациентов, но, вероятно, воспроизвести устойчивый и мягкий расширенный ПМС в течение нескольких дней после SAH.

Кроме того, еще одним неконтролируемым параметром в модели SAH здесь были потенциальные изменения среднего артериального кровяного давления (MABP), вызванного чрезмерно быстрой процедурой инъекциикрови 27. Действительно, MABP обычно остро поднимается после экспериментального SAH для сохранения давления перфузии головного мозга и после этого, падает до базового уровня. В модели SAH здесь, мы вводили кровь или aCSF (10 мл/мин) на низкой скорости, чтобы избежать этих вариаций MABP. Что касается нейробиологических событий в этой модели, имитирующей те, которые наблюдаются у людей, мы ранее показали, что двойная модель инъекций крови SAH вызывает длительное образование CVS, формирование микротромбоза и повреждение головного мозга, включая дефект в потенциальной параваскулярной диффузии с 3-го дня до 10 после SAH22. Однако последние данные, описывающие, что КУР участвует в SAH-ассоциированных DCI13 решительно поддерживают осуществление такого рода исследований в мышиной модели двойной инъекции. Это должно позволить научному прорыву в отношении благотворного воздействия новых методов лечения, ориентированных на КУР.

В заключение, модель двойной инъекции всей артериальной крови в цистерна-магна является освоенной моделью, которая позволяет простой способ имитировать физиопатологию САХ человека, включая CVS, микротерромбоз, воспаление сосудов, неврологический дефицит и уровень смертности. Он представляет собой проверенную модель для тестирования новых терапевтических подходов для лечения SAH-ассоциированных морби-смертность.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим платформу PRIMACEN (Университет Нормандии Руан, Франция) за оборудование для визуализации и г-на Арно Арабо, г-жу Джули Маукотель и г-жу Мартину Дюбуа за жилье и уход за животными. Мы благодарим г-жу Селеста Никола за то, что она озвучила видеозапись протокола. Эта работа была поддержана программой созревания Seinari Нормандии, Фонд AVC под эгидой FRM, Нормандии Руан университета и Inserm. Нормандский регион и Европейский Союз (проект 3R). Европа участвует в Нормандии с Европейским фондом регионального развития (ERDF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rincon, F., Rossenwasser, R. H., Dumont, A. The epidemiology of admissions of nontraumatic subarachnoid hemorrhage in the United States. Neurosurgery. 73 (2), 212-222 (2013).
  2. Sandvei, M. S., et al. Incidence and mortality of aneurysmal subarachnoid hemorrhage in two Norwegian cohorts, 1984-2007. Neurology. 77 (20), 1833-1839 (2011).
  3. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
  4. Solenski, N. J., et al. Medical complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a report of the multicenter, cooperative aneurysm study. Participants of the Multicenter Cooperative Aneurysm Study. Critical Care Medicine. 23 (6), 1007-1017 (1995).
  5. Cahill, J., Calvert, J. W., Zhang, J. H. Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (11), 1341-1353 (2006).
  6. Huang, J., van Gelder, J. M. The probability of sudden death from rupture of intracranial aneurysms: a meta-analysis. Neurosurgery. 51 (5), 1101-1107 (2002).
  7. Rabinstein, A. A. Secondary brain injury after aneurysmal subarachnoid haemorrhage: more than vasospasm. Lancet Neurology. 10 (7), 593-595 (2011).
  8. Kivisaari, R. P., et al. MR Imaging After Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage and Surgery: A Long-term Follow-up Study. American Journal of Neuroradiology. 22 (6), 1143-1148 (2001).
  9. Mayberg, M. R., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 25 (11), 2315-2328 (1994).
  10. Dankbaar, J. W., et al. Relationship between vasospasm, cerebral perfusion, and delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neuroradiology. 51 (12), 813-819 (2009).
  11. Sehba, F. A., Hou, J., Pluta, R. M., Zhang, J. H. The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Progress in Neurobiology. 97 (1), 14-37 (2012).
