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Artículo de método

Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

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DOI:

10.3791/61464

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24 de junio de 2020

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1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

En este artículo

Resumen

Desarrollamos un modelo de coleamnionitis para simular la exposición fetal a la inflamación materna (FEMI) sin complicaciones de organismos vivos para examinar los efectos del FEMI en el desarrollo del tracto intestinal de la descendencia. Esto permite el estudio de causas mecanicistas para el desarrollo de lesiones intestinales después de la coleamnionitis.

Resumen

La colemonionitis es un precipitante común del parto prematuro y se asocia con muchas de las morbilidades de la prematuridad, incluida la enterocolitis necrosante (NEC). Sin embargo, aún no se ha descubierto un vínculo mecanicista entre estas dos condiciones. Hemos adoptado un modelo murino de colemonionitis que implica lipopolisacáridos (LPS) de exposición fetal inducida a la inflamación materna (FEMI). Este modelo de FEMI induce una cascada inflamatoria materna, placentaria y fetal estéril, que también está presente en muchos casos de colemonionitis clínica. Aunque existen modelos que utilizan bacterias vivas e imitan con mayor precisión la fisiopatología de una infección ascendente que resulta en corioamnionitis, estos métodos pueden causar efectos indirectos en el desarrollo del tracto intestinal inmaduro y el microbioma en desarrollo asociado. Utilizando este protocolo, hemos demostrado que el FEMI inducido por LPS resulta en un aumento dependiente de la dosis en la pérdida del embarazo y el parto prematuro, así como la interrupción del desarrollo intestinal normal en la descendencia. Además, hemos demostrado que el FEMI aumenta significativamente las lesiones intestinales y las citoquinas séricas en la descendencia, al tiempo que disminuyen las células de copa y paneth, que proporcionan una primera línea de inmunidad innata contra la inflamación intestinal. Aunque se ha utilizado un modelo similar de FEMI inducido por LPS para modelar la asociación entre la coleamnionitis y las anomalías posteriores del sistema nervioso central, hasta donde sabemos, este protocolo es el primero en intentar dilucidar un vínculo mecanicista entre la coleamnionitis y perturbaciones posteriores en el desarrollo intestinal como posible vínculo entre la corioamnionitis y el NEC.

Introducción

Las membranas corionicas desempeñan un papel integral en el embarazo de mamíferos. Incluyen el coro y la amnion, que cumplen múltiples funciones. Rodean y protegen el feto, facilitan la señalización paracrina entre los compartimentos materno-fetal1y crean bucles de retroalimentación locales dentro de las membranas corionicas, que pueden estar involucrados en el inicio de la parturición1. La comprensión actual de las membranas indica que la amnion proporciona una función de barrera estructural, y la coral proporciona un amortiguador inmunológico principalmente para proteger al feto en desarrollo del sistema inmunitario materno2. Inflamación de estas membranas se conoce como colemonionitis. Históricamente, el diagnóstico de colemonionitis clínica se realizó a raíz de la presencia de fiebre materna más uno o más hallazgos clínicos fetales o maternos3,4. Sin embargo, si bien esta definición es clínicamente útil, su falta de precisión ha hecho que la investigación de la colemonionitis sea un desafío. En 2015, en un intento de aclarar el diagnóstico, un taller de panel de expertos del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver definió la colemonionitis como inflamación intrauterina, o infección, o ambas (triple I)3. Esta aclaración es importante porque si bien la infección inducida por microbianos es una causa importante de inflamación uterina/amniótica, ocurre con menos frecuencia que la inflamación estéril uterina/amniótica5,6,7. En general, la colemonionitis sigue siendo un problema importante de salud pública, como se observa en 2\u20124% de los partos a término y 25\u201230% de los partos prematuros8,9.

