Summary
Este protocolo proporciona métodos para la visualización de células bacterianas y polisacáridos del locus de síntesis de polisacáridos (Psl) dentro del esputo de pacientes con fibrosis quística.
Abstract
La detección temprana y la erradicación de Pseudomonas aeruginosa en los pulmones de los pacientes con fibrosis quística pueden reducir la posibilidad de desarrollar una infección crónica. El desarrollo de infecciones crónicas por P. aeruginosa se asocia con una disminución de la función pulmonar y un aumento de la morbilidad. Por lo tanto, existe un gran interés en dilucidar las razones del fracaso en la erradicación de P. aeruginosa con terapia antibiótica que ocurre en aproximadamente el 10-40% de los pacientes pediátricos. Uno de los muchos factores que pueden afectar la eliminación del huésped de P. aeruginosa y la susceptibilidad a los antibióticos son las variaciones en la organización espacial (como la agregación o la formación de biopelículas) y la producción de polisacáridos. Por lo tanto, nos interesaba visualizar las características in situ de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con FQ. Se aplicó una técnica de limpieza de tejidos a las muestras de esputo después de incrustar las muestras en una matriz de hidrogel para retener las estructuras 3D relativas a las células huésped. Después de la limpieza del tejido, se agregaron etiquetas fluorescentes y colorantes para permitir la visualización. Se realizó hibridación fluorescente in situ para la visualización de células bacterianas, unión de anticuerpos anti-Psl marcados con fluorescencia para la visualización del exopolisacárido y tinción de DAPI para teñir las células huésped para obtener información estructural. Estos métodos permitieron obtener imágenes de alta resolución de P. aeruginosa dentro del esputo de pacientes con FQ mediante microscopía de barrido láser confocal.
Introduction
En este estudio, se diseñaron experimentos para visualizar la estructura in vivo de Pseudomonas aeruginosa dentro del esputo de pacientes pediátricos con fibrosis quística (FQ). Las infecciones por P. aeruginosa se vuelven crónicas en el 30-40% de la población pediátrica con FQ; Una vez que las infecciones crónicas se establecen, son casi imposibles de eliminar1. Los aislados de P. aeruginosa de pacientes con infección temprana son generalmente más susceptibles a los antimicrobianos, por lo tanto, estos se tratan con antibióticos antipseudomonales para prevenir el establecimiento de infección crónica2. Desafortunadamente, no todos los aislados de P. aeruginosa se eliminan eficazmente del pulmón después de la terapia con antibióticos. Los mecanismos precisos asociados con el fracaso de los antibióticos no se han dilucidado por completo. Estudios previos han demostrado que las variaciones en la densidad celular de la biopelícula, la agregación y la producción de polisacáridos puedenafectar la eficacia de los antibióticos. P. aeruginosa produce tres polisacáridos extracelulares: Pel, Psl y alginato4. La mayoría de las cepas de P. aeruginosa tienen la capacidad genética de expresar cada uno de los exopolisacáridos, aunque a menudo un tipo de polisacárido se expresa predominantemente5. El alginato de exopolisacárido se asocia con infecciones crónicas en el pulmón de FQ, lo que resulta en un fenotipo mucoide 6,7. Los polisacáridos Pel y Psl tienen múltiples funciones, entre ellas ayudar a la unión inicial y al mantenimiento de la estructura de la biopelícula, y conferir resistencia a los antibióticos8.
Se han desarrollado métodos dirigidos a visualizar in vivo las estructuras de los tejidos para una variedad de tipos de muestras 9,10,11. Más recientemente, se han adaptado para visualizar las comunidades microbianas in vivo dentro del esputo de pacientes con FQ12. La optimización de un protocolo de limpieza de tejidos específicamente para la identificación de comunidades microbianas dentro del esputo fue desarrollada por DePas et al., 201612. El término MiPACT, que significa identificación microbial idespués de la tecnología de la LERA de Pa sive,se acuñó para la eliminación del esputo de FQ 11,12. En el caso de las técnicas de limpieza de tejidos, las muestras se fijan primero y luego se vuelven transparentes, dejando intacta su arquitectura inherente para la tinción y la visualización microscópica11. La fijación y eliminación de muestras de esputo de FQ permite a los investigadores responder preguntas relacionadas con la estructura de la biopelícula, la densidad celular bacteriana, las asociaciones polimicrobianas y las asociaciones entre patógenos y células huésped. La ventaja de examinar directamente las bacterias que se han conservado dentro del esputo es que pueden analizarse y visualizarse en un contexto específico del huésped. Aunque el crecimiento in vitro de aislados clínicos en el laboratorio para la experimentación puede ser muy informativo, estos métodos no pueden recrear completamente el entorno pulmonar de la FQ, lo que resulta en una desconexión entre los resultados de laboratorio y los resultados de los pacientes.