  12. Miller, B. A., Turan, N., et al. Inflammation, vasospasm, and brain injury after subarachnoid hemorrhage. BioMed Res Int. 2014, 384342 (2014).
  13. Dreier, J. P., et al. Delayed ischaemic neurological deficits after subarachnoid haemorrhage are associated with clusters of spreading depolarizations. Brain. 129, Pt 12 3224-3237 (2006).
  14. Mayer, S., et al. Global and domain-specific cognitive impairment and outcome after subarachnoid hemorrhage. Neurology. 59 (11), 1750-1758 (2002).
  15. Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41 (8), 519-536 (2010).
  16. Macdonald, R. L., et al. Randomized trial of clazosentan in patients with aneurysmal subarachnoid hemorrhage undergoing endovascular coiling. Stroke. 43 (6), 1463-1469 (2012).
  17. Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological Research. 24 (5), 510-516 (2002).
  18. Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
  19. Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  20. Sabri, M., et al. Anterior circulation mouse model of subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1295, 179-185 (2009).
  21. Leclerc, J. L., et al. A Comparison of Pathophysiology in Humans and Rodent Models of Subarachnoid Hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
  22. El Amki, M., et al. Long-Lasting Cerebral Vasospasm, Microthrombosis, Apoptosis and Paravascular Alterations Associated with Neurological Deficits in a Mouse Model of Subarachnoid Hemorrhage. Molecular Neurobiology. 55 (4), 2763-2779 (2018).
  23. Clavier, T., et al. Association between vasoactive peptide urotensin II in plasma and cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a potential therapeutic target. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2018).
  24. Kundra, S., Mahendru, V., Gupta, V., Choudhary, A. K. Principles of neuroanesthesia in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Anaesthesiology Clinical Pharmacology. 30 (3), 328-337 (2014).
  25. Schertz, M., et al. Incidence and Mortality of Spontaneous Subarachnoid Hemorrhage in Martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
  26. Lin, C. -L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  27. Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. -A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
  28. Turowski, B., et al. New angiographic measurement tool for analysis of small cerebral vessels: application to a subarachnoid haemorrhage model in the rat. Neuroradiology. 49 (2), 129-137 (2007).
  29. Boyko, M., et al. The neuro-behavioral profile in rats after subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1491, 109-116 (2013).
  30. Muñoz-Sánchez, M. Á, et al. Urotensinergic system genes in experimental subarachnoid hemorrhage. Medicina Intensiva (English Edition). 41 (8), 468-474 (2017).
  31. Delgado, T., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
  32. Solomon, R. A., Antunes, J. L., Chen, R., Bland, L., Chien, S. Decrease in cerebral blood flow in rats after experimental subarachnoid hemorrhage: a new animal model. Stroke. 16 (1), 58-64 (1985).
  33. Ram, Z., Sahar, A., Hadani, M. Vasospasm due to massive subarachnoid haemorrhage-a rat model. Acta Neurochirurgica. 110 (3-4), 181-184 (1991).
  34. Glenn, T. C., et al. Subarachnoid hemorrhage induces dynamic changes in regional cerebral metabolism in rats. Journal of Neurotrauma. 19 (4), 449-466 (2002).
  35. Gules, I., Satoh, M., Clower, B. R., Nanda, A., Zhang, J. H. Comparison of three rat models of cerebral vasospasm. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (6), 2551-2559 (2002).
  36. Sabri, M., et al. Mechanisms of microthrombi formation after experimental subarachnoid hemorrhage. Neuroscience. 224, 26-37 (2012).
  37. Jeon, H., Ai, J., Sabri, M., Tariq, A., Macdonald, R. Learning deficits after experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Neuroscience. 169 (4), 1805-1814 (2010).
