Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles

Summary

Los cortes cerebrales ex vivo se pueden usar para estudiar los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas a las entradas aferentes. La optogenética se emplea para activar independientemente las aferentes talamocorticales y corticocorticales al neocórtex no primario, y las respuestas sinápticas y de red se modulan con isoflurano.

Abstract

Los anestésicos influyen en la conciencia en parte a través de sus acciones en los circuitos talamocorticales. Sin embargo, la medida en que los anestésicos volátiles afectan a distintos componentes celulares y de red de estos circuitos sigue sin estar clara. Los cortes cerebrales ex vivo proporcionan un medio por el cual los investigadores pueden sondear componentes discretos de redes complejas y desentrañar los posibles mecanismos subyacentes a los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas. Para aislar los posibles efectos específicos de los fármacos de tipo y vía celular en cortes cerebrales, los investigadores deben ser capaces de activar de forma independiente las vías de fibra aferente, identificar poblaciones de células no superpuestas y aplicar anestésicos volátiles al tejido en solución acuosa. En este protocolo, se describen métodos para medir las respuestas optogenéticamente evocadas a dos vías aferentes independientes al neocórtex en cortes cerebrales ex vivo. Las respuestas extracelulares se registran a la actividad de la red de ensayo y se realizan registros específicos de pinzas de parche de células enteras en interneuronas positivas para somatostatina y parvalbúmina. Se describe la administración de concentraciones fisiológicamente relevantes de isoflurano a través del líquido cefalorraquídeo artificial para modular las respuestas celulares y de red.

Introduction

Los anestésicos volátiles se han utilizado de manera ubicua en una variedad de entornos clínicos y académicos durante más de un siglo. Las distintas clases de anestésicos^{tienen objetivos} moleculares únicos, a menudo no superpuestos1,2,3^, sin embargo, casi todos ellos producen inconsciencia. Si bien sus efectos conductuales son bastante predecibles, los mecanismos por los cuales los anestésicos inducen la pérdida de conciencia son en gran parte desconocidos. En última instancia, los anestésicos pueden influir tanto en el nivel como en el contenido de la conciencia a través de acciones en los circuitos corticotalámicos, interrumpiendo la integración de la información en toda la jerarquía cortical 4,5,6,7,8,9. En términos más generales, la modulación de los circuitos corticotalámicos puede desempeñar un papel en los estados alterados experimentalmente 10 o farmacológicamente 11 de la conciencia, y también puede estar implicada en el sueño¹² y en los trastornos fisiopatológicos de la conciencia ^13,14.

La elusividad de los mecanismos subyacentes a la pérdida y retorno de la conciencia durante la anestesia puede atribuirse parcialmente a las acciones sinérgicas no lineales de los anestésicos a nivel celular, de red y de sistemas¹⁵. El isoflurano, por ejemplo, suprime la actividad dentro de las regiones cerebrales seleccionadas 16,17,18, perjudica la conectividad entre regiones cerebrales distantes 19,20,21,22,23 y disminuye las respuestas sinápticas de una manera específica de la vía ^24,25 . Aún no está claro qué efectos de los anestésicos, desde el nivel molecular hasta el de sistemas, son necesarios o suficientes para efectuar la pérdida de conciencia. Además de las investigaciones clínicas sustantivas de la conciencia utilizando técnicas no invasivas 19,20,26^, es importante que los experimentalistas busquen desentrañar las distintas interacciones celulares y de red que sirven a la experiencia consciente.

Al simplificar las complejas interacciones encontradas en el cerebro intacto, los cortes cerebrales ex vivo permiten el estudio de componentes aislados de los sistemas dinámicos del cerebro⁹. Una preparación reducida combina los beneficios de las estructuras anatómicas relativamente intactas de los circuitos neuronales locales con la versatilidad de las manipulaciones in vitro. Sin embargo, hasta hace poco, las limitaciones metodológicas han impedido el estudio de las propiedades sinápticas y de circuito de las entradas de largo alcance en cortes cerebrales^27,28; El tortuoso camino de los tractos de fibras corticotalámicas hizo que la activación de vías aferentes independientes fuera casi imposible mediante estimulación eléctrica.