Los métodos presentados aquí se pueden utilizar para fijar y eliminar el esputo para visualizar las bacterias, ya sea de pacientes con FQ o pacientes con otras infecciones respiratorias. El tipo específico de tinción y análisis microscópico descrito en este documento es la hibridación fluorescente in situ (FISH), seguida de la unión anti-Psl-anticuerpo dentro del hidrogel y el análisis posterior mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Después de la limpieza de tejidos, también se pueden aplicar otros métodos de inmunohistoquímica y microscopía.
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Protocol
Se requiere la aprobación de la Junta de Ética en Investigación (REB, por sus siglas en inglés) para recolectar y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Los estudios presentados en este documento fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB#1000058579.
1. Recolección de esputo
- Almacenar el esputo expectorado en un recipiente de recogida estéril y conservar inmediatamente a 4 °C durante un máximo de 24 h antes de la fijación.
NOTA: Dejar el esputo demasiado tiempo a 4 °C sin fijación puede provocar la degradación celular, en particular la degradación de los glóbulos blancos. Es preferible la fijación lo antes posible. - Transfiera las muestras de esputo a un tubo estéril de 15 ml.
- Agregue un volumen igual de paraformaldehído (PFA) al 4% a las muestras de esputo. Por ejemplo, si la muestra de esputo es de 0,5 ml, agregue 0,5 ml de PFA al 4 %. Mezclar mediante una inversión suave.
- Incubar el esputo durante la noche a 4 °C.
- Lave la muestra añadiendo 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada 2 ml de esputo fijo.
NOTA: No se requiere centrifugación para este paso de lavado. - Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
NOTA: Evite succionar el esputo con la pipeta apuntando la punta en dirección opuesta al esputo y aspire muy lentamente el líquido de la superficie. La etapa de lavado no implica centrifugación para no alterar la integridad estructural de los tapones de esputo. - Repita los pasos 1.6 y 1.7 dos veces más.
- Vuelva a suspender el gránulo en 2 veces el volumen de PBS con azida sódica al 0,01 % (p/v).
- Almacenar el esputo a 4 °C.
2. Procesamiento de esputo MiPACT (técnica de limpieza de tejidos)
- Desgasificar los componentes del hidrogel (30% acrilamida 29:1:bis-acrilamida, endurecedor y PBS) en un recipiente sellado que contenga un paquete anaeróbico previamente durante 72 h.
NOTA: El paquete anaeróbico y el recipiente sellado son necesarios porque el oxígeno inhibe la polimerización de la acrilamida. Alternativamente, el oxígeno se puede eliminar realizando este paso en una campana anaeróbica, aplicando un vacío a un recipiente sellado o burbujeando gas N2 a través de la mezcla de acrilamida.- Agregue 2 ml de una solución de acrilamida:bis-acrilamida al 30% 29:1 a un tubo de 15 ml sin la tapa dentro del recipiente anaeróbico sellado.
- Haga una caldo concentrado de endurecedor al 10% (p/v) añadiendo 0,5 g de endurecedor a 5 ml de PBS en un tubo de 15 ml. Deje la tapa fuera del tubo y guárdela en el recipiente anaeróbico sellado.
- Deje unos pocos ml de PBS estéril en un tubo, sin tapa, dentro del recipiente anaeróbico.
- Preparar 5 ml de solución de hidrogel con una concentración final de endurecedor al 0,2 % y acrilamida 29:1 al 4 % en PBS en un tubo de 15 ml. Mezclar por inversión y esterilizar con filtro.
- Retire las muestras de esputo de la nevera y córtelas en pequeñas secciones (de aproximadamente 5 mm de diámetro) en condiciones estériles con un bisturí.
