Summary
Presentiamo qui un metodo che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.
Abstract
Il fenotipo cellulare può essere invertito o modificato con metodi diversi, con vantaggi e limitazioni specifici per ogni tecnica. Qui descriviamo una nuova strategia che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Sono necessari due passaggi principali. Nella prima fase, le cellule adulte mature (differenziate terminalmente) sono esposte alla gomma epigenetica 5-aza-citidina per guidarle in uno stato pluripotente. Questa parte del protocollo è stata sviluppata, basata sulla crescente comprensione dei meccanismi epigenetici che controllano il destino e la differenziazione cellulare, e prevede l'uso del modificatore epigenetico per cancellare lo stato differenziato cellulare e quindi guidare in una finestra transitoria ad alta plasticità.
Nella seconda fase, le cellule cancellate sono incapsulate in micro-bioreattori di politetrafluoroetilene (PTFE), noti anche come marmi liquidi, per promuovere il riarrangiamento cellulare 3D per estendere e mantenere stabilmente l'elevata plasticità acquisita. Il PTFE è un composto sintetico idrofobico non reattivo e il suo utilizzo consente la creazione di un microambiente cellulare, che non può essere raggiunto nei tradizionali sistemi di coltura 2D. Questo sistema incoraggia e aumenta il mantenimento della pluripotenza attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione.
Le procedure tecniche qui descritte sono semplici strategie per consentire l'induzione e il mantenimento di uno stato di elevata plasticità nelle cellule somatiche adulte. Il protocollo ha permesso la derivazione di cellule ad alta plasticità in tutte le specie di mammiferi testate. Poiché non comporta l'uso della trasfezione genica ed è privo di vettori virali, può rappresentare un notevole progresso tecnologico per le applicazioni di medicina traslazionale. Inoltre, il sistema di micro-bioreattori fornisce un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali ricreando in vitro un microambiente specifico che consente la coltura a lungo termine di cellule ad alta plasticità, vale a dire come ESC, iPSC, cellule epigeneticamente cancellate e MSC.
Introduction
Negli ultimi decenni, il concetto ampiamente accettato di progressione unidirezionale verso l'impegno e la differenziazione cellulare è stato completamente rivisto. È stato dimostrato che la specifica cellulare può essere invertita e una cellula differenziata terminalmente può essere spinta verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato, utilizzando metodi diversi.
Tra i diversi metodi proposti, uno dei metodi più promettenti prevede l'uso di composti chimici per indurre le cellule in una cosiddetta pluripotenza indotta chimicamente. Le piccole molecole utilizzate in questo approccio sono in grado di interagire e modificare la firma epigenetica di una cellula adulta matura, evitando la necessità di qualsiasi vettore transgenico e/o virale 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Numerosi studi hanno recentemente dimostrato che è possibile commutare le cellule da un fenotipo all'altro fornendo specifici stimoli biochimici e biologici che inducono la riattivazione dei geni ipermetilati 11,12,13,14,15. Questi eventi demetilanti consentono la conversione di cellule terminalmente differenziate in un progenitore primitivo, una cellula multipotente o ad alta plasticità/pluripotente 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
Parallelamente, molti studi si sono recentemente concentrati sulla comprensione dei segnali correlati al meccanosensimento e, più specificamente, sulla possibilità di utilizzare forze meccaniche per influenzare direttamente la plasticità cellulare e/o la differenziazione 16,17,18,19. In effetti, è stato chiaramente dimostrato che la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo chiave nel controllo del destino cellulare. In particolare, i segnali biomeccanici e biofisici prodotti dall'ECM regolano direttamente i meccanismi molecolari e le vie di segnalazione, influenzando il comportamento e le funzioni cellulari20,21. Questi dati recenti hanno spianato la strada allo sviluppo di nuovi sistemi di coltura 3D che imitano più da vicino il microambiente cellulare in vivo, replicando stimoli meccanici e fisici che guidano il comportamento cellulare.
Descriviamo qui un protocollo in due fasi che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing, per generare cellule pluripotenti di mammiferi. Nella prima fase, le cellule vengono incubate con la molecola demetilante 5-aza-citidina (5-aza-CR). Questo agente è in grado di indurre una significativa demetilazione globale del DNA attraverso un effetto combinato dell'azione diretta 8,10 mediata dalla traslocazione di dieci-undici (TET2) e l'inibizione indiretta delle DNA metiltransferasi (DNMT)22,23. Questo passaggio induce la rimozione dei blocchi epigenetici con una successiva riattivazione dell'espressione genica correlata alla pluripotenza e, quindi, la generazione di cellule ad alta plasticità 1,2,3,8,10, di seguito denominate "cellule epigeneticamente cancellate". Nella seconda fase, le celle sono incapsulate in un sistema di coltura 3D. A tal fine, il composto sintetico idrofobo non reattivo politetrafluoroetilene (PTFE; con dimensione delle particelle di 1 μm) viene utilizzato come micro-bioreattore, che consente la creazione di un microambiente cellulare irraggiungibile attraverso l'utilizzo di sistemi di coltura 2D tradizionali10. Le particelle di polvere di PTFE aderiscono alla superficie della goccia liquida in cui le cellule vengono nuovamente sospese e isolano il nucleo liquido dalla superficie di supporto, consentendo allo stesso tempo lo scambio di gas tra il liquido interno e l'ambiente circostante24. Il "micro-bioreattore PTFE" così ottenuto, noto anche come "Liquid Marble", incoraggia le cellule a interagire liberamente tra loro, promuovendo il riarrangiamento cellulare 3D 25,26,27, ed estende e mantiene stabilmente lo stato di plasticità elevata acquisito attraverso segnali correlati alla bio-meccanizzazione10.
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Protocol
Tutti gli studi sono stati esaminati e approvati dal Comitato Etico dell'Università degli Studi di Milano. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, pubblicata dal National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti. L'isolamento di cellule umane da individui adulti sani è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Maggiore Policlinico di Milano. Tutti i metodi nel nostro studio sono stati effettuati in conformità con le linee guida approvate.
1. Isolamento dei fibroblasti cutanei
NOTA: Tutte le procedure descritte di seguito possono essere applicate a fibroblasti isolati da diverse specie di mammiferi, tra cui topo, suino e umano. Le cellule murine sono state isolate da topi maschi di 7 settimane e il tessuto cutaneo suino è stato raccolto presso il macello locale. Le cellule umane sono state isolate da pazienti adulti, dopo il consenso informato scritto.
- Preparare una soluzione di gelatina suina allo 0,1%.
- Pesare 0,1 g di gelatina suina e scioglierla in 100 ml di acqua. Sterilizzare la soluzione di gelatina mediante autoclave prima dell'uso.
- Rivestire la capsula di Petri da 35 mm con gelatina suina allo 0,1% aggiungendo 1,5 ml della soluzione preparata. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Tagliare biopsie cutanee di mammiferi (topi, suini e umani) di circa 2-5 cm di lunghezza e metterle nella soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di Dulbecco contenente una soluzione antimicotica antibiotica al 2%. Conservare a + 4 °C fino all'uso.
NOTA: Le raccolte di biopsie devono essere effettuate in accordo e dopo l'approvazione del Comitato Etico, in conformità con le linee guida stabilite. - Lavare estensivamente le biopsie raccolte tre volte in PBS sterile fresco contenente soluzione antibiotica antimicotica al 2%.
- Raccogliere le biopsie dall'ultimo lavaggio e metterle in una capsula di Petri sterile da 100 mm. Utilizzare un bisturi sterile per tagliarli in pezzi di circa 2 mm3 .
- Al termine dell'incubazione di 2 ore, rimuovere l'eccesso di soluzione di gelatina dalla capsula di Petri da 35 mm (descritta al punto 1.1.2) e, utilizzando una pinzetta chirurgica sterile, posizionare immediatamente 5-6 frammenti di pelle in ciascun piatto di coltura preverniciato.
- Bagnare i frammenti aggiungendo 100 μL di goccioline di terreno di isolamento dei fibroblasti (Tabella 1) su ciascuno di essi. Coltura a 37 °C in incubatore a CO2 al 5%.
NOTA: per evitare l'evaporazione del mezzo, posizionare la capsula di Petri da 35 mm all'interno di una capsula di Petri di 100 mm o più grande contenente acqua sterile. Assicurarsi di tappare entrambe le piastre di Petri. - Dopo 24 ore di coltura, controllare la quantità del mezzo nella capsula di Petri da 35 mm. Se necessario, aggiungere 500 μL di mezzo di isolamento dei fibroblasti per mantenere bagnati i frammenti.
- Rimuovere con cura il mezzo e rinfrescarlo almeno ogni 2 giorni di coltura usando una pipetta.
- Quando i fibroblasti iniziano a crescere dai frammenti di pelle posti nella capsula di Petri da 35 mm (descritta nel passaggio 1.5.) e iniziano a formare un monostrato cellulare (di solito 6 giorni). Rimuovere i pezzi di pelle utilizzando una pinzetta chirurgica sterile e la coltura in 2 ml di terreno di isolamento dei fibroblasti.
- Continuare a coltivare il monostrato cellulare a 37 °C in incubatore a CO2 al 5% fino all'80% di confluenza e rinfrescare il mezzo a giorni alterni.
2. Coltura della linea cellulare primaria dei fibroblasti
- Quando i fibroblasti raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere con attenzione il mezzo di isolamento dei fibroblasti e lavare le cellule tre volte con 3 ml di PBS contenenti soluzione antimicotica antibiotica all'1%.
- Per il distacco cellulare, aggiungere 600 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% nel piatto di coltura e incubare a 37 °C per 3-5 minuti.
- Aggiungere 5,4 ml di terreno di coltura dei fibroblasti per neutralizzare la tripsina quando le cellule iniziano a staccarsi dal piatto di coltura (Tabella 1).
- Rimuovere le cellule mediante pipettaggio ripetuto e delicato. Cellule piatte in nuovi piatti di coltura (senza gelatina), mantenendo il rapporto di passaggio tra 1:2 e 1:4 (a seconda del tasso di crescita).
NOTA: La centrifugazione non è necessaria. - Mantenere le cellule in coltura e cambiare mezzo ogni 2 giorni, fino a quando non hanno raggiunto l'80% di confluenza e passarle.
NOTA: Propagare i fibroblasti due volte a settimana per mantenere una crescita vigorosa.
3. Esposizione dei fibroblasti a 5-aza-CR
- Preparare una soluzione madre fresca da 1 mM 5-aza-CR.
- Pesare 2,44 mg di 5-aza-CR e scioglierlo in 10 ml di DMEM ad alto glucosio. Risospendare la polvere vorticosamente. Sterilizzare la soluzione con filtro da 0,22 μm.
NOTA: la soluzione madre 5-aza-CR deve essere preparata immediatamente prima dell'uso. - Preparare la soluzione di lavoro 5-aza-CR diluendo 1 μL di soluzione madre 5-aza-CR (3.1.1.) in 1 mL di terreno di coltura dei fibroblasti.
NOTA: La concentrazione della soluzione di lavoro 5-aza-CR è di 1 μM 1,2,3,8,9.
- Pesare 2,44 mg di 5-aza-CR e scioglierlo in 10 ml di DMEM ad alto glucosio. Risospendare la polvere vorticosamente. Sterilizzare la soluzione con filtro da 0,22 μm.
- Tripsinare le cellule come descritto in precedenza (2.1.-2.3.) e rimuovere le cellule mediante pipettaggio ripetuto e delicato.
- Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirla in un tubo conico.
- Conta le cellule usando una camera di conteggio al microscopio ottico a temperatura ambiente. Calcolare il volume di terreno necessario per sospendere nuovamente le cellule per ottenere 4 x 104 cellule in 30 μL di terreno di coltura dei fibroblasti integrato con 1 μM 5-aza-CR (vedere passo 3.1.2.).
NOTA: La formula da utilizzare dipende dal tipo specifico di camera.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 150 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e il pellet risospeso con il terreno di coltura dei fibroblasti integrato con 1 μM 5-aza-CR (vedere punto 3.1.2.). Per il volume del terreno di coltura dei fibroblasti da utilizzare vedere il punto 3.4.
NOTA: Come controllo negativo, le cellule risospese emettono la stessa concentrazione nel terreno di coltura dei fibroblasti senza 5-aza-CR e procedono con l'incapsulamento cellulare in polvere di PTFE (fase 4.1.-4.13.).
4. Incapsulamento dei fibroblasti nei micro-bioreattori in PTFE
- Riempire una capsula di Petri da 35 mm con polvere di politetrafluoroetilene (PTFE) per produrre un letto (Figura 1A).