La colemonionitis puede tener efectos significativos en el feto y el neonato. En la literatura se ha documentado bien que la colemonionitis está asociada con un mayor riesgo de muchas de las morbilidades de la prematuridad, incluyendo displasia broncopulmonar10,lesión de materia blanca cerebral11,hemorragia intraventricular12,retinopatía de prematuridad13,y sepsis neonatal de inicio temprano sospechosa y confirmada14,15. Como estamos interesados en los mecanismos de lesiones y reparación del tracto intestinal inmaduro, es importante tener en cuenta que la colemonionitis también se asocia con el desarrollo posterior de enterocolitis necrosante (NEC)15,16. Nec es una enfermedad gastrointestinal devastadora de los bebés prematuros que resulta en una respuesta disregulada del huésped a la inflamación y la necrosis intestinal posterior17. Cada año, nec afecta a más de 4000 bebés en los Estados Unidos, y hasta un tercio de estos bebés mueren a causa de la enfermedad18. La patogénesis de NEC probablemente implica una combinación de inmadurez intestinal, desregulación del sistema inmunitario inmaduro, inflamación intestinal y translocación bacteriana19,que culmina en una vía común final de necrosis intestinal. Es importante destacar que la aparición de NEC a menudo ocurre semanas después del nacimiento y la exposición potencial a la colemonionitis, haciendo que el vínculo mecanicista entre la colaamnionitis y el desarrollo posterior de NEC no esté claro20. Un mecanismo potencial por el cual la colemonionitis puede contribuir a la fisiopatología de nec es a través de la regulación del sistema inmune materno, produciendo posteriormente una fuerte respuesta inflamatoria fetal que puede interrumpir los patrones normales de desarrollo fetal21,22,23.

Existen múltiples modelos de corioamnionitis en roedores y ovejas24,25,26,27,28,29,30,31,32. Sin embargo, existen pocos datos sobre el desarrollo del tracto intestinal más allá del período inicial del recién nacido después de la exposición fetal inducida por corioamnionitis a la inflamación materna (FEMI). Con el fin de explorar la relación entre FEMI y el posterior desarrollo de lesiones del tracto intestinal inmaduro, hemos adaptado el modelo FEMI inducido por lipopolisacáridos (LPS). Los lipopolisacáridos son un componente importante de la superficie extracelular sobre bacterias gram negativas y son un potente estimulante del sistema inmune innato de múltiples especies eucariotas, incluidos los seres humanos33. La inyección de LPS materno da como resultado una cascada inflamatoria estéril sin los efectos confusos de las bacterias vivas, y es un modelo bien establecido para la inducción del nacimiento prematuro34,así como un modelo de colemonionitis aguda y el síndrome de respuesta inflamatoria fetal (FIRS), que es la forma más grave de colemonionitis24,35. También se ha demostrado que induce lesiones cerebrales de materia blanca y gris en una oveja modelo36 y una murina modelo37,38,39,40. Sin embargo, hasta donde sabemos, somos los primeros en utilizar este modelo de coleamnionitis y FEMI para investigar sus efectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal más allá del nacimiento, así como para investigar un posible vínculo mecanicista entre la coleamnionitis y el desarrollo posterior de NEC41,42.

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Protocolo

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa (Protocolo #8041401). Todos los animales fueron alojados en un vivarium aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AALAC) en la Universidad de Iowa. Todos los ratones eran cepa de tipo salvaje C57Bl/6J.

1. Establecimiento de FEMI en ratones embarazadas

  1. Preparación lps
    1. Utilice LPS derivado de Escherichia coli O55:B5 (concentración de stock 2 mg/ml).
    2. Diluir la concentración de existencias lps 1:100 con solución salina estéril para una concentración de trabajo de 20 μg/ml.
  2. Inyección materna de LPS
    1. Inyecte presas embarazadas en el día de gestación e15. Este punto de tiempo es aproximadamente el 75% a través del embarazo murino, por lo que este modelo es similar al tercer trimestre temprano de los embarazos humanos, que es cuando se producen la mayoría de los partos prematuros debido a la colemonionitis.
    2. Pesar ratones embarazadas inmediatamente antes de la inyección para determinar la dosificación adecuada de LPS.
    3. Calcular la dosis de concentración de trabajo utilizando la siguiente fórmula: 5 μL x gramo de peso corporal (gbw), para una dosis total de LPS de 100 μg/kg. Para animales de control, utilice un volumen equivalente de solución salina normal para inyección.
    4. Solución Vortex LPS tres veces durante 15 segundos en alto antes de cada inyección.
    5. Dibuja el volumen LPS en una jeringa de 1 ml.
    6. Frene al ratón embarazada con una técnica de desaliñada. Sujete en posición de recumbencia dorsal y realice la inyección.
      1. Inserte una aguja de 30 calibres y 8 mm biselado sobre el cuadrante inferior derecho del abdomen (para evitar la vejiga y los vasos abdominales) en un ángulo de 30\u201240°. Inserte aproximadamente 1/4 a 1/2 la longitud de la aguja.
      2. Tire hacia atrás en el émbolo de la jeringa para asegurar la presión negativa antes de la inyección. Proceda con la inyección si hay presión negativa.
      3. Después de la inyección, monitoree ratones durante aproximadamente 30 minutos y luego regrese a jaulas durante el resto del embarazo.