La investigación de los efectos de los agentes anestésicos en las preparaciones de corte cerebral presenta desafíos adicionales. En ausencia de un sistema respiratorio y circulatorio intacto, los agentes anestésicos deben aplicarse en el baño y las concentraciones deben ajustarse cuidadosamente a las concentraciones estimadas del sitio del efecto. Para muchos agentes anestésicos intravenosos, la lenta tasa de equilibrio en el tejido hace que las investigaciones farmacológicas tradicionales sean laboriosas^29,30. Investigar los efectos de los anestésicos de gases volátiles en preparaciones ex vivo es más manejable, pero también presenta desafíos. Estos incluyen la conversión de dosis de presión parcial inhalada a concentraciones acuosas, y la necesidad de un sistema de administración modificado del fármaco al tejido a través del líquido cefalorraquídeo artificial³¹.

Aquí, se describen métodos mediante los cuales los investigadores pueden capitalizar las propiedades fisicoquímicas bien documentadas del anestésico volátil isoflurano para la administración de fármacos a cortes cerebrales ex vivo, activar entradas específicas de vías y capas a un área cortical de interés con alta resolución espaciotemporal, y realizar registros laminares simultáneos y registros de pinzas de parche dirigidas de poblaciones seleccionadas de neuronas. Combinados, estos procedimientos permiten a los investigadores medir los cambios volátiles inducidos por la anestesia en varias propiedades observables de respuesta electrofisiológica, desde el nivel sináptico hasta el nivel de red local.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales descritos en este protocolo fueron aprobados por la Facultad de Medicina de la Universidad de Wisconsin-Madison y el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Salud Pública.

1. Ratones reproductores para expresar proteína reportera fluorescente en subpoblaciones interneuronales

1. Empareje el ratón macho tdTomato homocigoto dependiente de Cre con la hembra homocigótica SOM-Cre o la hembra homocigótica PV-Cre.
   NOTA: Otras poblaciones neuronales específicas pueden ser atacadas mediante el uso de las líneas Cre apropiadas.
2. Permita que la descendencia heterocigota madure hasta al menos 3 semanas de edad antes de continuar. Para los experimentos descritos aquí, el genotipado no es necesario, ya que los padres homocigotos producen descendencia que son todos heterocigotos tanto para la recombinasa Cre específica del tipo celular como para los alelos reporteros dependientes de Cre.

