Administración Intratraqueal De La Formulación De Polvo Seco En Ratones

Resumen

Las formulaciones de polvo seco para inhalación tienen un gran potencial en el tratamiento de enfermedades respiratorias. Antes de entrar en estudios en humanos, es necesario evaluar la eficacia de la formulación de polvo seco en estudios preclínicos. Un método simple y no invasor de la administración del polvo seco en ratones a través de la ruta intratraqueal se presenta.

Resumen

En el desarrollo de formulaciones de polvo seco inhalable, es esencial evaluar sus actividades biológicas en modelos animales preclínicos. Este papel introduce un método no invasor de entrega intratraqueal de la formulación seca del polvo en ratones. Se presenta un dispositivo de carga de polvo seco que consiste en una punta de pipeta de carga de gel de 200 μL conectada a una jeringa de 1 mL a través de una llave de paso de tres vías. Una pequeña cantidad de polvo seco (1-2 mg) se carga en la punta de la pipeta y se dispersa por 0.6 ml de aire en la jeringa. Debido a que las puntas de pipeta son desechables y baratas, diferentes formulaciones de polvo seco se pueden cargar en diferentes puntas de antemano. Se pueden evaluar varias formulaciones en el mismo experimento animal sin necesidad de limpiar el dispositivo y rellenar la dosis, ahorrando así tiempo y eliminando el riesgo de contaminación cruzada del polvo residual. El grado de dispersión del polvo se puede inspeccionar por la cantidad de polvo restante en la punta de la pipeta. Se incluye un protocolo de intubación en ratón con una fuente de luz a medida y una cánula guía. La intubación adecuada es uno de los factores clave que influye en la entrega intratraqueal de la formulación de polvo seco a la región pulmonar profunda del ratón.

Introducción

La vía pulmonar de administración ofrece diversos beneficios en la entrega de terapias para acciones locales y sistémicas. Para el tratamiento de enfermedades pulmonares, la alta concentración local de la droga se puede alcanzar por la entrega pulmonar, de tal modo reduciendo la dosis requerida y bajando la incidencia de efectos secundarios sistémicos. Por otra parte, las actividades enzimáticas relativamente bajas en el pulmón pueden reducir metabolismo prematuro de la droga. Los pulmones también son eficientes para la absorción de fármacos para la acción sistémica debido a la gran superficie bien perfundida, la capa extremadamente delgada de células epiteliales y el alto volumen de sangre en capilares pulmonares^1.

Las formulaciones de polvo seco inhalado han sido ampliamente investigadas para la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la diabetes mellitus y la vacunación pulmonar^2,3,4. Los fármacos en estado sólido son generalmente más estables que en forma líquida, y los inhaladores de polvo seco son más portátiles y fáciles de usar que los nebulizadores^5,6. En el desarrollo de formulaciones de polvo seco inhalado, la seguridad, el perfil farmacocinético y la eficacia terapéutica necesitan ser evaluados en modelos animales preclínicos después de la administración pulmonar^7. A diferencia de los seres humanos que pueden inhalar polvo seco activamente, la entrega pulmonar de polvo seco a animales pequeños es un desafío. Es necesario establecer un protocolo eficiente de entrega de polvo seco a los pulmones de los animales.

Los ratones son ampliamente utilizados como modelos de animales de investigación porque son económicos y se reproducen bien. También son fáciles de manejar y muchos modelos de enfermedades están bien establecidos. Existen dos enfoques principales para administrar polvo seco al pulmón del ratón: inhalación y administración intratraqueal. Para la inhalación, el ratón se coloca en una cámara de cuerpo entero o sólo de nariz donde se aerosoliza polvo seco y los animales respiran el aerosol sin sedación^8,9. Se requiere un equipo costoso y la eficiencia de la administración de medicamentos es baja. Mientras que la cámara de todo el cuerpo puede ser técnicamente menos desafiante, la cámara de exposición solo para la nariz podría minimizar la exposición de los medicamentos a la superficie del cuerpo. En cualquier caso, todavía es difícil controlar y determinar con precisión la dosis administrada a los pulmones. El polvo seco se deposita principalmente en la región nasofaringe donde el aclaramiento mucociliar es prominente¹⁰. Además, los ratones dentro de la cámara están bajo un estrés significativo durante el proceso de administración porque están limitados y privados del suministro de alimentos y agua¹¹. Para la administración intratraqueal, generalmente se refiere a la introducción de la sustancia directamente en la tráquea. Existen dos técnicas diferentes para lograrlo: la traqueotomía y la intubación orotraqueal. El primero requiere un procedimiento quirúrgico que hace una incisión en la tráquea, que es invasiva y rara vez se utiliza para la administración de polvo. Solamente la segunda técnica se describe aquí. En comparación con el método de inhalación, la administración intratraqueal es el método más comúnmente utilizado para la administración pulmonar en el ratón debido a su alta eficiencia de administración con una pérdida mínima de fármacos^12,13. Es un método simple y rápido para entregar con precisión una pequeña cantidad de polvo dentro de unos pocos miligramos al ratón. Aunque el ratón es anatómica y fisiológicamente distinto a los humanos y se requiere anestesia durante el proceso de intubación, la administración intratraqueal pasa por alto las vías respiratorias superiores y ofrece una forma más efectiva de evaluar las actividades biológicas de la formulación de polvo seco, como la absorción pulmonar, la biodisponibilidad y los efectos terapéuticos^14,15.

Para administrar polvo seco por vía intratraqueal, el ratón tiene que ser intubado, lo que podría ser un desafío. En este papel, la fabricación de un insufflator seco hecho a medida del polvo y de un dispositivo de la intubación se describe. Se demuestran los procedimientos de intubación e insuflación de polvo seco en el pulmón del ratón.

Protocolo

Los experimentos realizados en este estudio han sido aprobados por el Comité sobre el Uso de Animales Vivos para la Enseñanza y la Investigación (CULATR), la Universidad de Hong Kong. Las formulaciones en polvo seco preparadas por liofilización por pulverización (SFD) que contienen 0,5% de ARN mensajero de luciferasa (ARNm), péptido sintético PEG₁₂KL4 al 5% y 94,5% de manitol (p/p) se utilizan en este estudio para demostrar la expresión de ARNm en el pulmón^16. El diámetro aerodinámico medio de masa (MMAD) del polvo sfd es de 2,4 μm. El polvo de manitol secado por aspersión (SD) se utiliza para investigar el efecto del volumen de aire utilizado en la dispersión de polvo¹⁶. El MMAD del polvo SD es de 1,5 μm.

1. Fabricación de insuflador de polvo seco y carga de polvo seco

1. (Opcional) Neutralice las cargas estáticas del polvo seco (en un vial) y la punta de pipeta redonda sin filtro de 200 μL de carga de gel. Utilice un arma antiestática o una balanza con función desionizante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Prepare un papel de pesaje con un tamaño de alrededor de 4 cm x 4 cm. Dobla el papel por la mitad en diagonal y luego desdoblalo.
3. Pesar 1-2 mg de polvo seco en el papel de pesaje.
4. Llene una punta de pipeta de carga de gel con polvo a través de la abertura más ancha de la punta. Toque suavemente para empacar el polvo hasta que el polvo forme aglomerados sueltos cerca del extremo estrecho de la punta (Figura 1A). Evite empacar el polvo demasiado apretado, ya que puede obstaculizar la dispersión del polvo.
5. Conecte la punta cargada de polvo a una jeringa de 1 ml a través de una parada de tres vías (Figura 1B). El tamaño de la jeringa se puede cambiar de acuerdo con el volumen de aire utilizado para dispersar el polvo. Sostenga la punta y la jeringa verticalmente durante la conexión para evitar el derrame de polvo. Si la administración no se realiza inmediatamente, utilice parafilm para sellar las aberturas de la punta y guárdela temporalmente en condiciones adecuadas hasta la administración.

2. Fabricación del dispositivo de intubación

1. Fuente de luz (Figura 2)
   1. Prepare una fuente de luz hecha a medida con una antorcha de diodo emisor de luz (LED) y una fibra óptica flexible con un diámetro de 0,8-1 mm.
   2. Haga un orificio centrado en la lente transparente de la antorcha LED con un taladro de mano o una broca para que la fibra óptica apenas pueda pasar.
   3. Inserte la fibra óptica a través del orificio. Encienda la antorcha LED para ajustar la posición y la profundidad de inserción para obtener el brillo máximo en el otro extremo de la fibra óptica.
   4. Coloque la fibra óptica en su posición con pegamento epoxi transparente.
2. Cánula guía (Figura 3)
   1. Tome una pipeta Pasteur de plástico de 1 mL(Figura 3A)y sostenga la pipeta en ambos extremos.
   2. Utilice una lámpara de alcohol (u otras fuentes de calor en el laboratorio, como un quemador Bunsen) para calentar el centro de la pipeta colocándolo a 5-10 cm por encima de la llama(Figura 3B). Gire la pipeta para asegurarse de que se calienta uniformemente.
   3. Cuando el plástico se vuelva suave y deformable, aleje la pipeta de la llama y estire la pipeta suavemente.
   4. Corte la pipeta estirada en el medio con un par de tijera en la Parte A y la Parte B (Figura 3C-E). Utilice la Parte A como una pipeta de punta fina y la Parte B como una cánula guía. Para aumentar la probabilidad de intubación exitosa con la cánula guía, haga un bisel (no demasiado agudo que puede aumentar el riesgo de lesionar al animal) al final de la Parte B (Figura 3F). Cuando se inserta una punta de pipeta de carga de gel de 200 μL (para la carga de polvo) en la cánula guía, debe sobresalir de la cánula por 1-2 mm.
      NOTA: Una cánula guía (Parte B) con la dimensión apropiada (diámetro interno y externo) para la intubación podría tener una aguja de calibre 21 en su interior, mientras que también puede caber dentro de una aguja de calibre 17. Es posible que se necesiten varios intentos de estirar las pipetas para lograr la dimensión adecuada.
   5. (Opcional): Corte una pequeña abertura en el extremo más ancho de la cánula guía para hacerla más flexible de modo que sea más fácil sostener la fibra óptica (Figura 3F). Esta abertura también permite la instalación de un microsprayer para la administración de aerosol líquido.

3. Intubación

1. Anestesiar el ratón (BALB/c, 7-9 semanas) con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal.
2. Prepare una plataforma hecha de plexiglás y montarla en un soporte con una abrazadera (Figura 4A). Coloque el ratón anestesiado en la plataforma (a unos 60° de inclinación) en posición supina. La altura y el ángulo de inclinación de la plataforma podrían ajustarse por la posición de la abrazadera en el soporte.
3. Suspenda el ratón enganchando sus incisivos a un hilo dental de nylon (Figura 4B). Asegure la posición del ratón con un trozo de cinta adhesiva o una banda elástica.
4. Inserte la fibra óptica en la cánula guía antes de la intubación con la punta del nivel de fibra con la abertura de la cánula guía. Encienda la antorcha LED para iluminar.
5. Sobresalga suavemente la lengua del ratón con un par de pórceps para exponer su tráquea.
6. Utilice la otra mano para sostener la cánula guía con fibra óptica en el interior. Insertarlos a través de la cavidad oral. Con la iluminación de la fibra óptica, la apertura de la tráquea se puede visualizar como un orificio entre las cuerdas vocales.
7. Alinee el bisel de la cánula guía hacia la línea media de la abertura (Figura 5A). Intubar suavemente la cánula guía con fibra óptica en la tráquea apuntando la punta más fina de la cánula en la abertura traqueal.
8. Tras la intubación, retire rápidamente la fibra óptica y deje la cánula guía dentro de la tráquea (Figura 5B). Se debe observar una respiración normal.
9. Sostenga la pipeta de punta fina (Parte A) en la abertura de la cánula guía e insufle una pequeña bocanada de aire (aproximadamente 0,2 mL) en el pulmón del ratón. Una ligera inflación en el pecho del ratón indica una intubación adecuada. Retire la pipeta de punta fina antes de la administración de polvo.