NOTA: Si el esputo es bastante fluido, este paso aún se puede realizar, sin embargo, se necesita más paciencia y práctica para eliminar el esputo de la solución de almacenamiento con pinzas antes de usar el bisturí para separar las fracciones deseadas. - Coloque las muestras de esputo cortadas dentro de un pocillo de un portaobjetos de cubreobjetos de 8 cámaras.
- Añadir 300 μL de solución de hidrogel esterilizada con filtro del paso 2.2 a cada uno de los pocillos que contengan esputo.
- Coloque el cubreobjetos de 8 cámaras dentro de un recipiente sellado que contenga un paquete anaeróbico durante 3 h a 37 °C.
NOTA: Una vez polimerizado, el hidrogel con esputo incrustado debe tener la consistencia de un gel firme. - Transfiera las muestras de esputo de hidrogel solidificado a un tubo de cultivo de 15 ml que contenga 5 ml de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 8 %, pH 8, y deje que las muestras se aclaren durante 3-14 días a 37 °C (con o sin agitación), hasta que el esputo se vuelva transparente.
NOTA: Los tiempos de aclaramiento dependen de la composición del esputo y, por lo general, pueden disminuirse con agitación. Sin embargo, tenga cuidado de no aumentar la velocidad de agitación hasta el punto de interrumpir la integridad de la muestra. Las muestras más ricas en ADN tardan más en aclararse en comparación con las muestras ricas en moco. - Decantar la solución SDS al 8% en un contenedor de recogida de residuos. Con pinzas estériles, transfiera cada muestra incluida en hidrogel a un tubo cónico estéril de 50 ml. Agregue 10 ml de PBS a cada uno de los tubos cónicos de 50 ml para lavar los hidrogeles y deje reposar la solución durante 30 minutos a 1 hora antes de decantar. Repita esto 2 veces más.
NOTA: Este paso de lavado no implica centrifugación. El exceso de líquido y sobrenadante se elimina cuidadosamente con una pipeta. - Almacenar las muestras lavadas en PBS con azida sódica al 0,01% (p/v) y 1x inhibidor de la RNasa a 4 °C.
3. Protocolo de hibridación in situ fluorescente de hidrogel (FISH)
- Retire las muestras de hidrogel de su solución de almacenamiento con pinzas estériles y coloque las muestras sobre una superficie estéril (como un portaobjetos de vidrio o una placa de Petri).
- Con un bisturí estéril, corte los hidrogeles en rodajas de ~ 1 mm de grosor.
- Coloque las secciones de hidrogel de 1 mm dentro de tubos estériles de 1,5 ml.
- Preparar 1 mL del tampón de hibridación (25% formamida, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, H2O purificado y desionizado) en un tubo de 1,5 mL.
- Agregue la sonda PseaerA marcada con fluorescencia (150.7 nM12) al tampón de hibridación y mezcle por inversión.
NOTA: La solución de formalina debe mantenerse alejada de una llama abierta. El tampón de hibridación puede prepararse en avanzado y almacenarse en alícuotas a -20 °C13. - Agregue 200-500 μL de tampón de hibridación a cada sección de ~ 1 mm de hidrogel y asegúrese de que la totalidad de la muestra de hidrogel esté sumergida.
- Deje que la sonda PseaerA se hibrida con las muestras de hidrogel colocándolas en la oscuridad durante ~ 18-24 h, a 46 °C, sin agitar.
- Decantar el tampón de hibridación en un contenedor de recogida de residuos.
- Enjuague las muestras una vez con tampón de lavado esterilizado por filtro (337,5 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) [pH 7,2], 0,01 % de SDS y H2O purificado y desionizado) añadiendo 1 ml de tampón de lavado a cada uno de los tubos de 1,5 ml y luego retírelo.
NOTA: El tampón de lavado se puede hacer con anticipación y almacenar a temperatura ambiente (RT). - Añadir 1 ml de tampón de lavado fresco a los tubos, luego incubar las muestras en la oscuridad durante 6 h a 48 °C, sin agitar.
4. Unión de hidrogel y anticuerpos Psl0096
- Retire estérilmente el tampón de lavado con una pipeta de 1 ml.
- Enjuague las muestras con un BSA al 2% (p/v) en una solución de PBS agregando y quitando 1 ml de la solución de BSA al 2%.
- Añadir 500 μL de la solución BSA/PBS al 2% a las muestras de hidrogel para bloquear la unión a proteínas no específicas. A continuación, incubar las muestras durante la noche, en la oscuridad, a RT, sin agitar.