2. Realización de la inyección estereotáxica unilateral de constructo viral

1. Ajuste los ajustes del extractor de micropipetas para pipetas de inyección como se indica en el manual del usuario del instrumento (consulte la Tabla 1 para conocer los ajustes recomendados). Tire de la micropipeta de vidrio.
2. Rompa la punta del extremo afilado de la pipeta de modo que el diámetro de la punta sea de aproximadamente 30 μm con una conicidad mínima de varios milímetros.
3. Utilizando procedimientos previamente documentados, decida el título y el volumen apropiados del virus que se inyectarán. En los experimentos descritos aquí, 1,0 μL (título: 3,1-5,7 TU/ml) inyectados unilateralmente produjeron buenos resultados.
4. Rellene todo el volumen de la pipeta con aceite mineral. Cargue la pipeta en la microjeringa y haga fluir una pequeña cantidad de aceite mineral a través de la punta para asegurarse de que la punta no esté obstruida.
5. Frontfill al menos 1.0 μL de construcción viral. El vector viral adenoasociado recombinante utilizado en estos experimentos fue AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP.
6. Coloque una cortina estéril en un área quirúrgica. Esterilice las herramientas para el procedimiento estereotáxico y colóquelas sobre la cortina.
7. Anestesiar SOM-tdTomate o PV-tdTomate heterocigoto animal utilizando isoflurano (3% para inducción, 1,5-2% para mantenimiento) y mezcla de oxígeno. Confirme periódicamente el nivel quirúrgico de anestesia con pellizco en el dedo del pie durante la cirugía. Asegúrese de que el animal no se mueva más allá del plan quirúrgico de anestesia monitoreando las respiraciones cada 10-15 minutos.
8. Afeite la parte superior de la cabeza del animal. Aplique alcohol isopropílico al 70% y solución a base de yodo generosamente en el área quirúrgica y ungüento oftálmico en las cuencas de los ojos para evitar el secado de la membrana. Administrar bupivacaína/lidocaína (proporción 1:1, 1,0 mg/kg) por vía subcutánea al sitio quirúrgico para anestesia local.
9. Encaja al animal en un marco estereotáxico.
10. Use bisturí para hacer una incisión a lo largo del eje sagital de la piel que recubre la superficie dorsal del cráneo. Retraiga la piel con fórceps. Hidratar el cráneo con 0,9% de solución salina según sea necesario.
11. En la superficie del cráneo, marque ligeramente la intersección de las coordenadas anteriores y laterales con una cruz a lápiz. Perforar un orificio en las coordenadas apropiadas en el plano transversal (en mm en relación con Bregma, para inyección de corteza cingulada (Cg): anterior 0.2, lateral 0.3; para inyección posterior del tálamo (Po): posterior 2.25, lateral 3.4).
    NOTA: Las marcas deben extenderse más allá de los límites del orificio de rebabas para proporcionar orientación para la colocación precisa de la pipeta.
12. Encienda y equilibre la mesa de aire.
13. Reposición del manipulador de electrodos del marco estereotáxico a 0° para inyecciones en Cg, o 45° en el plano coronal para inyecciones en Po.
14. Conecte la bomba de jeringa al manipulador de electrodos. Conecte el controlador de la bomba de microjeringa a la bomba de la jeringa.
15. Navegue por la punta de la pipeta cerca (pero sin tocar) la superficie del cerebro, en la intersección de las marcas creadas en el Paso 2.11. Avance la pipeta a aproximadamente 1 mm/s a lo largo de su eje longitudinal hacia el cerebro, ya sea 0,9 mm (inyección en Cg) o 3,1 mm (inyección en Po). Espere 10 minutos antes de continuar.
16. Inyecte 1.0 μL de construcción viral durante un período de 10 min (100 nL/min). Si se observa un afloramiento del virus desde el lugar de inserción de la pipeta, disminuya la velocidad de inyección a 50 nL/min.
17. Después de la inyección, espere 10 minutos antes de retraer lentamente la pipeta de inyección.
18. Sutura para cerrar la incisión del cuero cabelludo y administrar 2-5 mg/kg de meloxicam por vía subcutánea.
19. Suspenda el isoflurano y monitoree al animal durante la salida de la anestesia. Permitir la recuperación de acuerdo con los procedimientos descritos por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Institución, incluida la administración adicional de analgésicos.

3. Preparación de cortes cerebrales agudos

1. Espere al menos 3 semanas para la expresión de la construcción viral antes de cosechar tejido.
2. Prepare 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial para el procedimiento de corte (corte de líquido cefalorraquídeo artificial, sACSF). Consulte la Tabla 2 para los ingredientes.
3. Durante todo el procedimiento de corte, suministre sACSF con una mezcla disuelta de 95% de O 2/5% de CO₂, administrada a través de un tubo de dispersión de gas.
4. Prepare un baño helado para el micrótomo de la cuchilla vibratoria. Monte la etapa de la muestra helada en el micrótomo y fije la hoja de zafiro en su lugar para la sección del tejido.
5. Anestesiar al ratón con isoflurano al 3% y oxígeno hasta la pérdida del reflejo de enderezamiento.
6. Decapitar el ratón con guillotina e inmediatamente sumergir la cabeza en 4°C sACSF. Para preservar la salud del tejido, complete los siguientes pasos lo más rápido posible.
7. Abra la cavidad del cráneo haciendo una pequeña incisión en la base del cráneo y retirando suavemente cada placa del cráneo. Retire suavemente la duramadre subyacente.
8. Mientras el cerebro todavía está en la cavidad del cráneo, use la hoja de afeitar para extraer el cerebelo. Haga un segundo corte vertical a lo largo del plano sagital en el hemisferio izquierdo, justo lateral a la línea media.
9. Prepare el bloque de tejido para la sección.
   1. Levante suavemente el cerebro de la cavidad craneal. Coloque el cerebro en el papel de filtro con el plano plano sagital hacia abajo. Guíe el papel de filtro sobre la plantilla de bloqueo y alinee el cerebro con el contorno de la plantilla subyacente (Figura suplementaria 1).
   2. Haga dos cortes paralelos en el plano coronal como lo indican las líneas en la plantilla. Agregue una pequeña gota de sACSF para mantener el papel de filtro húmedo, si es necesario.
   3. Colocar brevemente el bloque tisular a 4°C sACSF mientras se realiza el paso 3.8.4.
   4. Aplique una pequeña cantidad de súper pegamento a la etapa de muestra helada.
   5. Levante el bloque de tejido de la sACSF fría. Use la esquina de una toalla absorbente para absorber el exceso de sACSF. Pegue el plano coronal posterior del bloque de tejido a la etapa de la muestra, con la superficie dorsal del cerebro hacia la hoja de zafiro.
10. Recolectar cortes cerebrales coronales de 500 μm de espesor. Colocar rodajas de interés en malla de nylon (figura complementaria 2) en sACSF a 34 °C y dejar que el recipiente alcance la temperatura ambiente.
    NOTA: Para los experimentos descritos aquí, se recolectaron grabaciones electrofisiológicas de una sección coronal centrada aproximadamente 2.25 mm posterior a bregma para estudiar un área sensorial no primaria, la corteza visual secundaria medial (V2MM).

