Artículo de método

Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas

DOI:

10.3791/61532

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25 de agosto de 2020

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1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.

Resumen

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Aquí presentamos un método eficiente para aislar y cultivar células madre mesenquimales de médula ósea mandibular (mBMSCs) in vitro para obtener rápidamente numerosas células de alta calidad para los requisitos experimentales. Los mBMSCs podrían ser ampliamente utilizados en aplicaciones terapéuticas como células de ingeniería de tejidos en caso de enfermedades craneofaciales y regeneración craneo-maxilofacial en el futuro debido a la excelente capacidad de autorre renovación y potencial de diferenciación multi-linaje. Por lo tanto, es importante obtener mBMSCs en grandes cantidades.

En este estudio, la médula fue limpiada con un chorro de agua de la mandíbula y los mBMSCs primarios fueron aislados con la cultivación adherente entera de la médula. Además, CD29+CD90+CD45− mBMSCs fueron purificados a través de la clasificación de células fluorescentes. La segunda generación de mBMSCs purificados fue utilizada para el estudio adicional y exhibió potencial en el distinción en osteoblasts, adipocytes, y chondrocytes. Utilizando este modelo in vitro, se puede obtener un alto número de mBMSCs proliferativos, lo que puede facilitar el estudio de las características biológicas, la reacción posterior al microambiente y otras aplicaciones de los mBMSCs.

Introducción

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Las células madre mesenquimales de médula ósea (BMSCs) son células madre no hematopoyéticas derivadas de la médula ósea que manifiestan una fuerte capacidad de proliferación y un potencial de diferenciación de múltipleslinajes 1,2,3,4. De hecho, los BMSCs han sido considerados como un candidato ideal para la ingeniería y regeneración de tejidos óseos desde que fueron descubiertos. Durante años, la cresta ilíaca o los huesos largos como la tibia y el fémur han sido la fuente más común de BMSCs para la regeneración craneofacial. Sin embargo, l....

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales en animales en este documento fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal del Noveno Hospital Popular de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai.

1. Preparación

  1. Use dos ratas Sprague Dawley machos de 5 semanas de edad para el experimento.
  2. Esterilizar todos los instrumentos, incluyendo porta agujas, pinzas y tijeras a alta temperatura o sumergidos en etanol al 75% durante 10 min.
    NOTA: La inmersión en etanol no debe ser demasiado larga para evitar el daño celular.
  3. Preparar previamente los medios de cultivo, cuya composición figura en ....

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Resultados

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Usando este protocolo, una gran proporción de células se adhirieron a la placa en el tercer día después de la cultura inicial. Típicamente, después de 3-4 días adicionales de cultivo, la confluencia celular alcanzó el 70-80% (Figura 1B). Con la clasificación de células fluorescentes, dapi-CD29+CD90+CD45− mBMSCs fueron purificados18,22, que representaron alrededor del 81,1% en las células P0.......

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Discusión

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Este protocolo describe un método para aislar BMSCs de mandíbulas de la rata in vitro combinando adherencia entera de la médula y la clasificación fluorescente de la célula, que es una manera simple y confiable de obtener mBMSCs proliferativos con capacidad fuerte de la diferenciación. Este método podría purificar preliminarmente mBMSCs por la clasificación de células de flujo, pero si hay requisitos más altos para la homogeneidad celular, se pueden requerir métodos de purificación más precisos.

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Divulgaciones

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Todos los autores afirman que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Agradecemos la asistencia del Laboratorio de Estomatología Digitalizada y el Centro de Investigación de Anomalías Craneofaciales del Noveno Hospital Popular de Shanghai. El trabajo de este manuscrito está respaldado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, el fondo SHIPM-mu del Instituto de Medicina de Precisión de Shanghai, el Noveno Hospital Popular de Shanghai, la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai [JC201809], el Proyecto de Incentivo del Equipo de Innovación de Alto Nivel para la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Sh....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% Tripsina-EDTA(1X)Gibco25200072
placa de cultivo de 10 cmCorning
acutenaculum
Medio de diferenciación adipogénicoCyagen biosciences inc.MUBMX-90031
Azul AlciánBeyotime Biotechnology
Alizarina rojoSigma-AldrichA5533
Fosfatasa alcalina Kit de desarrolloBeyotime BiotechnologyC3206
alfa-Medio esencial mínimoGE Healthcare HyClone Cell CultureSH30265.01B
Anti -ColágenoII Conejo pAbAbcamab34712
Anticuerpos contra CD16/CD32
Antidecoloración Medio de montaje con DAPIBeyotime BiotechnologyP0131
APC anti-ratón/rata Anticuerpo CD29biolegend inc102215
Cabina de bioseguridadEscoAC2-4S8-CN
CD45 Anticuerpo monoclonal (OX1), PE, eBioscienceInvitrogen12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Anticuerpo monoclonal (HIS51), FITC, eBioscienceInvitrogen11-0900-85
Cence centrífugaL500
Medio de diferenciación de condrogénesiscyagen biosciences inc.
Microscopio de barrido láser confocalZeissLSM880
Countess II FL Contador de células automatizadoInvitrogenAMQAF1000
solución de tinción de violeta cristalinaBeyotime BiotechnologyC0121
Suero fetal bovinoGE Healthcare HyClone Cell CultureSH30084.03
Cabra Anti-Conejo IgG H& L (Alexa Fluor 488)abcamab150077
IncubadoraEscoCCL-170B-8
Microscopio invertidoolympusCKX53
Reactivo de Magzol (Reactivo de Trizol)Micropipeta Magen
Eppendorf
Oil Red O
Medio de diferenciación osteogénicoCyagen Biosciences Inc.MUBMX-90021
Penicilina-EstreptomicinaGibco15070063
solución salina tamponada con fosfato(1X)Gibco20012027
PrimeScript RT Master KitTakaRa Bio IncRR036A
Proteinasa KSigma-AldrichP6556
QuickBlock Tampón de bloqueoBeyotime BiotechnologyP0260
tijera
SYBR1 PremezclaTakaRa Bio Inc
Azul de toluidinaBeyotime Biotechnology
Solución de Azul de Trypan, 0.4%Gibco15250061

Referencias

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  1. Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
  2. Chu, D. T., et al.

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