- Retire estérilmente la solución de bloqueo con una pipeta de 1 ml.
- Prepare la solución de anticuerpos Psl0096-Texas Red diluyendo el anticuerpo hasta una concentración final de 0,112 μg/ml en 500 μl de BSA/PBS fresco al 2%.
- Añadir la solución de anticuerpos de 500 μL a las muestras de hidrogel e incubarlas a RT durante 6 h, protegidas de la luz, sin agitar.
5. Tinción con DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenilindol)
- Prepare la solución de adaptación del índice de refracción (RIMS) añadiendo 40 g de medio de gradiente de densidad no iónico, 30 μl de Tween20, 3 μg de azida sódica y 30 ml de PBS a un matraz que contenga una barra de agitación magnética. Revuelva la solución durante 15 minutos en un agitador magnético o hasta que se disuelva por completo.
- Filtrar: esterilizar la solución en un tubo cónico de 50 ml con una jeringa de 10 ml y un filtro estéril de 0,2 μm.
NOTA: La solución puede almacenarse a 4 °C durante varios meses. - Retire la solución de anticuerpos Psl0096-Texas Red con una pipeta estéril de 1 ml.
- Enjuague las muestras de hidrogel agregando y luego retirando 1 ml de PBS.
- Incubar las muestras de hidrogel con 250 μL de solución RIMS y 10 μg/mL de DAPI a RT con agitación suave, en la oscuridad, durante la noche.
- Antes de la obtención de imágenes confocal, monte las muestras en cámaras de perfusión de 0,9 mm o 1,7 mm y séllelas con un cubreobjetos de vidrio.
NOTA: Después de la FISH y/o inmunohistoquímica y antes de la inmersión en RIMS, se pueden aplicar tinciones de lectina fluorescente si se desea la visualización de la mucosa del esputo12.
6. Imágenes
- Realice imágenes de microscopía de escaneo láser confocal utilizando técnicas estándar con aumentos de 25x, 40x, 63x o 100x.
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Representative Results
El diseño general del experimento se resume en la Figura 1 y la Figura 2. La Figura 1 proporciona un resumen de los protocolos de procesamiento y eliminación del esputo. El procesamiento y la eliminación del esputo pueden tardar hasta 17 días. Sin embargo, el protocolo puede detenerse y las muestras se pueden almacenar después de la fijación con PFA (día 2) o después de la limpieza del tejido (días 5-17 dependiendo del tiempo de limpieza). En la Figura 2, se resumen los protocolos de unión a FISH y anticuerpos. Los protocolos de tinción de FISH y anticuerpos tardan 4 días en completarse, pero deben completarse y tomarse imágenes confocales una vez iniciados. Utilizando los protocolos anteriores, se pueden obtener imágenes 3D de alta resolución de células de P. aeruginosa con su estructura in-situ dentro del esputo visualizada.
La eliminación del esputo y la posterior aplicación de las tinciones fluorescentes utilizadas en este protocolo permite una visualización detallada de P. aeruginosa dentro de las muestras. Las muestras de esputo que se muestran en la Figura 3 y la Figura 4 se recogieron de un paciente pediátrico con FQ (17 años) con una infección por P. aeruginosa de nueva aparición. En la Figura 3A, se observó un agregado de células dentro de una muestra de esputo; La aparición de bastones de color verde amarillento se debió a la superposición de los tres fluoróforos. Aunque no tenemos recuentos celulares para esta muestra de esputo, encontramos que el límite de detección de la sonda es de 10a 4 células/ml (ver Figura suplementaria 1). En la Figura 3B, las formas individuales de los bastones se observaron en verde a partir de la unión específica de la especie de la sonda PseaerA-488 a las células de P. aeruginosa. El anticuerpo Psl0096-Texas Red que se ve en rojo ilustra dónde se encontraba el exopolisacárido pseudomonal dentro del esputo; en este caso, el anticuerpo Psl0096 parecía superponerse principalmente con las células de P. aeruginosa (Figura 3C). Este método también permitió la visualización de células pseudomonales dentro del esputo en relación con otras células bacterianas y estructuras del huésped. En la Figura 4, se observó un grupo de células de P. aeruginosa fagocitadas dentro de una célula eucariota y se observaron otros pequeños grupos de células cócicas en las cercanías. Se ha demostrado que el anticuerpo Psl0096 también puede unirse a Psl producido a partir de P. aeruginosa planctónica (ver Figura suplementaria 2).