4. Preparación de bolsas experimentales de líquido cefalorraquídeo artificial (eACSF) que contengan isoflurano anestésico volátil disuelto

1. Prepare 300 ml de una mezcla madre de isoflurano al 3,0%.
   1. En una bolsa sellada de gas de politetrafluoroetileno, agregue ~ 100 ml de mezcla de gas 95% O 2/5% CO₂ a 20-30 ml de isoflurano líquido y una pequeña cantidad de solución salina al 0.9%. Espere al menos 30 minutos para permitir el equilibrio de isoflurano entre las fases líquida y gaseosa.
   2. Determine la cantidad de gas isoflurano saturado, V_sat, para agregar a la bolsa de stock usando la siguiente ecuación:
      
      donde P%stock es la composición objetivo del gas madre (3% en este caso), V stock es el volumen final de la bolsa de gas_stock, P isoflurano es la presión parcial del_isoflurano a temperatura ambiente (~240 mmHg), y P_total es la presión atmosférica (~760 mmHg).
   3. Agregue la cantidad calculada de gas saturado a una bolsa de gas vacía y llene la bolsa con un volumen de 95% de mezcla de gas O₂/5% de_CO2 para llevar el volumen total de la bolsa de stock a 300 ml.
2. Preparar 2 L de líquido cefalorraquídeo artificial para la perfusión de la rebanada durante el experimento (ACSF experimental, eACSF). Consulte la Tabla 2 para los ingredientes. Disuelva la mezcla de gas 95% O₂/5%_CO2 en solución.
3. Prepare dos bolsas separadas de soluciones de Control e Isoflurano.
   1. A una bolsa vacía de gas de politetrafluoroetileno, agregue 600 ml de eACSF y 600 ml de mezcla de gas_CO2 al 95% de O₂/5%. Etiquete esta bolsa como Control.
   2. A otra bolsa vacía de gas politetrafluoroetileno, agregue 300 ml de eACSF. Etiquete esta bolsa como isoflurano.
   3. Elija una concentración de isoflurano en fase gaseosa equilibrada fisiológicamente relevante. Los experimentos se realizaron utilizando concentraciones de gas equivalentes al 1,3% de isoflurano. Los ratones pierden el reflejo de enderezamiento, y presumiblemente la conciencia, al 0,9% inhalado isoflurano.
   4. Utilice la siguiente ecuación para calcular la concentración equivalente en fase gaseosa a temperatura ambiente, P%(T_habitación)³¹:
      
      donde P%(cuerpo T) es la concentración en fase gaseosa fisiológicamente relevante elegida en el paso 4.3.3, la_sala T es 25 °C y el_cuerpo T es 37 °C.
   5. Utilice la siguiente ecuación para determinar el volumen de gas de la bolsa de gas madre,_stock V, para agregar a la solución de isoflurano.
      
      donde la solución V es el volumen de eACSF en la bolsa de isoflurano (300 ml), P%(_sala T) se introduce a partir de la ecuación (2), λ es el coeficiente de reparto de Ostwald_solución salina/gas del isoflurano (λ = 1,2³²), y P%stock es la concentración en fase _gaseosa de la bolsa de gas madre (P%_stock = 3,0%).
   6. A la bolsa de solución de isoflurano, añadir el volumen de gas de la bolsa de gas madre,_{V stock}, calculado en el paso 4.3.5.
   7. A la bolsa de solución de isoflurano, agregue un volumen de 95% de mezcla de gas O₂/5% de_CO2 para llevar el volumen total de gas en la bolsa de solución de isoflurano a 300 ml.
4. Agite las bolsas de control e isoflurano en el agitador durante al menos 1 h para permitir el equilibrio de la fase de isoflurano.
5. Después de que se hayan recopilado todos los datos, se puede verificar la concentración correcta mediante el uso de un monitor de gas anestésico para medir la concentración de gas equilibrado de isoflurano por encima de la solución restante en la bolsa.
6. Informe de concentraciones experimentales de gases volátiles en unidades acuosas, ya que las concentraciones milimolares son más robustas a los cambios de temperatura. Utilice la siguiente ecuación para convertir la concentración en fase gaseosa a temperatura ambiente, P%_{(sala T}), en una concentración acuosa equivalente (C_acuosa, en mM)³¹:
   
   donde α es el coeficiente de reparto Bunsen salino/gas para isoflurano a 25°C³².

5. Preparación de hardware y software para grabaciones multicanal

1. Configure el sistema de adquisición de datos de 16 canales de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Se pueden utilizar varios amplificadores y sistemas de adquisición de datos disponibles comercialmente para recopilar grabaciones multicanal. En los experimentos descritos aquí, las señales analógicas se entregan a través de un panel de referencia de electrodos a dos amplificadores, donde se amplifican (2000x) y se filtran (0.1-10kHz). Las entradas analógicas al sistema de adquisición de datos se digitalizan a 40 kHz.
2. Fije el adaptador de cabecera de 16 canales apropiado a un micromanipulador de microscopio. Oriente el adaptador de modo que los puertos del conector hembra estén orientados hacia abajo.
3. Ajuste el ángulo de funcionamiento de este micromanipulador de modo que esté orientado hacia abajo hacia la cámara de grabación, en un ángulo de aproximadamente 70° con respecto a la horizontal.
4. Conecte la entrada del headstage a una sonda 16 x 1 para electrofisiología in vitro a través del adaptador de headstage anclado al micromanipulador.
5. Conecte el conector de salida del escenario de cabeza al sistema de adquisición de datos.
6. Instale el software adecuado para la adquisición de datos. Configure 15 canales de entrada para que correspondan a las señales de entrada de los primeros 15 contactos de sonda multicanal. Configure el canal restante para recibir la entrada del electrodo intracelular.
   NOTA: Tenga cuidado de considerar los mapas de electrodos y adaptadores al recopilar y analizar datos, para asegurarse de que la señal adecuada corresponde al contacto del electrodo desde el que se recopiló.

6. Configuración de protocolos de estimulación lumínica

1. Configure el sistema de suministro de luz e instale el software que lo acompaña.
2. Abra el software. Elija la configuración de cableado de hardware en la que una fuente de disparo (salida digital / TTL) proporciona señal de activación al sistema de suministro de luz, y el sistema de entrega de luz proporciona una señal de salida de activación a un LED de 470 nm.
3. Lente objetivo de montura de alta potencia. Usando la cámara digital, calibre el objetivo de alta potencia para su uso con el sistema de suministro de luz.
4. Crear una nueva secuencia de perfiles de estimulación lumínica.
   1. Crea un patrón de elección. En los experimentos descritos aquí, se utiliza un círculo de 150 μm de diámetro para permitir la activación específica de la capa de terminales de axones.
   2. Para construir una secuencia de perfil, copie y pegue este perfil para cada uno de los ensayos.
   3. Cree una lista de formas de onda que contenga formas de onda de cualquier intensidad de luz, duración de pulso o número de pulso.
   4. Asigne aleatoriamente formas de onda a cada perfil. Cada perfil con su forma de onda asignada corresponde a un pulso de disparo de una entrada TTL digital, o una prueba.
   5. Guarde la secuencia de perfiles.
5. En el software de adquisición de datos, cree un nuevo protocolo.
   1. Establezca el número de ensayos para que sea igual al número de perfiles en la secuencia de perfiles que se acaba de crear.
   2. Elija entradas de señal para que coincidan con las configuradas en el paso 5.6. Configure un protocolo que proporcione una única salida TTL digital, grabando desde estos 16 canales de entrada durante un período de tiempo adecuado antes y después del disparador digital.

7. Colocación de la sonda multicanal en un corte de tejido cerebral ex vivo

1. Perfundir eACSF burbujeado (no en bolsas selladas) a 3-6 ml / min.
2. Transfiera el corte cerebral que contiene el área de interés a la rejilla de malla en la cámara de perfusión del microscopio. Ancla con arpa de platino (ver Figura Suplementaria 3).
3. Gire la rejilla de malla de tal manera que la línea de contactos del electrodo en el extremo distal de la sonda multicanal sea aproximadamente perpendicular a la superficie pial.
4. Bajo iluminación de campo amplio y bajo un control fino del micromanipulador, baje la sonda multicanal hacia la superficie del corte.
5. Gire la torreta del cubo de filtro para activar el cubo de filtro apropiado para la visualización de la proteína reportera fluorescente expresada en terminales axónicos de aferentes corticales. Si es necesario, gire la rebanada para alinear con mayor precisión la sonda con la superficie pial.
6. Coloque la sonda justo por encima del plano del corte, ~200 μm por debajo de la posición objetivo final a lo largo del eje x, dejando al menos un canal fuera del límite del área de tejido que se está registrando.
7. Inserte lentamente la sonda en el corte moviendo el manipulador a lo largo de su eje longitudinal. Para minimizar el daño al tejido, solo avance la sonda en la medida en que las puntas afiladas sean visibles debajo de la superficie del tejido. Esto minimizará el daño al tejido y al mismo tiempo asegurará que los contactos del electrodo estén en contacto con el tejido.

8. Parche de pinzamiento de neuronas específicas y obtención de configuración de células completas

1. Cambie la fuente eACSF a la solución de control en bolsas.
2. Identifique la célula marcada con fluorescencia para el registro de la abrazadera de parche dirigida.
   1. Restrinja el diafragma del iris de apertura al diámetro más pequeño. Acople una lente de objetivo de baja potencia y enfoque el tejido.
   2. Centrar la luz sobre un área de tejido adyacente (pero no superpuesta) a la sonda multicanal.
   3. Acople el objetivo de inmersión en agua de alta potencia (40x o 60x), teniendo cuidado de evitar el contacto entre la sonda multicanal y la lente del objetivo.
   4. Gire la torreta del cubo del filtro para activar el conjunto de filtros adecuado para permitir la obtención de imágenes de las células que expresan un marcador fluorescente dependiente de Cre.
   5. Identifique una célula marcada con fluorescencia como objetivo para el registro de la pinza del parche. Levante la lente del objetivo para crear un amplio espacio para bajar una pipeta de parche.
3. Cargue una pipeta de parche (ver tabla 1) con solución interna (tabla 2) y monte la pipeta en el soporte del electrodo. Con una jeringa de 1 ml, aplique la presión positiva correspondiente a ~0,1 ml de aire.
4. Baje la pipeta del parche en la solución. Enfoca la punta de la pipeta bajo guía visual.
5. Obtener el registro de células completas de la célula objetivo utilizando los pasos demostrados anteriormente³³.
6. Si planea evaluar los cambios en las propiedades intrínsecas de la celda (por ejemplo, resistencia de entrada, velocidad de disparo potencial de acción en respuesta a los pasos actuales), realice estas grabaciones. De lo contrario, vaya al protocolo de estimulación de axones a continuación.