  38. Silasi, G., Colbourne, F. Long-term assessment of motor and cognitive behaviours in the intraluminal perforation model of subarachnoid hemorrhage in rats. Behavioural Brain Researchearch. 198 (2), 380-387 (2009).
  39. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
  40. Bederson, J. B., et al. Acute vasoconstriction after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 42 (2), 352-362 (1998).
  41. Park, I. -S., et al. Subarachnoid hemorrhage model in the rat: modification of the endovascular filament model. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 195-200 (2008).
  42. Vanden Bergh, W., et al. Magnetic resonance imaging in experimental subarachnoid haemorrhage. Acta Neurochirurgica. 147 (9), 977-983 (2005).
  43. Peng, J., et al. LRP1 activation attenuates white matter injury by modulating microglial polarization through Shc1/PI3K/Akt pathway after subarachnoid hemorrhage in rats. Redox Biology. 21, 101121 (2019).
  44. Okada, T., et al. Selective Toll-Like Receptor 4 Antagonists Prevent Acute Blood-Brain Barrier Disruption After Subarachnoid Hemorrhage in Mice. Molecular Neurobiology. 56 (2), 976-985 (2019).
  45. Tiebosch, I. A., et al. Progression of brain lesions in relation to hyperperfusion from subacute to chronic stages after experimental subarachnoid hemorrhage: a multiparametric MRI study. Cerebrovascular Diseases. 36 (3), 167-172 (2013).
  46. Weidauer, S., Vatter, H., Dettmann, E., Seifert, V., Zanella, F. E. Assessment of vasospasm in experimental subarachnoid hemorrhage in rats by selective biplane digital subtraction angiography. Neuroradiology. 48 (3), 176-181 (2006).
  47. Lee, J. Y., Huang, D. L., Keep, R., Sagher, O. Characterization of an improved double hemorrhage rat model for the study of delayed cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 168 (2), 358-366 (2008).
  48. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PloS one. 7 (3), 33366 (2012).
  49. Piepgras, A., Thome, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
  50. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).
  51. Raslan, F., et al. A modified double injection model of cisterna magna for the study of delayed cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental & Translational Stroke Medicine. 4 (1), 23 (2012).
  52. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PLoS One. 7 (3), 33366 (2012).
  53. Lee, J. Y., Sagher, O., Keep, R., Hua, Y., Xi, G. Comparison of experimental rat models of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (2), 331-343 (2009).
  54. Guresir, E., et al. The effect of common carotid artery occlusion on delayed brain tissue damage in the rat double subarachnoid hemorrhage model. Acta Neurochir (Wien). 154 (1), 11-19 (2012).
  55. Vatter, H., et al. Time course in the development of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage: clinical and neuroradiological assessment of the rat double hemorrhage model. Neurosurgery. 58 (6), 1190-1197 (2006).
  56. Leonardo, C. C., Robbins, S., Doré, S. Translating basic science research to clinical application: models and strategies for intracerebral hemorrhage. Frontiers in Neurology. 3, 85 (2012).
  57. Feiler, S., Friedrich, B., Schöller, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
  58. Westermaier, T., Jauss, A., Eriskat, J., Kunze, E., Roosen, K. Acute vasoconstriction: decrease and recovery of cerebral blood flow after various intensities of experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Journal of Neurosurgery. 110 (5), 996-1002 (2009).
  59. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. 41 (4), 917-930 (2018).
  60. Conzen, C., et al. The Acute Phase of Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Intracranial Pressure Dynamics and Their Effect on Cerebral Blood Flow and Autoregulation. Translational Stroke Research. 10 (5), 566-582 (2019).
  61. Connolly, E. S., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/american Stroke Association. Stroke. 43 (6), 1711-1737 (2012).

Tags

Нейронаука Выпуск 162 Субарахноидовое кровоизлияние цистерна-магна мышь вазоспазм модель животных сенситиво-мотор-тест кровь
Двойная прямая инъекция крови в Цистерна Магна как модель субарахноидового кровоизлияния
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter