Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El tono arterial coronario junto con la apertura o cierre de los capilares determinan en gran medida el flujo sanguíneo a los cardiomiocitos a presión constante de perfusión. Sin embargo, es difícil monitorear los cambios dinámicos de las arterias coronarias y los capilares en todo el corazón, principalmente debido a su movimiento y latido sin parar. Aquí describimos un método que permite monitorear la tasa de perfusión arterial, la presión y los cambios de diámetro de las arterias y capilares en los músculos papilares ventriculares derecho del ratón. La arteria septal del ratón se puede acumular y perfundir a un flujo o presión constante con la otra medida dinámica. Después de perfusión con una lectina etiquetada fluorescentemente (por ejemplo, Alexa Fluor-488 o -633 etiquetada Wheat-Germ Agglutinin, WGA), las arterias y capilares (y otros vasos) en el músculo papilar ventrículo derecho y el tabique podrían ser fácilmente imaginedos. Los cambios en el diámetro de los vasos podrían medirse en presencia o ausencia de contracciones cardíacas. Cuando se expresaron proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, se pudieron monitorear características específicas. Por ejemplo, los pericitos se visualizaron en corazones de ratón que expresaban NG2-DsRed. Este método ha proporcionado una plataforma útil para estudiar las funciones fisiológicas de los pericitos capilares en el corazón. También es adecuado para estudiar el efecto de los reactivos en el flujo sanguíneo en el corazón mediante la medición del diámetro vascular / capilar y la presión luminal arterial simultáneamente. Esta preparación, combinada con un sistema de imágenes ópticas de última generación, permite estudiar el flujo sanguíneo y su control a nivel celular y molecular en el corazón en condiciones casi fisiológicas.
Introducción
La regulación adecuada del flujo de presión coronaria asegura suficiente suministro de sangre al corazón para satisfacer sus demandas metabólicas1. Sin embargo, recientemente ha quedado claro cómo el flujo de presión coronario está regulado dinámicamente en el corazón, a pesar de los extensos estudios que se han realizado in vivo e in vitro durante las últimas décadas. Una de las razones es la dificultad de establecer un modelo de trabajo fisiológico para este tipo de estudios debido a la latido constante del corazón. A pesar de todo, se han establecido una variedad de métodos para la observación de los micro-vasos coronarios en tejidos vivos o....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todo el cuidado de los animales fue de acuerdo con las directrices de la Universidad de Maryland Baltimore y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó protocolos.
1. Preparación de las soluciones
NOTA: Preparar soluciones con antelación. Dos tipos de soluciones básicas se utilizan en los experimentos: (1) soluciones salinas fisiológicas (PSS) para superfusato de baño y (2) soluciones de Tirorode para perfusato de lúmenes. Se necesita un burbujeo continuo con CO2 para mantener el pH de PSS. La solución de Tyrode amortiguada por HEPES se utiliza en el lúmenes en lugar de PSS para evitar q....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Cuando un marcador vascular de fluorescencia se perfunde en lúmenes vasculares (aquí WGA conjugado con Alexa Fluor-488), es posible visualizar árboles vasculares enteros como se muestra en la Figura 5 (panel izquierdo) utilizando microscopio confocal de alta velocidad. Una mayor ampliación permite la toma de imágenes de capilar en detalle(Figura 5,Panel derecho). Dado que el sistema presurizado admite un monitoreo constante de la presión luminal, esta preparació.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En el presente trabajo, hemos introducido un método ex vivo notablemente simple pero altamente práctico para estudiar la microcirculación coronaria en el corazón en condiciones fisiológicas. Este método fue modificado a partir de investigaciones mecánicas utilizando ratas2. La adición desafiante fue la tecnología de imágenes con alta velocidad y alta resolución óptica. Por lo tanto, pudimos aprovechar los avanzados sistemas de imágenes ópticas que ahora están disponibles comercialmente. Mediante u.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por el Centro de Ingeniería y Tecnología Biomédica (BioMET); NIH (1U01HL116321) y (1R01HL142290) y la Asociación Americana del Corazón 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de CaCl2 1 M | MilliporeSigma, EE. UU. | 21115 | |
| Solución de MgCl2 de 1 M | MilliporeSigma, EE. UU | M1028 | |
| AxoScope | Molecular Devices, San José, CA, EE. UU. | ||
| Enfriador/incubadora de agua | FisherScientific, EE. UU. | Isotemp 3016S | |
| Confocal | Nikon Instruments, EE. UU. | A1R | |
| Tubo de vidrio personalizado | Drummond Scientific Company | 9-000-3301 | |
| Digidata 1322A | Molecular Devices, San José, CA, EE. UU. | ||
| Microscopio de disección | Olympus, Japón | SZX12 | |
| Endotelina-1 | MilliporeSigma, EE. UU. | E7764 | |
| Pinzas | Fine Scientific Tools | 11295-51 | |
| Heparina Sódica Salt | Sigma-Aldrich, EE. UU. | H3393 | |
| Calentador de solución en línea | Warner Istruments, Hamden, CT, EE. UU. | SH-27B | |
| Isoflurano | VETone, Idaho, EE. UU. | 502017 | |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instruments, Novato, CA, EE. UU | P-97 | |
| Soporte para micropipeta/cánula | Warner Istruments, Hamden, CT, EE. UU. | 64-0981 | |
| Ratón transgénico NG2DsRedBAC | The Jackson Laboratory | #008241 | |
| Hilo de nylon para atar vasos sanguíneos | Living Systems Instrumentation, Burlington, Vermont, EE. UU | THR-G | |
| PDMS (polidimetilsiloxano) | SYLGARD, Germantown, WI, EE. UU | 184 SIL ELAST KIT | |
| Bomba peristáltica | Gilson, Middleton, WI, EE. UU | MINIPULS 3 | |
| Servo de presión Controlador | Systems Instrumentation, Burlington, Vermont, EE. UU. | PS-200-S | |
| Tijeras | Fine Scientific Tools, Foster City, CA, EE. UU. | 15000-10 | |
| Servo Pump Living | Systems Instrumentation, Burlington, Vt, EE. UU | PS-200-P | |
| Controlador de temperatura | Warner Instruments, Hamden, CT, EE. UU | TC-324B | |
| Aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 488 Conjugado | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA EE. UU | W11261 |
Referencias
- Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).
- Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
