Summary
אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.
Abstract
רצף Transposon (Tn-seq) היא שיטה רבת עוצמה המשלבת מוטאגנזה טרנספוסון ו רצף מקבילי מסיבי כדי לזהות גנים ומסלולים התורמים לכושר חיידקי במגוון רחב של תנאים סביבתיים. יישומי Tn-seq הם נרחבים ולא רק אפשרו בדיקה של יחסי גנוטיפ-פנוטיפ ברמת אורגניזם, אלא גם ברמות האוכלוסייה, הקהילה והמערכות. חיידקים גראם שלילי קשורים מאוד עם פנוטיפים עמידות מיקרוביאלית, אשר גדל תקריות של כשל טיפול אנטיביוטי. עמידות מיקרוביאלית מוגדרת כצמיחה חיידקית בנוכחות אנטיביוטיקה קטלנית אחרת. הקוליסטן מיקרוביאלי "השורה האחרונה" משמש לטיפול בזיהומים חיידקיים גראם שלילי. עם זאת, מספר פתוגנים גראם שליליים, כולל Acinetobacter baumannii יכול לפתח התנגדות קוליסטין באמצעות מגוון רחב של מנגנונים מולקולריים, שחלקם אופיין באמצעות Tn-seq. יתר על כן, נתיבי טרנס-תמרת אותות המווסתים את ההתנגדות קוליסטין להשתנות בתוך חיידקים גראם שלילי. כאן אנו מציעים שיטה יעילה של מוטאגנזה transposon ב- Baumannii מייעל הדור של ספריית הכנסה transposon רווי ובניית ספריית אמפיקון על ידי ביטול הצורך אנזימי הגבלה, קשירה מתאם, וטיהור ג'ל. השיטות המתוארות בזאת יאפשרו ניתוח מעמיק של גורמים מכריעים מולקולריים התורמים לכושר של א. באומאני כאשר הם מאותגרים עם קוליסטין. הפרוטוקול ישים גם פתוגנים אחרים ESKAPE גראם שלילי, אשר קשורים בעיקר עם זיהומים עמידים לתרופות שנרכשו על ידי בית החולים.
Introduction
הגילוי של אנטיביוטיקה הוא ללא ספק אחד האירועים המשפיעים ביותר הקשורים לבריאות של המאה ה-20. לא רק אנטיביוטיקה במהירות לפתור זיהומים חיידקיים חמורים, הם גם לשחק תפקיד מרכזי ברפואה המודרנית. ניתוחים גדולים, השתלות והתקדמות ברפואת יילודים וכימותרפיה להשאיר חולים רגישים לזיהומים מסכני חיים וטיפולים אלה לא יהיו אפשריים ללאאנטיביוטיקה 1,,2. עם זאת, התפתחות מהירה והתפשטות של עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים אנושיים הפחיתה באופן משמעותי את היעילות של כל המעמדות החשובים קלינית שלאנטיביוטיקה 3. זיהומים חיידקיים רבים שפעם נוקו בקלות עם טיפול באנטיביוטיקה, כבר לא מגיבים לפרוטוקולי טיפול קלאסיים, גרימת איום רציני על בריאות הציבור העולמי1. עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא המקום שבו תאים חיידקיים לגדול בריכוזים קטלניים אחרת של אנטיביוטיקה, ללא קשרלמשך הטיפול 4,5. יש צורך דחוף להבין גורמים מולקולריים וביוכימיים המווסתים AMR, אשר יסייעו להנחות התפתחות מיקרוביאלית חלופית. באופן ספציפי, פתוגנים ESKAPE הם בעייתיים בהגדרות קליניות הקשורים AMR נרחב. אלה כוללים Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella דלקתריאות , Aצ'ינטובקטר באומאני, Pseudomonas aeruginosa ו Enterobacter spp. בעוד מספר מנגנונים לתרום AMR בפתוגנים ESKAPE, ארבעת האורגניזמים האחרונים הם גראם שלילי.
חיידקים גראם שליליים להרכיב קרום חוץ מגדיר שמגן עליהם מפני תנאים סביבתיים קשים. הממברנה החוצה משמשת כמחסום חחלה כדי להגביל את הכניסה של מולקולות רעילות, כגון אנטיביוטיקה, לתוך התא. שלא כמו קרום ביולוגי אחר, הממברנה החוץ היא אסימטרית. העלון הפנימי מועשר בליפופוליסכריד החשוף לפני השטח, ואילו העלון הפנימי הוא תערובת של פוספוליפידים6. מולקולות Lipopolysaccharide מעוגנות קרום החוץ על ידי שומנים שומרים moiety מוטבע בתוך bilayer שומנים7. הליפים הקאנוניים תחום של Escherichia קולי lipopolysaccharide נדרש לצמיחה של רוב חיידקים גראם שלילי והוא מסונתז על ידי מסלול אנזימטי תשעה שלבים כי הוא אחד המסלולים הבסיסיים ביותר וconserved ב אורגניזמים גראםשליליים 6,,7,,8.
פולימיקסין הם פפטידים מיקרוביאליים cationic כי היעד השימנים תחום של lipopolysaccharide כדי לפגוע קרום החוץ ולריס את התא. האינטראקציה האלקטרוסטטית בין שאריות טעונות בחיוב של פולימיקסין לבין שומנים טעונים שלילית קבוצות פוספט לשבש את קרום התא החיידקי בסופו של דבר מוביל למוות תא,9,10,,11,12,,13. Colistin (polymyxin E) הוא מיקרוביאלית המוצא האחרון המשמש לטיפול בזיהומים הנגרמת על ידי פתוגנים נוסוקומיים עמידים multidrug, כגון Acinetobacter baumannii14,15,16. התגלה לראשונה בשנת 1947, polymyxins מיוצרים על ידי חיידקי הקרקע, Paenibacillus polymyxa17,18,19. פולימיקסין נקבעו לטיפול בזיהומים גראם שליליים במשך שנים לפני השימוש הקליני שלהם היה מוגבל בשל דיווחים של nephro משמעותית- ו neurotoxicity20,,21.
א. באומני הוא פתוגן גראם-שלילי נוסוקומלי שהגביר באופן דרמטי את התמלומות והתמותה של תוצאות המטופל בעשוריםהאחרונים 22. מה שנחשב בעבר פתוגן בסיכון נמוך, מהווה כעת סיכון משמעותי לזיהום שנרכש על ידי בית החולים ברחבי העולם בשל יכולתו המדהימה לרכוש AMR וסיכון גבוהלמגפה 23,24. א. באומאני מהווה יותר מ-10% מהזיהומים הנוזוקומיים בארה"ב. מחלה באה לידי ביטוי כמו דלקת ריאות, בקטרימיה, דלקת בדרכי השתן, עור ודלקות רקמות רכות, דלקת קרום המוח, ודלקת פניםהלב 25. אפשרויות הטיפול בזיהומים A. baumannii הצטמצמו בשל התנגדות נגד כמעט כל מחלקות אנטיביוטיקה, כולל β-לקטמס, fluoroquinolones, טטרציקלין, ו aminoglycosides23,24. השכיחות של עמידים multidrug, עמידים באופן נרחב תרופות ופאן-תרופות עמידים A. baumannii מבודד הוביל לתחייה בטיפול colistin, אשר נחשב לאחת האפשרויות הטיפוליות הבודדות שנותרו עדיין יעיל נגד multidrug עמידים A. baumannii. עם זאת, ההתנגדות הגוברת לקוליסטין בקרב מבודדים באומאני הגבירה עוד יותר את האיום שלה על בריאות הציבורהעולמית 10,11,12,13,,27,,30,31.,
ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה, כגון רצף transposon (Tn-seq), סיפקו כלים חשובים כדי לקדם את ההבנה שלנו של כושר חיידקי במבחנה ו- vivo. Tn-seq הוא כלי רב עוצמה שניתן למנף כדי ללמוד אינטראקציות גנוטיפ-פנוטיפ בחיידקים. Tn-seq ישימה באופן נרחב על פני פתוגנים חיידקיים, שם היא משלבת מוטאגנזה טרנספוסון מסורתית עם רצף מקביל מסיבי כדי למפות במהירות אתרי הכנסה, אשר ניתן להשתמש כדי לקשר מוטציות DNA לגרסאות פנוטיפיות בקנה מידה רחב גנומי32,33,34,35. בעוד שיטות mutagenesis transposon תוארו בעבר, השלבים הכלליים דומים33. ראשית, ספריית הכנסה נוצרת באמצעות מוטאגנזה transposon, שבו כל תא חיידקי בתוך אוכלוסייה מוגבלת חדף transposon החדרה בתוך ה-DNA הגנומי (gDNA). בעקבות מוטגנזה, מוטנטים בודדים הם מאגר. gDNA מופק מבריכת מוטציה הכניסה וצמתים transposon מוגברים ונותנים לתפוקה גבוהה רצף. הקריאה מייצגת אתרי הכנסה, שניתן למפה לגנום. הוספות טרנספוסון המפחיתות את הכושר נופלות במהירות מהאוכלוסייה, בעוד הוספות מועילות מועשרות. Tn-seq כבר אינסטרומנטלי כדי לקדם את ההבנה שלנו של איך גנים להשפיע על כושר חיידקי בלחץ33.
מערכת הטרנס פוסון הימית Himar1 המקודדת ב- pJNW684 נבנתה ומוטבה במיוחד למטרת מוטאגנזה טרנספוסון. הוא כולל טרנספוסוןימי-משפחה המאגף את גן ההתנגדות kanamycin, אשר משמש לבחירה של מוטציות החדרת transposon ב A. baumannii. הוא גם מקודד יזם ספציפי A. baumannii שמניע ביטוי של גן קידוד transposase36. הטרנספוןמבוסס הימאים מכיל גם שני מחסלים תרגום במורד הזרם של גן התנגדות kanamycin, אשר מונע קריאה במורד הזרם שלהכניסה 37. pJNW684 נושא גם RP4/oriT/oriR6K-מותנה מקור של שכפול אשר דורש את הגן ωpir תרם על ידי זןהתורם לשכפל 38. בהיעדר הגן, וקטור pJNW684 הנושא את מכונות הטרנספוזיציה לא יוכל לשכפל במקבל A. baumannii זן 10,36,38. לכן, במהלך התייחדות חיידקים, רק transposon מוכנס לתוך הגנום הנמען ללא החדרת רקע של פלסמיד, אשר נושא את הגן transposase. הדבר משמעותי משום שהאובדן של פעילות הטרנספוז יחד עם הפלסמיד גורם לאירוע טרנספוזיציה יחיד ויציב שמונע מהטרנספוסון לעבור למיקומים שונים ברגע שהוא מוסיף לגנום הנמען.
pJNW648 נבדק גם לפעילות באורגניזם גרם שלילי אחר, E. coli. הרכבה מוצלחת של ספריית Tn-seq רוויה בזן E. coli W3110 הצביע על המערכת היא נוחה לבצע mutagenesis במגוון רחב של פתוגנים, כולל Enterobacteriaceae. יתר על כן, היזם הספציפי A. baumannii שמניע ביטוי transposase יכול להיות מוחלף במהירות עם יזם ספציפי למין. לבסוף, הגן התנגדות kanamycin ניתן להחליף קלטות התנגדות אחרות, בהתאם פנוטיפ AMR של האורגניזם נחקר.
גורם אחד שתורם להתנגדות קוליסטין ב- Baumannii הוא ניהול של מינונים לא מספיקים, שבו חיידקים נחשפים ללחץ סלקטיבי ברמות לאקטלניות 39. מספר דיווחים הראו כי ריכוזים מיקרוביאליים תת-נפחיים יכולים לגרום לתגובות מוסדרות שמשנות את הפיזיולוגיה של התא כדי להפחית את הרגישות של כל אוכלוסייתהחיידקים 11,12,30,31. באמצעות Tn-seq, גילינו גורמים המסדירים את התנגדות קוליסטין ב A. baumannii זן ATCC 17978 לאחרחשיפה מעכב 10 וריכוזים subinhibitory של קוליסטין. דוגמה זו מפרטת שיטת Tn-seq המייעלת את הבנייה וההעשרה של ספריית מוטציה רוויה הטרנספוסון באמצעות משפחת הטרנספוסון40,41. בעוד מספר פרוטוקולי Tn-seq מייצרים 20,000 - 100,000 מוטנטים35,42,43,44,45,46, הפרוטוקול המתואר בזאת יכול ליצור במהירות ספריית transposon של 400,000 + מוטנטים, אשר בערך משווה להחדרת transposon כל 10 זוגות בסיסים ב A. baumannii10. יתר על כן, ניתן לשנות את גודל הספרייה ללא מאמץ נוסף משמעותי. שיטה זו גם מבטלת את הדרישה למגבלות אנדונו-ליאות, קשירה של מתאם וטיהור ג'ל, מה שיכול להפחית את הגיוון הסופי בספרייה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת זן חיידקי
- פס זן "תורם" (E. coli MFD DAP-/ pJNW684, Table of Materialsטבלת חומרים ) עבור מושבות מבודדות על לוריה-Bertani אגר בתוספת עם 600 μM חומצה דיאמונופלית (DAP), 100 מ"ג / L של אאמפיצילין ו 25 מ"ג / L של kanamycin. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. באמצעות מושבה מבודדת אחת, לחסן 50 מ"ל של מרק לוריה (LB) בתוספת 600 μM DAP, 100 מ"ג / L של אמפוצילין ו 25 מ"ג / L של kanamycin ב בקבוקון Erlenmeyer 250 מ"ל ולתייג אותו כ"תורם".
- פס זן "הנמען" (A. baumannii זן ATCC 17978, טבלת חומרים ) למושבות מבודדות על לוריה-ברטני אגר. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. באמצעות מושבה מבודדת אחת, לחסן 50 מ"ל של LB בקבוקון Erlenmeyer 250 מ"ל ולתייג אותו כ"נמען".
- דגירה שתי התרבויות ("תורם" ו "נמען") לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות.
2. הזדווגות חיידקים
- מעבירים תרביות לילה לצינורות חסונים של 50 מ"ל.
- גלולה הן תרביות הנמען והן תרביות התורמים באמצעות צנטריפוגציה ב 5,000 x g עבור 7 דקות.
- להיפטר supernatant ולתו מחדש את גלולת זן "התורם" ב 35 מ"ל של LB בתוספת DAP לשטוף את אנטיביוטיקה שיורית.
- גלולת "התורם" תאים זן באמצעות צנטריפוגציה ב 5,000 x g עבור 7 דקות.
- השליכו את הסופרנטנט ופנסו מחדש את גלולת הזן "התורם" ב-4.5 מ"ל של LB בתוספת DAP. השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
- העבר את זן "התורם" התופנה מחדש לצינור המאמץ "הנמען", המכיל את התאים "הנמענים" עם כדוריות. השתמש באותה פיפטה סרולוגית 10 מ"ל משלב 2.5 כדי לערבב את התרבויות. תעבור מיד לשלב הבא.
הערה: הנפח הכולל של ההשעיה הסופית צריך להיות 5 מ"ל. - להפיץ את מתלה ההזדווגות כמו בודדים 100 μL טיפות על לוחות אגר LB בתוספת DAP (5-7 טיפות לצלחת)(איור 1A).
- דגירה צלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- מבלי להפריע לטיפות, העבר בזהירות את הלוחות לאקובטור של 37°C ואפשר לתרבויות להזדווג במשך שעהאחת .
הערה: תקופות דגירה העולה על 1 h סיכונים דור של מוטנטים אחות. - לאחר הדגירה, להוסיף 1.5 מ"ל של LB על כל צלחת וקציר על ידי תוסף חיידקים מן הצלחות. השתמש במיקרו-פיפפט של 1 מ"ל לצורך התחדשות. כרך סופי צריך להיות כ 12 - 15 מ"ל.
- שלב תאים שנקטפו בצינור חרוכי של 50 מ"ל.
- גלול את התאים המזדווגים באמצעות צנטריפוגציה ב 5,000 x g במשך 7 דקות.
- בטל את תאי supernatant וssuspend ב 50 מ"ל של LB כדי להסיר DAP שיורית.
- גלול ההזדווגות באמצעות צנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 7 דקות.
- חזור על שלב השטיפה (שלבים 2.13 ו- 2.14).
- באמצעות פיפטה סרולוגית 10 מ"ל, להשתמש מחדש את הכדור ב 10 מ"ל של LB בתוספת 25% גליסריול.
- באמצעות תאים שטופים, בצע חמישה דילולים טוריים במרק LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
- מורחים 100 μL של כל דילול על 4 צלחות שונות באמצעות חרוזי זכוכית סטרילית: לוריה-ברטני אגר בתוספת kanamycin, אגר בתוספת אאמפצילין, אגר בתוספת DAP ו אגר בלבד.
- דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס הלילה.
- Aliquot ההזדווגות הנותרת ב 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב -80 °C.
3. לקבוע את דילול המתאים של ספריית transposon
- הקלט יחידות יוצרות מושבה (CFU) מלוחיות לילה.
- תמונה צלחת עם מושבות לספור עבור כל מצב צלחת שונה(איור 2A).
הערה: שני זנים "תורם" ו "נמען" צריך לגדול על צלחות אגר בתוספת DAP, כך רוב דילול מצופה יניב דשא. רק זן "הנמען" יכול לגדול על צלחות אגר. לא "התורם" ולא זן "הנמען" יכול לגדול על צלחות אגר בתוספת אאמפיצילין, כך לא צריך להיות צמיחה אף / מינימלית. רק תאי זן היעד קידוד החדרת transposon יכול לגדול על לוחות אגר בתוספת kanamycin. המושבות צריכות להשתנות בגודלן, מה שמצביע על הוספות טרנספוסון בגנים שתורמים לכושר גופני על אגר בתוספת קאנמיצין. - לחשב את מספר מוטציות transposon בהזדווגות קפואה על ידי ספירת מספר המושבות על לוחות אגר LB בתוספת kanamycin.
הערה: עבור הגנום A. baumannii (כ 4 Mbps), המטרה הייתה להשיג כ 400,000 מושבות על מנת ליצור ספריית מוטציה ברזולוציה גבוהה (כ אחד טרנספוסון הכנסה / 10 זוגות בסיס). עם זאת, מספר זה צריך להיות ממוטב בהתבסס על גודל הגנום של מין היעד).
4. דור ספריית מוטנטים חיידקיים סופית
- להפשיר את ההזדווגות הקפואה על הקרח.
- הזדווגות צלחת על 150 מ"מ לוריה-Bertani agar צלחות בתוספת kanamycin מבוסס על CFUs מחושב בשלב 3.1. כוונן את עוצמת הקול עם LB כדי להניב 13,333 מושבות לכל 150 μL לפני ציפוי.
הערה: ספירת CFU כאן נקבעה להיות על 10 5 CFU / מ"ל,כך נפח ההזדווגות הותאם כדי להשיג 13,333 מושבות לכל צלחת כמו זה יספק מספר אופטימלי של מושבות על 30 צלחות עבור ספריית מוטנט ברזולוציה גבוהה מבלי להצפיפות את הצלחות. - השתמש חרוזי זכוכית סטרילית כדי להפיץ 150 μL של דילול לכל צלחת על 30 x 150 מ"מ לוריה-Bertani אגר צלחות בתוספת kanamycin כדי להשיג 400,000 מושבות (איור 1C).
הערה: מוטות סטריליים או כל סוג של כלי מפזר סטרילי (כלומר, חרוזי זכוכית) עשויים לשמש כדי להפיץ את החיידקים על צלחות. - השלך את הצינור המשמש המכיל הזדווגות עודפת.
הערה: מחזורי הקפאה/הפשרת מוסיפים לחצים סלקטיביים על התרבות החיידקית, אשר יכול להטות את תוצאות הניסוי Tn-seq. השתמש ב-aliquot טרי בכל פעם. - דגירה צלחות ב 37 ° C עבור 14 שעות.
הערה: זמן הדגירה ממוטב כדי למנוע עודף (נגיעות במושבות). מזעור הצמיחה על ידי הפחתת זמן הדגירה מוצע.
5. הערכת צפיפות הספרייה ואחסון
- תספור חוזי CFUs בכל לוח כדי להעריך את סך המוטנטים בספריית הטרנספוסון. לספור 20% של לפחות 3 צלחות כדי לקבוע את אומדן ספירת המושבה עבור כל קבוצתהצלחות (איור 2א). ודא שהמושבות לא נוגעות במושבה אחרת.
- לאחר חישוב תפוקת המושבה המשוערת, להוסיף 3-5 מ"ל של LB (או יותר במידת הצורך) לכל צלחת ולגרד את החיידקים באמצעות כלי גירוד סטרילי.
הערה: לולאות סטריליות שימשו לגרד צלחות ביעילות. - מתלים חיידקיים בריכה מכל הצלחות לתוך צינורות חוטיים 50 מ"ל(איור 1D). זה ידרוש מספר צינורות חרובים 50 מ"ל, לפחות 3.
- גלולה אוגר מתלים חיידקיים באמצעות צנטריפוגציה ב 5,000 x g במשך 7 דקות.
- השליכו את גלולת העל וההתלה מחדש ב-5 מ"ל של LB בתוספת 30% גליטרול.
- Aliquot 1 מ"ל של ספריית transposon לתוך cryovials ולאחסן ב -80 ° C.
6. זיהוי גורמים המסדירים את התנגדות הקוליסטין ב- A. baumannii
- הכנת 4 x 250 מ"ל מגני ארלנמאייר עם כל אחד המכיל מרק LB 50 מ"ל LB ותווית כמו (איור 2B)
- א. באומאני זן ATCC 17978 ספריית Tn-seq; (-) colistin_1
- א. באומאני זן ATCC 17978 ספריית Tn-seq; (-) colistin_2
- א. באומאני זן ATCC 17978 ספריית Tn-seq; (+) colistin_1
-
א. באומאני זן ATCC 17978 ספריית Tn-seq; (+) colistin_2
הערה: בצמיחת האתגר המתוארת כאן, כל תנאי, (-) בקרת קוליסטין ואתגר colistin (+), נבדק בכפילות. לכן, ההתקנה דורשת 4 x 250 מ"ל מבחנות Erlenmeyer, שניים לכל תנאי.
- הוסף 50 μL של 0.5 מ"ג / L colistin (+) מבחנות colistin (6.1.3 ו 6.1.4) ו 50 μL מים (-) מבחנות colistin (6.1.1 ו 6.1.2).
- להפשיר את ספריית Tn-seq קפוא aliquot מ שלב 5 על קרח.
- פיפט 1 μL של הספרייה המופשרת לתוך 1 מ"ל של PBS.
- מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 דפים לשעה (OD600)והכפל ב- 1,000.
הערה: פעולה זו קובעת OD600 מתוך 1 μL של ספריית Tn. - בהתבסס על החישוב בשלב 6.5, לחסן כל בקבוקון המכיל 50 מ"ל LB כדי ODהסופי 600 0.001.
- לגדול תרבויות באינקובטור רועד ב 37 ° C כדי OD600 0.5.
הערה: חשוב כי תרבויות להישאר בשלב צמיחה לוגריתמית, כך שאם המתח שלך הוא ב ODשונה 600 במהלך צמיחה מעריכית, OD600 צריך להיות מותאם כדי להבטיח את התרבות משכפלת פעמים רבות ככל האפשר בתוך שלב הצמיחה לוגריתמית. אם התרבות משכפלת רק 3 פעמים, הכוח לזהות פגמים בכושר אצל מוטנטים מוכתר בהבדלים פי 3, בתיאוריה. מאז חיידקים שונים יש זמני הכפלה שונים, חשוב לזרוע את התרבויות ב ODקבוע 600 כדי לנרמל את אינוקולום ההתחלתי. פעולה זו מבטיחה ייצוג עקבי של הספרייה כולה בכל התרבויות. - תרביות קציר באמצעות צנטריפוגציה ב 5,000 x g ב 4 ° C במשך 7 דקות.
- הסר את הסופרנטנט ושטיפה עם 50 מ"ל של PBS.
- גלולה באמצעות צנטריפוגציה ב 5,000 x g ב 4 ° C במשך 7 דקות.
- הסר את supernatant ולתחות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של PBS. Aliquot ~ 200 μL לתוך 5 צינורות מיקרוצנטריפוגה.
- גלולה באמצעות צנטריפוגציה ב 5,000 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות. הסר את כל הסופרנטנט באמצעות קצה פיפטה.
- לאחסן כדורי ב -20 °C או להמשיך עם החילוץ gDNA.
7. חילוץ gDNA
- להפשיר כדור תא אחד על קרח.
- מוסיפים 0.6 מ"ל מאגר לוגיזה (טבלתחומרים ) ומערבולת כדי לתוסת מחדש לחלוטין את הכדור.
- דגירה ב 37 ° C עבור 1 שעה.
- להוסיף 0.6 מ"ל של פנול / כלורופורם / אלכוהול isoamyl לדגימה ומערבולת במרץ.
- שלבים נפרדים באמצעות צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה במהירות מרבית בבית זמני בחדר למשך 5 דקות.
- העבר את שלב המים העליון לצינור חדש. הימנע מלהפריע לממשק השלב במהלך ההעברה.
- הוסף נפח שווה של כלורופורם לשלב המיווס המתקבל לעיל ומערבולת במרץ.
- שלבים נפרדים באמצעות צנטריפוגה במיקרוצנטריפוגה במהירות מרבית בבית הזמני בחדר למשך 5 דקות.
- העבר את שלב המים העליון לצינור חדש.
הערה: הקפד להימנע מלהפריע לממשק במהלך ההעברה. - מוסיפים 2.5 נפח שלב מים של קר 100% אתנול ולערבב בעדינות. דנ"א מזרז יהיה גלוי.
- מניחים שפופרת ב -80 °C למשך שעה אחת לפחות.
- DNA גלולה באמצעות צנטריפוגה במהירות מקסימלית ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- בזהירות להסיר supernatant מבלי להפריע את כדור ה-DNA ולשטוף עם 150 μL של 70% אתנול על ידי pipetting.
- DNA גלולה באמצעות צנטריפוגה במהירות מקסימלית ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות.
- הסירו בזהירות את הסופרנטנט.
- חזור על שלב 7.14 פעם אחת. הסירו בזהירות את כל האתנול הנותר.
- דנ"א יבש על ידי דגירה זמנית בחדר במשך 5-10 דקות.
- גלולת DNA תולה מחדש ב 100 μL TE מאגר על ידי pipetting.
8. גישול DNA (איור 3א)
- לדלל gDNA עם מאגר TE לריכוז של 250 ng/mL בנפח כולל של 200 μL.
- מניחים צינורות באמבט מים.
- Sonicate DNA כדי להניב שברים של כ 300 נוקלאוטידים. כוח: 60 %, זמן כולל: 20 דקות, מחזורים: 10 s ON ו 10 s כבוי ב 4 °C(איור 3A).
- מאשר שהדנ"א נגזל כראוי על ידי הפרדת 10 μL של דנ"א לא משרשר ו-10 μL של דנ"א גוז על ג'ל אגוארוס 1%. חזור על sonication או למטב כצורך (איור 3B).
9. תוספת זנב פולי-סי לסוף 3' (איור 3A)
- הגדרת תגובת poly-C בהתאם לטבלה 1.
- תגובת דגירה ב 37 ° C עבור 1 שעה.
- לטהר את תגובת פולי-C עם 40 μL של חרוזים פארמגנטיים בחירת גודל(איור 3A)על ידי ביצוע השלבים הבאים.
- הוסף 40 μL של חרוזים פארמגנטיים בחירת גודל לכל מדגם. מערבולת ~ 5 s או פיפטה למעלה ומטה.
- דגימות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- בקצרה, צינורות צנטריפוגה לאסוף נוזל בתחתית הצינור (~ 2 s).
- מעבירים צינורות למדף מגנטי ותדנו בטמפרטורת החדר למשך כ-2 דקות עד שהפתרון נקי.
- עם צינורות על מתלה מגנטי, בזהירות להסיר את supernatant.
- עם צינורות על מתלה מגנטי, להוסיף 200 μL של מוכן טרי 80% אתנול (נא לא להפריע חרוזים).
- דגימות דגירה לפחות 30 s עד הפתרון ברור.
- עם צינורות על מתלה מגנטי, בזהירות להסיר את supernatant.
- חזור על שלב השטיפה (שלבים 9.3.6 - 9.3.8).
- לאסוף נוזל בתחתית הצינור באמצעות שלב צנטריפוגציה קצר (~ 2 s).
- העבר צינורות למדף המגנטי והסר את כל הנוזלים הנותרים.
- דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2-5 דקות כדי לייבש דגימות. אל תייבש יותר מדי.
- הסר צינורות מהמדף המגנטי ולהוסיף 25 μL של מים לכל אחד. מערבולת עבור ~ 5 s או פיפטה למעלה ומטה.
- בקצרה, צינורות צנטריפוגה לאסוף נוזל בתחתית הצינור (~ 2 s).
- מעבירים צינורות למדף המגנטי ומאפשרים לשבת כ-2 דקות עד שהפתרון יהיה ברור.
- עם צינורות על המדף המגנטי, להסיר נוזל מבלי להפריע חרוזים ולהעביר צינור חדש (~ 23 μL של ה-DNA).
10. צומת Transposon הגביר (איור 3A)
- הגדרת PCR 1 כמתואר בטבלה 1 עבור PCR המקונן הראשון (טבלה 2).
- בצע PCR 1 באמצעות תנאים המתוארים בטבלה 1.
- לטהר מוצרי PCR עם 40 μL של חרוזים פארמגנטיים בחירת גודל (צעדים 9.3.1 – 9.3-12). אלגנטיות ב 50 μL של מים (צעדים 9.3.13 – 9.3.16). בשלב זה ניתן לאחסן את הדגימות ב- -20 °C.
- הכן חרוזים פארמגנטיים בשילוב סטרפטאבידין:
- תוסתה מחדש את חרוזי סטרפטאבידין על ידי רעד נמרץ.
- להוסיף 32 μL של חרוזים לכל דגימה לצינור microcentrifuge טרי.
הערה: חרוזים עבור 6 + דגימות ניתן להכין בצינור יחיד. - העבר את הצינור למדף מגנטי. דגירה במשך ~ 2 דקות עד הפתרון ברור.
- עם צינור על מתלה מגנטי, להסיר supernatant.
- הסר את הצינור מהמדף המגנטי. לשטוף חרוזים על ידי resspending 1 מ"ל 1x B & W מאגר על ידי pipetting למעלה למטה.
- העבר את הצינור למדף מגנטי. דגירה במשך ~ 2 דקות עד הפתרון ברור.
- עם הצינור על מתלה מגנטי, להסיר את supernatant.
- שלב שטיפה חוזר עם מאגר B&W של 1 מ"ל (שלבים 10.4.5 – 10.4.7) פעמיים יותר עבור 3 שטיפה בסך הכל.
- הסר צינור ממדף מגנטי וחרוזי תווסת מחדש ב- 52 μL של 2x B & W מאגר לכל דוגמה.
- שלב 50 μL של החרוזים המוכנים עם 50 μL של PCR1 מטוהר (משלב 10.3). פיפט לערבב.
- לסובב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- לשטוף את ה-DNA לא מאוגד:
- בקצרה, צנטריפוגה לאסוף נוזל בתחתית הצינור (~ 2 s).
- העבר את הצינור למדף מגנטי. דגירה במשך ~ 2 דקות עד הפתרון ברור.
- עם הצינור על מתלה מגנטי, להסיר את supernatant.
- הסר את הצינור ממדף מגנטי, לשטוף חרוזים על ידי resuspending 100 μL 1x B & W מאגר ו pipetting למעלה ומטה.
- מעביר צינור למדף מגנטי. דגירה במשך ~ 2 דקות עד הפתרון ברור.
- עם צינור על מתלה מגנטי, להסיר supernatant.
- חזור על שלבי שטיפה עם 100 μL LoTE (שלבים 10.7.4 – 10.7.6) פעמיים יותר עבור סך של 3 שטיפה.
- הגדרת PCR 2 כמתואר בטבלה 1 כדי להגביר צמתים transposon ולהוסיף ברקוד יחיד לכל דוגמה(טבלה 2 וטבלה 3).
- בצע PCR 2 באמצעות תנאים המתוארים בטבלה 1.
- לטהר עם 40 μL של גודל הבחירה חרוזים paramagnetic (צעדים 9.3.1 – 9.3.12). אלגנטיות ב 17 μL של מים (שלבים 9.3.13 – 9.3.16), לאסוף ~ 15 μL.
- לכמת את ריכוז הדנ"א באמצעות פלואורומטר. הריכוזים הסופיים צריכים להיות ~ 50 כדי 250 ng/μl.
- הערכת איכות ה-DNA באמצעות אלקטרופורזה נימה מבוססת שבב(איור 4A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטות המתוארות מתארות את הדור של ספריית טרנספוסון בצפיפות גבוהה ב- A. baumannii זן ATCC 17978 באמצעות התייחדות חיידקים באמצעות E. coli MFD DAP- ,אשר משכפל את pJNW684 plasmid (איור 4B). הפרוטוקול המפורט משתמש בהתייחדות חיידקים דו-הורית להעברת pJNW684 מהזן E. coli ρpiir+ תורם לזן מקבל A. baumannii. זוהי שיטה יעילה וזולת ליצירת ספריות מוטנטיות טרמפוסון צפופות. חיידקים היו מעורבים ביחסים אופטימיזציה והזדווגות זוהו על צלחות agar לוריה-Bertani עבור 1 h(איור 1A). במהלך ההזדווגות הועבר הטרנספוזון מהתורם לזן הנמען, שם הוכנס ל-GDNA(איור 1B). הזדווגות נאספו, כ 105 CFU / מ"ל חושבו ומצופה על 150 מ"מ x 15 מ"מ צלחות אגר בתוספת kanamycin. לאחר 14 שעות של צמיחה ב 37 °C, צלחות הכילו אלפי מושבות בגדלים שונים (איור 1C) המציין דור מוצלח של ספריית מוטציה transposon. מוטציות הכניסה transposon היו מאגרים (איור 1D ) והוקפאaliquots כדי למנוע מחזורי הקפאה חוזרים ונשנים, אשר יכול להוסיף לחץ סלקטיבי על ספריית הכניסה.
ספריית המוטציה הטרנספוסון של A. baumannii הבריכה שימשה לזיהוי גורמי כושר החשובים להתנגדות קוליסטין תחת ריכוזים תת-רביעיים של מיקרוביאלית(איור 2B). ספריית מוטציה גדלה לשלב לוגריתמי בהיעדר / נוכחות של 0.5 מ"ג / L colistin ב כפול לרוקן תאים מוטנטיים קידוד הוספות בגנים התורמים התנגדות colistin. ה-gDNA הכולל של בריכת הספרייה הנותרת היה מבודד מתרבויות שליטה וניסיוניות ומעובד כדי להכין DNA לצורך רצף (איור 3א).
GDNA מבודד היה מפוצל באמצעות גיזה מכנית וזנב פולי-C נוסף על שברי ה-DNA(איור 3A). בעקבות התוספת של זנב פולי-C, ה-DNA טוהר וצמתים טרנספוסון-גנום הועשרו באמצעות פריימר ספציפי poly-C ואחריו סיבוב שני של PCR באמצעות פריימר ספציפי פולי-C אחר שהציג את אתר רצף P7 אשר נדרש לכריכת תא זרימה אילומינה ודור אשכול, וברקוד שישה בסיס המשמש כדי demultiplex ספריותמיקוד 37,47. ריכוזי ה-DNA חושבו והדגימות נותחו באמצעות אלקטרופורזה נימה מבוססת שבב כדי לאשרגירסאות build מוצלחות של ספרייה (איור 4A),המוכנות לתפוקה גבוהה.
ספריות דנ"א רצף על ידי רצף הדור הבא. ריצה חד-סוף של 50 מחזורים בוצעה, שהניבה 30 מיליון קריאה/מדגם באיכות גבוהה המספקים כיסוי פי 62.5 של ספריית הטרנספוסון. צמתים טרנספוסון (קורא) מופו לגנוםהתייחסות 48, באמצעות תוכנת ניתוח ביו אינפורמטיקה זמינה מסחרית. מספר הקריאה בכל אתר הכנסה בדגימות הקלט, (-) מצב בקרת colistin, הושוו למספר הקריאה בדגימות פלט, (+) מצב ניסיוני colistin, ותוצאות כושר עבור כל אתר הכנסה חושבו. תוצאות הכושר היו אז מקבוצה לפי גן. גנים המדגימים ציונים מופחתים כאשר הספרייה גדלה בנוכחות קוליסטין ביחס לדגימות הקלט נחשבו לגורמים מכריעים כושר להישרדות A. baumannii בריכוזי subinhibitory של קוליסטין. לדוגמה, הוספות transposon בתוך מערכת שני רכיבים PmrAB היו נוכחים בדוגמת הקלט, אך לא נמצאו בדוגמת הפלט. PmrAB ישירות מסדיר את הביטוי של pmrC, אשר מעביר פוספוסואתנולמין על שומנים A כדי לנטרל את החיוב על פניהשטח של התא 12,31. נטרול של טעינת פני השטח החיידקיים נחשב כדי להפחית את הפוטנציאל האלקטרוסטטי הנדרש להרג קוליסטין-מתווכים. זיהוי של גנים מרוקנים ידוע לתרום פנוטיפ ההתנגדות אימת את השיטה.
איור 1: סכמטי של בניית ספריית מוטציה טרנספוסון. (א)התייחדות חיידקית. זן ה"תורם", המקודד את מכונות הטרנספוזיציה, היה מעורבב עם זן ה"נמען". התערובת נצפתה על צלחות אגר LB והורשו להזדווג במשך 1 h.(ב)דור של ספריית transposon. הפלסמיד שנשא את מכונות הטרנספוזיציה הועבר מהזן "התורם" לזן "הנמען" והטרנספוזון הוכנס באופן אקראי לאורך כל הגנום של זן "הנמען". בחירה. תאים וכתוצאה מכך היו מצופה על לוחות אגר בתוספת kanamycin לבחור עבור מוטנטים החדרת transposon. (ד)ספרייה עם מאגר. המושבות נשרדו מהצלחות, הונו מחדש ב-LB ואספו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תוצאות התייחדות חיידקים מייצגות וסכמטי של ניסוי Colistin Tn-seq. (א)לוח בחירה מייצג של קאנמיצין. הצלחת מחולקת לחמישה חלקים שווים. נקודות כחולות מייצגות את ספירת המושבות להערכת מוטציות החדרת טרנספוסון א. באומאני. לפחות שלוש לוחיות נפרדות נספרו כדי לחשב את ההערכה הסופית. (ב)זיהוי גורמי כושר בריכוזי קוליסטין subinhibitory. ספריית הטרנספוסון הנסגרת גדלה לשלב הצמיחה הלוגאריתמי בהיעדר (שליטה) או בנוכחות (ניסיונית) של קוליסטין. ברגע שהתרבויות הגיעו לצפיפות אופטית מתאימה, התאים היו כדוריים gDNA חולץ מכל מדגם. כל מצב נבדק בכפילות עבור סך של ארבע דגימות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תרשים זרימה של ספריית אפליקון DNA לבנות עבור רצף מקביל מסיבי ונציג גזור gDNA. (A)ספריית DNA Tn-seq לבנות סכמטי. לאחר החילוץ, gDNA היה מפוצל באמצעות גירס מכני. מסוף deoxynucleotidyl transferase שימש כדי להוסיף זנב פולי-C לקצה 3 ' של DNA מפוצל לפני PCR הגבירה של צמתים טרנספוסון-גנום ותוספת ברקוד. (ב)1% ג'ל agarose של ספריות מוטציה unsheared וגזוז A. baumannii בעקבות צעד גזוז GDNA. סולם 1 Kb שימש כסמן DNA. מריחת gDNA ג'י-די-איי נעה בעיקר בין כ- 100 ל-500 זוגות בסיסים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תוצאות בקרת איכות מייצגת (QC) ומפת הפלסמיד הנושאת את הגנים הטרנספוזיציה. (A)מעקב QC לבניית ספריית DNA. יש שיא ב ~ 350 זוגות בסיס, המציין בניית ספרייה מוצלחת. אם זוהו דנ"א גדול יותר בתוצאות ה-QC, ניתן לנקות את הדגימות עוד יותר כדי להסיר שברי דנ"א גדולים. (ב)פלסמיד pJNW684 מורכב טרנספוסון הימי Himar1 (ירוק) עם קלטת התנגדות kanamycin (סגול) לבחירה מוטציה, גן קידוד היפראקטיבי mariner הימי Himar1 C9 transposase (אדום) תחת שליטה של A. baumannii 17978 מקדם ספציפי (כחול), גן התנגדות ampicillin(בלה,כתום) ו RP4/oriT/oriR6K-מותנה מקור של שכפול (צהוב). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| התגובה | ההתקנה | תנאים |
| תגובת פולי-סי | 30 μL של gDNA גומה 2.5 μL של 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP 10 μL של 5X מסוף deoxynucleotidyl transferase (Tdt) מאגר תגובה 1.25 μL של rTdt 6.25 μL של מים עד 50 μL |
דגירה ב 37ºC במשך 1 שעה |
| PCR 1 | 23 μL 3'-פולי-C מטוהר DNA (דגימה שלמה מהצעד הקודם) 10 μL 10x באיכות גבוהה DNA פולימראז תגובה לערבב 2 μL 10 mm dNTPs 2 μL 50 m M MgSO4 1 μL 30 μM olj 510 ביוטין 3 μL 30 μM olj 376 0.5 μL פולימראז DNA באיכות גבוהה 8.5 μL מים טהורים עד 50 μL בסך הכל |
מחזור אחד: 2 דקות 94 ºC 15 מחזורים: 15 s 94 ºC 30 שניות 60 מעלות צלזיוס 2 דקות 68 ºC מחזור אחד: 4 דקות 68 ºC החזק: ∞ 4 ºC |
| PCR 2 | חרוזי DNA קשורים מהצעד הקודם 10 μL 10x באיכות גבוהה DNA פולימראז תגובה לערבב 2 μL 10 mM dNTP 2 μL 50 m M MgSO4 1 μL 30 μM olj 511 1 μL 30 μM פריימר ברקוד (טבלה 2) 0.5 μL פולימראז DNA באיכות גבוהה 33.5 μL מים טהורים עד 50 μL |
מחזור אחד: 2 דקות 94 ºC 15 מחזורים: 15 s 94 ºC 30 שניות 60 מעלות צלזיוס 2 דקות 68 ºC מחזור אחד: 4 דקות 68 ºC החזק: ∞ 4 ºC |
טבלה 1: כיוונון תגובה. התקנה ותנאים עבור תגובות poly-C, PCR 1 ו- PCR 2.
| מטרה | שם | רצף |
| נאל לטרנספון | olj510-ביוטין | ביוטין-גתט"ג'קטרקטקטקטג'ג |
| תותים לזנב פולי-סי | ליאור הנוי | ג'י.טי.ג'אגגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגטגט ג'י.ג'י.ג.ג.ג.ג.ג |
| מקוננים למתאם טרנספוסון + P5: אתר לכידה P5 – P5 אתר רצף– N5 –Tn |
ליאור הנוי | אתי אלון בן ה-50 צ'קטיאקאקג'אקג'טקטקטקטןNNNGGACTTA תקטקטגטאג |
| מקוננים olj376: P7 אתר רצף - ברקוד XXXXXX – P7 ללכוד אתר) |
לפנה ס ## | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגאגאגאגאגאסקסג'יגה ג'ורג'יה, 10000 דולר |
| ראה טבלה 2 לקבלת ברקודים ספציפיים*** |
טבלה 2: פריימרים להגדלת PCR. פריימרים להגדלת PCR המשמשים בפרוטוקול כדי להגביר את צמתים transposon. המטרה של כל אחד מהם מופיעה בעמודה הראשונה.
| תחל | לקרוא | ברקוד | רצף |
| לפני הספירה1 | ת.ק.ג. | ג'י.ג.ג.ת.ג | קאגאגאגאגאגאגקאטקאטגאטגאט גטגטגגטגט קאגאגאגהגטגטג |
| לפני הספירה 2 | צ'יגט (סוג של קה"ט) | קטיקטי | קאגאגאגאגאגאגאטקטאגאטאק דרג את ההתלבטה |
| לפני הספירה3 | TTAGGC | ג'י.סי.איי.אי | קאגאגאגאגאגאגקאטקאטגאגאט דרג את ההתלבטה |
| לפני הספירה4 | דרג את הים | ת.ג.יג.ת.ק. | קאגאגאגאגאגג'אגאגאגאגאט GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG |
| לפני הספירה5 | ליאור הנוי | ת.ק.ג.ט. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'אגה ג'יטג |
| לפני הספירה6 | ג'י.ק.א.א.א | ATTGGC (1000) | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגאטה דרג את ההתלבטה |
| לפני הספירה7 | קגטק (סוג) | גאטקטג (1000) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט גטגגטגטגטגטטגטגהגאגהגאגהGTG |
| ערך BC8 | דרג את המידע שאתה ה | ת.ק.ג.ט. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט תקצות טגטגאגאגהגאגהגאגהGTG |
| לפני הספירה9 | גאט קאג | CTGATC (סוג של ק"ג) | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגגה תקטגטגגגאגאט קאגאגאגהGTG |
| לפני הספירה 10 | תגקטט (תחח) | מיה רטה | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'ורג' מנוטרלת |
| לפני הספירה11 | ג'י.ג'י.טק | GTAGCC (CC) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט גטג'קגטגטגטגט קאגאגאגהGTG |
| לפני הספירה12 | CTTGTA (טה) | טאקאג (ת"א) | קאגאגאגאגאגג'אגאגאגאגאט מירברבה |
| לפני הספירה13 | ליאור הלל | TTGACT (TTGACT) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט דרג את ההתיי |
| לפני הספירה 14 | ליאור הלל | ג'י.ג.א.ק. | קאגאגאגאגאגאגקאטגאגאטג גאגאגאגאגהגאגהגטגטגטגטג |
| לפני הספירה 15 | ת.ג.ב.א. | דרג את ה | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגגה ג'י.טי.ג'י.טי. |
| לפני הספירה 16 | CCGTCC (CC) | ג'י.ג.ג.ג. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט גאגאגגטגטגטגטטגטגטגגאגאגאגהGTGTG |
| לפני הספירה 17 | גטאגג (100) | CTCTAC (1000) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט קרקטקטקטגאגאגאטקאגאגהגטגטג |
| לפני הספירה 18 | ג'י.טי.סי.ג'י | ג'י.ג'י.ג.ק. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'אגאגגטגגאגאט קאגאגאגאגג'ט ג'י.ג.ג.ג |
| לפני הספירה 19 | ג'י.טי.ג'י.איי | ת.ד.ט.ק.ק | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG |
| לפני הספירה 20 | ג'י.טי.ג'י.סי | ג'י.ג'י.סי.סי. | קאגאגאגאגאגאגקאטגאגאטג ג'אגגטגטגטגאגאגאגהגטגטג |
| לפני הספירה 21 | ג'י.טי.טי.ג'י | ק.ג.א.ק. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'אגה גאגאגאגאגאגהג'טGTG |
| לפני הספירה 22 | ת.ג.ק.ג. | ת.ג.ק.ג. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט CGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG |
| לפני הספירה 23 | גאג(גאג) | CCACTC (CCACTC) | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגאטאגאט קקטקטגאגאטטגאגאגאגאגהגטגטג |
| לפני הספירה 24 | ג'י.ג'י.ג.ק. | ג'י.סי.ת.ק. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט גלקטאקגגאגאגאגאגאגהג'טGTG |
| לפני הספירה 25 | אקטגט (סוג של 4 | ת.ק.ג. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט דרג את הנוף של הים |
| לפני הספירה 26 | דרג את ה | גלקטקט (GCTCAT) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'י.טי.ג'י.טי. |
| לפני הספירה 27 | ת.א.ק.ק.ק | ליאור הלל | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגאטה גאגאטגטגטגטגטטגגהגטגטגטג |
| לפני הספירה 28 | קאאג (1199) | CTTTTG (1000) | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגאטאגאט ג'י.טי.ג'י.טי. |
| לפני הספירה 29 | קאקטה (100) | טאגטג (תג)ג' | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט טאגטגגטגטגטגטטגטגגהגאגהגטגטג |
| לפני הספירה30 | קק"ג (1199) | CCGGTG (CCGGTG) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'י.סי.גגטגטגטגטטגאגאגהג'טגה |
| לפני הספירה39 | קטאטק (100) | ג'י.טי.ג.אי. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'יטגטגאטגטגט קאגאגאגהגטגטג |
| לפני הספירה 40 | ק.ט.ק.גה | דרג את ה | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט דרג את ההתיי |
| לפני הספירה 42 | טאטא-ג'י | צ'אגטה (CGATTA) | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגאטאגאט גטגטגגגגאגהטגגאגאגהגטגטגטג |
| לפני הספירה 43 | טאקאק"ג | ג'י.פי.ג'י.ג'י. | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'יטגטגגאגאגאט קאגאגאגאגג'ט ג'י.ג.ג. |
| לפני הספירה 44 | טאטאט (תיאט) | אתא (אטה) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט דרג את הנוף של הים |
| לפני הספירה 45 | ת.ק.ט. | גאטגה (100) | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט גאטגטגטגטגטגטטגטגטגגאגהגאגהGTG |
| לפני הספירה 46 | TCCCGA (1999) | תכלית משולבת עם 300 00 | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'אגגאגגאגאגאגהגאגהגטגטג |
| לפני הספירה 47 | תכלית משולבת עם נוף של הים | CTTCGA (1000) | קאגאגאגאגאגאגאגאגאגאטאגאט תק"ט גגטגטגטגאגהגטגטג |
| לפני הספירה 48 | תכלית משולבת עם 300 00 | דרג את ה | קאגאגאגאגאגאטקטאגאט ג'י.טי.ג'י. |
טבלה 3: פריימרים ברקוד. פריימרים ברקוד משמשים בשלב PCR השני כדי להגביר את צמתים transposon תוך הוספת אתר רצף P7 וברקודים לאפליקון. לא כל פריימרים ברקוד נדרשים כדי ליצור ספרייה. נדרשים רק פריימרים ברקוד עבור מספר הדגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
א. באומאני מהווה איום עולה על בריאות הציבור העולמית בשל הרכישה המהירה של AMR מול טיפולי "השורה האחרונה", כגון colistin10,11,12,,23,24,30,31. בעשורים האחרונים, Tn-seq שיחק תפקיד קריטי בהדרת אינטראקציות גנוטיפ-פנוטיפ על פני מינים חיידקיים רבים והרחבת ההבנה שלנו שלגנטיקה חיידקית 34,35,42,43. פרוטוקולי Tn-seq היו אינסטרומנטליים בזיהוי גנים חיוניים מינים חיידקיים מגוונים כגון קמפילובקטר jejuni, Staphylococcus aureus, פתוגן חניכיים פורפירומונס gingivalis, ואפילו שחפת Mycobacterium37,49,50,51. מעבר לזיהוי של גנים חיוניים, Tn-seq שימש לזיהוי גנים עמידות לאנטיביוטיקה ב פסאודומונס aeruginosa, מספר גנים חיוניים מותנה בפילפילמונלה typhimurium, ומערכות יחסים גנוטיפ-פנוטיפ רבים ב דלקת ריאות סטרפטוקוקוס Streptococcus pneumoniae52,53,54. לאחרונה, רצף transposon של Vibrio כולרה הועסק במודל ארנב התינוק של כולרה כדי לזהות גנים חשובים בכושר vivo במהלך זיהום 47. מחקרים אלה מדגימים את הרב-תכליתיות של Tn-seq כפי שהוא יכול להיות מנוצל הן במבחנה והן במחקרי vivo.
היתרון העיקרי של Tn-seq על פני שיטות אחרות, כגון טכנולוגיות מיקרו-מערך, אלקטרופורזה ג'ל דו-מימד ו- qPCR, הוא שזה לא דורש ידע מוקדם של הגנום או מידע גנומי55. לכן, מוטגנזה transposon בשילוב עם רצף מקביל מסיבי מאפשר את המחקר של גנים ידועים וגנומים, כמו גם גילוי של אינטראקציות גנטיות חדשניות. כאן הצגנו שיטה מקיפה ליצירת ספריית מוטציה טרנספוסון צפופה מאוד ב- Baumannii כדי לזהות גורמים החיוניים לכושר חיידקי כאשר הם נחשפים לריכוזי תת-ביטוריה של קוליסטין. השיטה המתוארת שימשה בהצלחה גם E. coli (נתונים שלא פורסם), מדגים את המערכת היא נוחה לבצע ניתוח Tn-seq בפתוגנים גראם שליליים אחרים, כולל Enterobacteriaceae.