Figura 1: Diagrama de flujo que ilustra el procesamiento del esputo y los protocolos MiPACT.
En resumen, el esputo se fija antes de ser incluido en una solución de poliacrilamida. Una vez aclarado, el hidrogel puede almacenarse a 4 °C o utilizarse con el protocolo de unión a anticuerpos y FISH. Esta imagen fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diagrama de flujo que indica los protocolos de hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos.
Una vez que el esputo se ha eliminado completamente dentro de la matriz de hidrogel, se pueden aplicar métodos de tinción. Esta imagen fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen de inmunofluorescencia de una muestra de esputo recogida de un paciente con una infección temprana por P. aeruginosa incrustada en una matriz de hidrogel.
La muestra de hidrogel se hibridó con una sonda PsearA-Alexa488 (verde), un anticuerpo Psl0096-Texas Red (rojo) y DAPI (azul). (A) muestra de esputo vista bajo los 3 canales, (B) esputo debajo del canal verde que indica dónde se unió la sonda PseaerA-488, y (C) esputo debajo del canal rojo donde se produjo la unión roja Psl0096-Texas. Las imágenes se tomaron con un aumento de 100x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen de inmunofluorescencia de una muestra de esputo recogida de un paciente con una infección temprana por P. aeruginosa incrustada en una matriz de hidrogel.
La muestra de hidrogel se hibridó con una sonda PsearA-Alexa488 (verde), un anticuerpo Psl0096-Texas Red (rojo) y DAPI (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Hibridación fluorescente in situ de un cultivo planctónico de PAO1 con la sonda PseaerA-488. Haga clic aquí para descargar esta figura.
Figura suplementaria 2: P. aeruginosa teñida con DAPI y el anticuerpo Psl0096-Texas Red. (A) cepa PAO1-Δpsl, y (B) cepa PAO1. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
El propósito de este protocolo es permitir vislumbrar la organización in situ de las células de P. aeruginosa en el esputo de pacientes con FQ. Las muestras de esputo deben almacenarse a 4 °C hasta que se procesen si no pueden fijarse inmediatamente. Se ha demostrado que el número de células de P. aeruginosa en el esputo no cambia significativamente si se procesa a 1 h, 24 h o 48 h, cuando se almacena a 4 °C, aunque si se deja a 25 °C durante 24 o 48 h, los recuentos de células bacterianas aumentarán significativamente como resultado del crecimiento bacteriano14. Para este estudio, las muestras de esputo se almacenaron a 4 °C hasta un máximo de 24 h después de la expectoración. Cabe señalar que se ha demostrado que los recuentos de células inflamatorias disminuyen en el esputo si se dejan a 4 °C y se procesan más de 9 h después15. Por lo tanto, es importante tener en cuenta las células y marcadores específicos que se desean visualizar en el esputo a la hora de decidir el tiempo límite para el procesamiento de las muestras.
El procesamiento de muestras en este método comienza con la fijación de muestras de esputo en PFA al 4 %. El paraformaldehído entrecruzará las células bacterianas y su matriz extracelular, preservando sus estructuras para la visualización y análisis microscópico11,16. Desafortunadamente, si el objetivo es obtener el recuento total de células en ciertas células inflamatorias en el esputo, se ha demostrado que el PFA disminuye los recuentos de estas células, por lo que se deben considerar otros fijadores17. Otra limitación de este estudio es que puede llevar mucho tiempo y puede tardar más de dos semanas en realizarse. Por lo tanto, puede no ser adecuado para el desarrollo de un método de diagnóstico que requiera decisiones de tratamiento sensibles al tiempo. Además, para comprender la diversidad microbiana total dentro de las muestras de esputo, este método no sería adecuado, pero podría combinarse con otros métodos de detección microbiana de alto rendimiento, como la qPCR.