9. Activación optogenética específica de capas de terminales axónicos

1. Manipule el campo de visión en el plano x-y para alinear el perfil de estimulación de la luz con la ubicación deseada en el corte.
2. Cargue el protocolo de estímulo de luz y prepare el sistema de suministro de luz para recibir un pulso TTL digital.
3. La activación optogenética de los terminales axónicos al tiempo que registra simultáneamente los potenciales de campo extracelular y las fluctuaciones de la membrana intracelular.
4. Cambie la fuente de eACSF a la solución de isoflurano y lave el medicamento durante 15 minutos. Si es necesario, recopile grabaciones espontáneas durante el lavado.
5. Repita los pasos 9.2-9.3.
6. Cambie la fuente eACSF a la solución de control y lave el medicamento durante 20 minutos. Si es necesario, recopile grabaciones espontáneas durante el lavado.
7. Repita los pasos 9.2-9.3.

Results

En la figura 1 se muestra una escala de tiempo de los pasos descritos en el protocolo. Las entradas corticales que llegan de áreas corticales de orden superior o de núcleos talámicos no primarios tienen campos terminales parcialmente superpuestos en la capa 1 de la corteza visual no primaria²⁴. Para aislar vías aferentes talamocorticales o corticocorticales independientes, se inyectó un vector viral que contenía ChR2 y un reportero fluorescente eYFP en Po o Cg. Las cé...

Discussion

En este manuscrito, se describe un protocolo para evaluar las respuestas intra y extracelulares a las vías aferentes activadas selectivamente en cortes cerebrales ex vivo.