2. Parto y cuidado de la descendencia, y la cosecha intestinal

  1. Entregue cachorros normalmente a través del parto vaginal en e20.
    NOTA: Este modelo tiene una tasa de pérdida fetal dependiente de la dosis esperada que se puede ver en la Figura 1 y se discute en los resultados a continuación.
  2. Permita que los cachorros permanezcan con las madres y reciban alimentos ad libitum.
  3. El día de la cosecha, típicamente el día postnatal 14 (P14), eutanasia a los cachorros a través de la dislocación cervical en cumplimiento de los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
  4. Usando tijeras y fórceps, hacer una incisión vertical por la línea media del abdomen, a través de la piel y el peritoneo, durante toda la longitud del abdomen. Excitar el intestino delgado desde el estómago hasta el cecum con tijeras y eliminar el mesenterio con fórceps.
  5. Aísle y mantenga el distatal 1/3 del intestino delgado (sección representativa del íleo humano), descartando el intestino delgado proximal, el cecum y el colon.
  6. Divida la porción de ileum por la mitad con tijeras.
  7. Coloque la mitad proximal en una solución de estabilización de ARN para una cuantificación posterior del ARN.
  8. Coloque la mitad distal en formalina en búfer neutral al 10% para la preparación de diapositivas.

3. Puntuación de lesiones intestinales

  1. Sección de tejido incrustado de parafina en rodajas de 5 μm de espesor y montaje en toboganes de vidrio.

    NOTA: Enviamos las muestras a un núcleo histología para la incrustación, sección y montaje de parafinas en diapositivas.
  2. Deparafinar diapositivas de acuerdo con los procedimientos estándar.
  3. Mancha secciones con hematooxilina y eosina de acuerdo con los procedimientos estándar.
  4. Puntúe secciones en una escala de 3 puntos para lesiones intestinales como se describió anteriormente42,43.
    1. Utilizando microscopía ligera, evalúe la lesión intestinal generalizada por dos investigadores ciegos separados en una escala de 3 puntos que evalúa la integridad del vello y la separación de la membrana del sótano43 (Figura suplementaria 1). La lesión intestinal se evalúa mejor con una ampliación de 20x y una apertura numérica 0,50.
    2. Asigne una puntuación de 0 para describir la mucosa normal.
    3. Asignar una puntuación de 1 describir lesiones leves que abarca el desarrollo del espacio de Gruenhagen subepithelial, vacuolización o elevación subepithelial limitada a la propria lamina o puntas de villi.
    4. Asignar una puntuación de 2 para describir lesiones graves, indicadas por elevación epitelial y vacuolización mayor a la mitad de la villi, distorsión vil, o ulceración mucosa y desintegración de la propria lamina.