La composición del hidrogel de acrilamida puede verse alterada según el tipo de tejido y la aplicación11. Para muestras inestables como el esputo de FQ, es necesario proporcionar soporte estructural con una mezcla de acrilamida:bis-acrilamida 29:1 (en lugar de solo acrilamida). La inclusión de paraformaldehído en el hidrogel puede estabilizar aún más la estructura, con la compensación de tiempos de incubación más largos para permitir la difusión de sondas y anticuerpos9. La adición de formaldehído al hidrogel también puede prevenir la hinchazón del tejido durante el proceso de limpieza si ese efecto es indeseable.
El método actual se dirige específicamente a las células de P. aeruginosa dentro del esputo de los pacientes con FQ. Se pueden considerar métodos alternativos y modificaciones a este protocolo para guiar la optimización de la visualización de otras bacterias. Mediante la aplicación de sondas FISH y de reacción en cadena de hibridación (HCR) específicas de especies y géneros, se pueden identificar otros patógenos de FQ como Staphylococcus aureus, Streptococcus sp. y Achromobacter xylosoxidans 12. En nuestro estudio, nos centramos en el exopolisacárido pseudomonal Psl. Otras dianas, como el alginato o el Pel, pueden examinarse con anticuerpos fluorescentes específicos para estos exopolisacáridos en futuros experimentos. La aplicación del método MiPACT junto con la tinción de FISH y anticuerpos para CLSM tarda un par de semanas en completarse. Si la pregunta de investigación no se refiere a la visualización espacial tridimensional del esputo, existen métodos más rápidos para visualizar las bacterias presentes. Los métodos anteriores utilizados para visualizar las bacterias dentro de las muestras de esputo utilizan cortes finos o frotis e incluyen: FISH18, tinción de Gram y técnicas de inmunohistoquímica que aplican anticuerpos primarios y contratinciones para permitir la visualización de exopolisacáridos de biopelícula y células bacterianas 19,20.
Existen varias aplicaciones futuras potenciales de este tipo de técnicas de imagen. La capacidad de visualizar diferentes organismos bacterianos y su interacción con las células huésped, como los fagocitos, puede ampliar nuestra comprensión de por qué algunas cepas de P. aeruginosa se eliminan efectivamente de las vías respiratorias de la FQ mientras que otras cepas no lo hacen. La obtención de imágenes de bacterias dentro de muestras respiratorias también puede utilizarse como medida de la eficacia antimicrobiana y como resultado de un estudio para nuevos fármacos antibiofilm21. Además, visualizar la relación espacial entre P. aeruginosa y otros organismos dentro del microbioma pulmonar de la FQ, como Staphylococcus aureus, puede ayudar a dilucidar el papel de la coinfección/colonización en la patogénesis de las exacerbaciones pulmonares y su respuesta al tratamiento con antibióticos. Las imágenes in vivo de bacterias también se pueden aplicar a otras infecciones, incluidas aquellas con neumonías asociadas a la ventilación mecánica o infecciones crónicas de heridas22. Por lo tanto, los conocimientos adquiridos pueden utilizarse para guiar el desarrollo terapéutico futuro.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Fundación de Fibrosis Quística que proporcionó fondos para esta investigación y a MedImmune por su generosa donación de anticuerpos anti-Psl0096. Para este estudio, las imágenes se realizaron en el centro de imágenes CAMiLoD de la Universidad de Toronto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell perfusion chambers | Electron Microscopry Sciences | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Order Details: Product: Modified DNA Oligo; Name: PseaerA; Sequence: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthesis: 50 nmol; Purification: HPLC; Ship state: Full yield (dry) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | The Psl0096-Texas red antibodies were a gift kindly provided by Medimmune and the company should be contacted for order inquiries. | |
| VA-044 Hardener | Wako | 27776-21-21 |
References
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Billings, N., et al. The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526 (2013).
- Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl. Frontiers in Microbiology. 2, 167 (2011).
- Yang, L., et al. Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).
- Wozniak, D. J., et al. Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).
- Baker, P., et al. Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- DePas, W. H., et al. Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling. mBio. 7 (5), 1-11 (2016).
- Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: www.molecularinstruments.com 1-6 (2019).
- Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis. Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).
- Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. Induced sputum: Time from expectoration to processing. European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).
- Chao, Y., Zhang, T. Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy. Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).
- St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).
- Hogardt, M., et al. Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).
- Hoffmann, N., et al. Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis. Infection and Immunity. 73 (8), 5290 (2005).
- Nair, B., et al. Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples. Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).
- Howlin, R. P., et al. Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis. Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).
- Pestrak, M. J., et al. Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234 (2019).