El uso de herramientas optogenéticas y esquemas de registro paralelos permite a los investigadores sondear las respuestas de las poblaciones locales a las entradas aferentes de regiones cerebrales distantes, mientras registran simultáneamente de poblaciones específicas de interneuronas. El uso de la tecnología optogenética p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lente de objetivo de campo amplio de 2,5x	Olympus Lente	MPLFLN2,5X
40x	Olympus LUMPLFLN40XW
mezcla de 95% O2/5% CO2 Sonda	Airgas	Z02OX95R2003045
A16	NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	Sonda de 16 canales
AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP	Karl Deisseroth Lab, UNC Monitor
(POET II)	Criticare	602-3A
ATP, Sal de magnesio	Sigma Aldrich	A9187	solución intracelular
B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomate)Hze/J	El Laboratorio Jackson	007914	tdTomato B6 dependiente de Cre
; 129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J	El Laboratorio Jackson	008069	Agitador de
danza del vientre	Thomas Scientific	1210H86-TS	para el equilibrio de bolsas de gas selladas
Solución de Betadine	Marca
Lejía	Marca		para cloruro de plata electrodo de pinza de parche
Bupivicaine
Cloruro de calcio (CaCl2)	Dot Scientific	DSC20010	ACSF
Vidrio capilar (grabaciones de abrazadera de parche)	King Precision Glass, Inc.	KG-33	Borosilicato, ID: 1,1 mm, OD: 1,7 mm, longitud: 90,0 mm
Vidrio capilar (inyecciones virales)	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	3.5"
Control del micromanipulador junior	Luigs y Neumann	SM8	para el control del micromanipulador junior
Control de manipuladores y mesa de desplazamiento	Luigs y Neumann	SM7	para el control de electrodos multicanal y mesa de desplazamiento
Digidata 1440A + Clampex 10	Molecular Devices	1440A	Digitalizador y software
E-3603 Tubo	Fisher Scientific	14171208	para el suministro de una mezcla de gases de 95% O2/5% CO2 a la cámara de incubación + aplicación de presión durante la sujeción del parche
EGTA	Dot Scientific		DSE57060 solución intracelular
ERP-27 Panel de referencia/parche	de EEGNeuralynx	Retirado
Aguja de relleno	World Precision Instruments	50821912	para el llenado de pipetas de pinza de parche
Cubo de filtro para la adquisición de imágenes EYFP	Olympus	U-MRFPHQ
Papel de filtro	Fisher Scientific	09801E Colocar	sobre la plantilla de corte durante la preparación del bloque de tejido
Tirador de micropipetas Flamígero/marrón	Sutter Instrument	P-1000	2.5x2.5 Filamento
de caja Tubo de dispersión de gas	Sigma Aldrich
Jeringa de vidrio (100 mL)	Sigma Aldrich	Z314390	para el llenado de bolsas selladas con gas
Ácido glucónico, sal de potasio (K-gluconato)	Dot Scientific	DSG37020	solución intracelular
Glucosa	Dot Scientific	DSG32040	ACSF
GTP, Sal de sodio	Sigma Aldrich	G8877	solución intracelular
Adaptador de sonda de cabecera	Adaptador NeuroNexus	A16-OM16	para conectar la sonda de 16 canales a la entrada de cabecera
Pinza hemostática	VWR International	76192-096
HEPES	Dot Scientific	DSH75030	ACSF,solución intracelular
HS-16 Headstage	Neuralynx	Retirado
Isoflurano	Patterson Veterinary	07-893-1389
Alcohol isopropílico (70%)	VWR International	101223-746
Micromanipulador junior	Luigs and Neumann	210-100 000 0090-R	para la manipulación del electrodo de fijación de parche Módulo de control de
fuente de luz LED Mightex		BLS-PL02_US control de fuente de	luz optogenética
Amplificador de lidocaína
Lynx-8	Neuralynx	retirado
Fuente de alimentación Lynx-8	Neuralynx	retirado
Sulfato de magnesio (MgSO4)	Dot Scientific	DSM24300	ACSF
mCherry, Texas Cubo de filtro rojo	Chroma	49008	para imagen tdTomato reportero fluorescente
Meloxicam
Soporte para micropipetas	Fisher Scientific	NC9044962
Bomba de microjeringa	World Precision Instruments	UMP3-4
Aceite mineral	Marca
MultiClamp 700A	Molecular Devices/Axon Instruments	700A	Amplificador
de nitrógeno (para mesa de aire)	Airgas	NI200
Malla de nailon	Fisher Scientific	501460083	estirada sobre una herradura de alambre de platino aplanado, rebana el resto encima de esta durante las grabaciones
Nylon, cortado de pantimedias	Pequeña pieza de marca		para crear una plataforma de corte en la cámara de incubación, fibras individuales para crear un arpa de platino
Pomada oftálmica	Fisher Scientific	NC1697520
Pipeta	Dot Scientific	307	Para transferir tejido a la plataforma
Alambre de platino	VWR International	BT124000	2 cm, aplanado, para hacer arpa de platino
Polygon400	Mightex	DSI-E-0470-0617-000 sistema de	suministro de luz optogenética, viene con el software PolyScan2
Cloruro de potasio (KCl)	Dot Scientific	DSP41000	ACSF
Fosfato de potasio (KH2PO4)	Dot Scientific	DSP41200	ACSF
Hoja de afeitar	Fisher Scientific	12-640
Hoja de zafiro (para vibrátomo)	VWR International	100492-502
Hoja de bisturí	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-361445
Bolsa de gas sellada	Fisher Scientific	109236
Mesa giratoria para microscopio	Luigs y Neumann	380FMU
Bicarbonato de sodio (HCO3-)	Dot Scientific	DSS22060	ACSF
Cloruro de sodio (NaCl)	Dot Scientific DSS23020		ACSF, solución intracelular
Ssttm2.1(cre)Zjh/J (SOM-IRES-Cre)	El Laboratorio Jackson	013044	ratón SOM-Cre
Instrumento estereotáxico	Kopf	Modelo 902	Doble Súper
pegamento	Grapas	886833	para fijar el bloque de tejido a la etapa de la muestra durante la preparación del corte
Taladro quirúrgico	RAM Products Inc.	DIGITALMICROTORQUE	Jeringa Microtorque II
(1 mL) con punta LuerLock	Fisher Scientific	309628	para la aplicación de presión durante la sujeción del parche
Jeringa (1 mL) con punta deslizante	WW Grainger, Inc.	19G384	para el llenado de pipetas de abrazadera de
parche Filtros de jeringa	VWR International	66064-414
Microscopio vertical	Olympus	BX51
Microtomo vibratorio	Leica Biosystems	VT1000S
Toallas Wypall	Fisher Scientific	19-042-427