4. Cuantificación de las células de paneth y copas

  1. Después de la deparafinación, las manchas se deslizan de secciones de tejido del Paso 2.8 con mancha alcian Blue/Periodic Acid Schiff para denotar tanto las células de copa como las de Paneth como se describió anteriormente44,45 de acuerdo con los siguientes pasos.
    NOTA: Mientras que la mancha alcian azul/ácido periódico Schiff no es específica ni para las células de Paneth o de la copa, en nuestra experiencia, los investigadores experimentados cegados tienen cuantificación celular equivalente utilizando esta mancha en comparación con los anticuerpos dirigidos a celulares, con significativamente menos mancha de fondo46.
  2. Deparafinar, manchar y deshidratar diapositivas de la siguiente manera.
    1. Sumerja las diapositivas en xileno durante 10 minutos dos veces.
      PRECAUCIÓN: El xileno debe utilizarse en una campana de humo.
    2. Enjuague con etoh 100%.
    3. Sumerge las diapositivas en 100 % EtOH durante 3 min, luego en 90% EtOH durante 3 min, seguido por 70% EtOH durante 3 min, y por último sumergir diapositivas en 50% EtOH durante 3 min.
    4. Lave bajo agua corriente del grifo durante 5 minutos.
      PRECAUCIÓN: Apunte la sección lejos del agua corriente para evitar la pérdida de muestras de tejido.
    5. Filtre la solución de mancha azul alcian con un filtro de café estándar.
    6. Manchas en manchas azules alcian durante 15 minutos y luego lavar bajo agua corriente del grifo durante 2 minutos.
    7. Diluir 1 mg de ácido periódico en 200 ml de agua destilada doble. Sumerja las diapositivas en esta solución durante 5 min. A continuación, lave bajo agua corriente del grifo durante 1 minuto.
    8. Mancha con el reactivo de Schiff durante 10 minutos. Lave bajo agua corriente del grifo durante 5 minutos.
    9. Mancha los toboganes con hematoxilina durante 1 minuto y luego lave bajo agua corriente del grifo durante 2 minutos.
    10. Sumergirlos en alcohol ácido (1 ml de ácido clorhico mezclado en 99 ml de 70% EtOH) durante 1 min.
    11. Sumérgete en el agua del grifo de Scott (0,1% de concentración de NaHCO3 en agua del grifo) durante 1 min y luego lave bajo agua corriente del grifo durante 1 min.
    12. Deshidratar las diapositivas.
      1. Sumerja cada diapositiva 10 veces en 70% EtOH, luego sumerja 10 veces en 90% EtOH, y 10 veces en 100% EtOH.
      2. Sumerge los toboganes en 100% EtOH durante 10 minutos, seguido de sumergirse dos veces en xileno fresco durante 3 minutos cada uno.
    13. Coloque una gota de soporte de montaje en la muestra y coloque una cubierta sobre ella.
  3. Recuento de células de copas
    1. Usando microscopía ligera, cuente las células de la copa(Figura Suplementaria 2). Para cada pieza de tejido intestinal, cuente el número de células de copa y 500 células epiteliales y la proporción de células de copa expresa como una proporción por cada 100 células epiteliales. Las células de copa se cuentan mejor con una ampliación de 20x y una apertura numérica 0,5.
  4. Recuento de celdas paneth
    1. Usando microscopía ligera, cuente las células de Paneth(Figura Suplementaria 2). Para cada pieza de tejido intestinal, expresar como una proporción de las células de Paneth por cripta intestinal. Contar 100 criptas intestinales por cada pieza de tejido intestinal. Las celdas paneth se cuentan mejor con una ampliación de 20x-60x y una apertura numérica 0,50-1,30.

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Resultados

La exposición al FEMI el día embrionario 15 conduce a una pérdida de embarazo dependiente de la dosis y a una tasa de dosis dependiente del trabajo de parto prematuro (Figura 1)42. Para los experimentos, elegimos utilizar una dosis de LPS de 100 μg/kg para minimizar la pérdida del embarazo y la prematuridad (50% de pérdida entre la prematuridad y la muerte fetal intrauterina) mientras exponía a los fetos a un insulto inflamatorio significativo.

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Discusión

La colemonionitis afecta al 2\u20124% del plazo y al 25\u201230% de los partos prematuros8,9. Sin embargo, el impacto de la coleamnionitis puede extenderse mucho más allá del nacimiento, ya que se ha demostrado que tiene efectos significativos en el feto y neonato10,11,12,13,14,

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte a través de los Institutos Nacionales de Salud (DK097335 & T32AI007260) y el Departamento de Pediatría de la Familia Stead de la Universidad de Iowa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10% de formalina tamponada neutraSigmaHT501128
tinción de azul alciánSuministro de recién llegados1003A
C57Bl6/Jratones Jackson Laboratories664
EtanolDecon labs2701
HClSigmaH1758
Tinción de hematoxilinaLeica381562
LPSSigmaL2880
NaHCO3SigmaS6014
Nikon Eclipse Ni-U MicroscopioNikon2CE-MQVJ-1
Ácido PeriódicoACROSH5106CAS# 10450-59-9
RNAlaterThermofisherAm7021
Reactivo de SchiffSigmaS5133
Secor Imager 2400Descubrimiento a escala meso (MSD)
Ensayo V-plex Descubrimiento aescala mesométrica (MSD)
XilenoSigma534056

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Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal
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