4. Administración de polvo

1. Sostenga la punta cargada de polvo que está conectada a la jeringa como se describe en el paso 1.5. Asegúrese de que el flujo de aire entre la jeringa y la punta esté desconectado.
2. Tire del émbolo de la jeringa hacia atrás para retirar 0,6 ml de aire.
   NOTA: El volumen de aire utilizado para dispersar el polvo depende de las propiedades del polvo y la cantidad de polvo cargado. Esto se describe con más detalle en la sección de resultados.
3. Gire la válvula de la llave de paso de tres vías para conectar el flujo de aire entre la jeringa y la punta cargada de polvo.
4. Inserte la punta cargada de polvo en la cánula guía que ya se ha colocado en la tráquea del ratón (Figura 5C). Sostenga la cánula guía y empuje el émbolo de la jeringa con fuerza en una acción continua para dispersar el polvo como aerosoles en el pulmón.
   NOTA: Cualquier movimiento hacia adelante del dispositivo debe minimizarse para evitar lesionar al animal.
5. Retire la punta y compruebe si el polvo dentro de la punta se ha vaciado. Si no es así, repita los pasos 4.1 a 4.4.
   NOTA: Si el polvo está demasiado apretado debido a un exceso de tapping, es posible que no se disperse correctamente.
6. Una vez que se complete la administración, retire la cánula guía de la tráquea.
7. Permita que el ratón se recupere colocándolo horizontalmente en posición supina con la lengua medio sobresalida para evitar el bloqueo de las vías respiratorias.

Resultados

Cuando se utiliza un insuflador de polvo seco para entregar aerosol en polvo al pulmón de un animal, el volumen de aire utilizado es crítico, ya que afecta la seguridad, así como la eficiencia de la dispersión del polvo. Para optimizar el método, se utilizaron diferentes volúmenes de aire (0,3 mL, 0,6 mL y 1,0 mL) para dispersar el polvo seco (1 mg de manitol secado por aspersión) y se monitorizó el peso de los ratones durante 48 horas después de la administración(Figura 6). El uso de 0,3 mL...

Discusión

En este papel, los dispositivos hechos a medida para la insuflación seca del polvo y la intubación intratraqueal se presentan. En la etapa de carga de polvo, el polvo seco se carga en una punta de pipeta de carga de gel de 200 μL. Es importante tocar suavemente la punta para permitir el embalaje suelto de polvo en el extremo estrecho de la punta. Sin embargo, si el polvo se empaqueta demasiado apretado, se atascarán en la punta y no se pueden dispersar adecuadamente. Se recomienda neutralizar las cargas estáticas del pol...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		BALB/c	Hembra; 7-9 semanas de edad; Peso corporal 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferasa mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Insuflantador de polvo seco	PennCentury	Modelo DP-4M
Ketamina 10%	Alfasan International B.V.
Antorcha de diodo emisor de luz (LED)	NA Unilite Internation	PS-K1
Manitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Punta de pipeta de carga de gel redondo sin filtro (200 µ L)	Labcon	1034-800-000
Hilo dental de nailon	Reach	30017050
Jeringa de un mililitro sin aguja	Terumo	SS-01T
Fibra óptica	Datos de fibra	OMPF1000
péptido PEG12KL4	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLLLLLLLLLLLK-NH2
Plástico Pasteur pipeta de punta	fina Alpha Grifos	LW4061
Llave de paso de tres vías	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.
Pistola antiestática NA Zerostat 3	MILTY 5036694022153

Ratón