שימוש טרנספוסון ימית עבור mutagenesis החדרה יש מספר יתרונות. משפחת transposon מקורו מארחים אאוקריוטיים שימשו נרחב כדי ליצור ספריות מוטנטים רוויים באוכלוסיות חיידקים מגוונות. טרנספוסון מארינר הם מארחים עצמאיים, מה שאומר שניתן להשיג הוספות אקראיות יציבות בהיעדר גורמים מארחיםספציפיים 40,41. בנוסף, לטרנספוסון הימי יש מספר מוגדר של אירועי הכנסה מכיוון שהם מעדיפים להכניס למוטיבים של תימין-אדנין ("ת"א",), מה שמפחית הטיה הכנסה ומוביל לניתוח סטטיסטי חזקיותר 37,56,57,58.
מספר שיטותמבוססות יינר Tn-seq להשתמש בעיכול הגבלת MmeI עבור פיצול gDNA32,42,43. בעוד פיצול DNA אנזימטי היא שיטה פופולרית ומוצלחת, זה מוסיף צעדים מיותרים להליך ומגביר הטיה פוטנציאלית37. לא רק טכניקות אלה דורשות כמויות גדולות של חומרי התחלה, הם גם יכולים להוביל לייצוג לא שוויוני של רצפי הכנסה בניתוחיםבמורד הזרם 37,59. כמו כמה שיטות אחרות שלא מסתמכות על פעילות גרעין MmeI 52,60,61, השיטה המתוארת בזאת מסתמכת על גיזה מכנית כדי שבר gDNA, ו TdT כדי להוסיף זנב פולי-C לסוף 3 ' של שברי ה-DNA. בהשוואה לפיצול DNA אנזימטי ושיטות קשירה מתאם, גישה זו דורשת כמויות קטנות יותר באופן משמעותי של ה-DNA מתחיל תוך מתן תוצאות עקביות יותר, זה גם מפחית את הסיכון של זיהום צולב DNA ומפחית אובדן מדגם עקב כליאהבצינור אטום 37,59,62. יתר על כן, שיטה זו מניבה ארוך יותר, רצף באיכות גבוהה קורא של 50 נוקלאוטידים המסייעים מיפוי יעיל ומדויק יותר של רצפים וניתוח במורד הזרם חזק יותר37,59. התוספת של זנב פולי-C סינתטי מתעלם overhangs פוטנציאליים שעשויים לנבוע פיצול כמו שיטה זו מסתמכת על זנב פולי-C שנוסף אקסוגני כאתר זיהוי עבור פריימר הפוך, אשר מכיל 16 נוקלאוטידים dG בקצה 3' שלה ורצף ספציפי לרצף הדור הבא (למשל, רצף אילומינה) בקצה 5' , לסינתזהראשונית 47,59. השימוש בזנב נוקלאוטיד סינתטי מרחיב את היישום של שיטה זו לגנומים רבים ונפרדים ללא תלות בתוכן המקורי שלהם59. לאחר מכן, צמתים טרנספוסון-גנום מוגברים באמצעות פריימר ספציפי poly-C37. חלופה זו מפשטת את ההליך על-ידי ביטול הצורך באנזימי הגבלה יקרים, קשירה של מתאם, היווצרות של דימרים מתאם וצעדי טיהור ג'ל. יש לנו עוד אופטימיזציה הפרוטוקול כדי ליצור ביעילות ספריות הכנסה transposon רווי מאוד במספר פתוגנים ESKAPE גראם שלילי, כולל Acinetobacter baumannii, ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד אינטראקציות גנטיות תחת מגוון במבחנה ובתנאי vivo 10.
מגבלה אחת של Tn mutagenesis היא שהיא מסתמכת על סמני עמידות לאנטיביוטיקה לבחירה. עם זאת, פתוגנים ESKAPE גראם שלילי רבים הם multidrug או עמידים לתרופות בהרחבה, כלומר המשתמש ייתכן שיהיה צורך להחליף את קלטת ההתנגדות על פי פתוגן ספציפי של עניין. יתר על כן, כמה מבודדים קליניים אינם ניתנים לטרנספוסון מוטאגנזה באמצעות טרנספוסון מבוסס יינר.
שלב קריטי של הפרוטוקול הוא חישוב מספר המוטנטים Tn לצלחת. ציפוי מושבות רבות מדי יגרום מדשאה שיכול לסבך ניתוח במורד הזרם. אם המושבות קרובות מדי או נוגעות ללב, הן יכולות להוסיף לחץ סלקטיבי לא רצוי על הספרייה שיכול לגרום לחפצים. באופן אידיאלי, מושבות לא יהיו נוגעות במים ומנופחות באופן שווה על פני הצלחת, כפי שהוכח(איור 2A). לעומת זאת, אם מעט מדי מושבות מצופה, זה יהיה קשה לבודד הוספות TN מרובות בכל גן.
חשוב גם לבצע את הפקדים המפורטים בשלב 2.18. כאמור בסעיף 3. 2, לא "תורם" או "נמען" זן צריך לגדול על צלחות בתוספת אאמפצילין. מאז DAP exogenous נדרש לצמיחה של זן "התורם", כל צמיחה תצביע על "הנמען" זן משכפל pJNW684. זוהי בעיה משמעותית, כי אם transposon אינו משתלב gDNA, רצף קורא רק למפות plasmid, לא אתר שילוב. במקרה זה הניסוי כנראה לא יניב נתונים שף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכון הלאומי לבריאות (גרנט AI146829 לג'יי.אם.בי) והיא מוכרת בהכרת תודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate | Affymetrix | 77112 | |
| 100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate | Invitrogen | 10217-016 | |
| 100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker | Promega | PR-G2101 | |
| 100mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351029 | |
| 150mm x 15mm Petri Dishes | Corning | 351058 | |
| 1X B&W | N/A | N/A | Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W. |
| 2,6-Diaminopimelic acid | Alfa Aesar | B2239103 | used at 600 µM |
| 2X B&W | N/A | N/A | Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| 50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP | N/A | N/A | 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C. |
| AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 12344 | |
| Acinetobacter baumannii ATCC 17978 | ATCC | N/A | AmpS, KanS |
| Ampicillin (100 mg/L) | Fisher Scientific | BP1760 | used at 100 mg/L |
| AMPure XP PCR purification system | BECKMAN COULTER | A63881 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939B | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis | Agilent | 5067-4626 | |
| Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) | New England Biolabs (NEB) | N0447L | |
| DynaMag-2 Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | |
| E.coli MFD Dap- | N/A | N/A | DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36). |
| Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | |
| Externally Threaded Cryogenic Vials | Corning | 09-761-71 | |
| Glass beads | Corning | 72684 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-602 | Scraping tool |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | used at 25 mg/L |
| LB agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426 | |
| LoTE | N/A | N/A | Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature. |
| Lysis buffer | N/A | N/A | 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL) |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) | Fisher Scientific | BP1752I | |
| Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher Scientific | BP39920 | Diluted to 1X |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33238 | |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| Sonicator with refridgerated waterbath | Qsonica Sonicators | Q2000FCE | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs (NEB) | S1420S | |
| TE buffer | N/A | N/A | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0) |
| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) | Promega | PR-M1875 |
References
- Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
- Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
- Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
- Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
- Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
- Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
- Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
- Raetz, C. R. H., Whitfield, C.
- Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
- Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
- Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
- Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
- Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
- Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
- Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
- Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
- Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
- Benedict, R. G., Langlykke, A. F.
- Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
- Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
- Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
- Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
- Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
- Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
- Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
- Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
- Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
- Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
- Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
- Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
- Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
- Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
- Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
- Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
- Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
- Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
- Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
- Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
- Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
- Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
- Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
- Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
- Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
- Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
- Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
- Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
- Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
- Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
- Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
- van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
- Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
- Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
- Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
- Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
- Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).