NOTA: Utilizzare piastre di Petri batteriologiche da 35 mm per evitare l'adesione del marmo liquido. Per ottenere un guscio sottile idrofobico e poroso, utilizzare una polvere di PTFE con una dimensione media delle particelle di 1 μm e prodotta con una macinatura massima di 2,0 NPIRI. Ciò consente la creazione di marmi liquidi permeabili al gas. Inoltre, il rivestimento traslucido facilita l'osservazione dei processi di aggregazione cellulare in tempo reale La maggiore dimensione delle particelle porta ad un'elevata polidispersità che può causare elevata evaporazione, deformità e perdita della forma sferica e la dissoluzione prematura dei micro-bioreattori. - Erogare 30 μL di goccioline singole contenenti 4 x 104 celle (vedere passaggi 3.4.- 3.5.) sul letto di polvere (Figura 1B).
- Ruotare delicatamente la capsula di Petri da 35 mm con un movimento circolare per assicurarsi che la polvere di PFTE copra interamente la superficie della goccia liquida per formare un micro-bioreattore di marmo liquido (Figura 1C).
- Prelevare il micro-bioreattore di marmo liquido utilizzando una punta della pipetta da 1.000 μL, tagliata sul bordo, per adattarsi al diametro del marmo (Figura 1D,E). Placcare il micro-bioreattore di marmo liquido su una capsula di Petri di batteriologia pulita per stabilizzarlo (Figura 1F).
NOTA: Per creare un attrito per afferrare il marmo all'interno della punta, tagliare le punte delle pipette con un diametro approssimativamente inferiore al diametro del marmo liquido. - Trasferire il micro-bioreattore di marmo liquido dalla capsula di Petri in una piastra da 96 pozzetti (una biglia/pozzetto) (Figura 1G).
- Aggiungere lentamente 100 μL di media dal margine del pozzo. Il micro-bioreattore inizia a fluttuare sopra il supporto (Figura 1H).
NOTA: Il micro-bioreattore si rompe nel contatto diretto con il liquido, a causa dell'interruzione dell'idrofobicità del PTFE. Come approccio alternativo, i micro-bioreattori di marmo liquido possono essere collocati individualmente in un piatto di coltura batteriologica da 35 mm. In questo caso, al fine di evitare l'evaporazione del marmo liquido, la capsula di Petri da 35 mm contenente il micro-bioreattore deve essere inserita in una capsula di Petri da 100 mm, precedentemente aliquotata con acqua sterile - Micro-bioreattore di marmo liquido incubato per 18 ore a 37 °C in incubatore 5% CO2 1,2,3,8,9.
NOTA: La dimensione delle particelle in PTFE di 1 μm può garantire uno scambio ottimale di gas tra il liquido interno e l'ambiente circostante. - Dopo l'incubazione 5-aza-CR per 18 ore, raccogliere il micro-bioreattore di marmo liquido utilizzando una punta di pipetta da 1.000 μL tagliata sul bordo (vedere punto 4.5).
- Posizionare il micro-bioreattore in una nuova capsula di Petri batteriologica da 35 mm (Figura 1D-F).
- Utilizzare un ago per forare la biglia liquida e romperla.
- Recuperare sferoidi formati con una punta di pipetta da 200 μL, tagliata sul bordo, sotto uno stereomicroscopio (Figura 1I,J).
NOTA: Le cellule epigeneticamente cancellate incapsulate in PTFE formano una struttura sferica 3D (un aggregato in ogni marmo liquido). - Per valutare l'acquisizione dello stato pluripotente in risposta a 5-aza-CR, controllare l'insorgenza dell'espressione genica correlata alla pluripotenza, OCT4, NANOG, REX1 e SOX2, mediante PCR qualitativa (Tabella 2).
- Procedere con il secondo passaggio del protocollo come descritto di seguito.
5. Coltura in micro-bioreattori in PTFE di cellule epigeneticamente cancellate
- Preparare il terreno di coltura ESC fresco (Tabella 1).
- Trasferire gli organoidi in una capsula di Petri contenente un mezzo ESC per il lavaggio dei residui di 5-aza-CR (vedere passaggi 5.1.-5.2.).
- Preparare una nuova capsula di Petri batteriologica da 35 mm contenente letto di polvere di PTFE (vedere anche punto 4.1.).
- Erogare un singolo organoide in una goccia di terreno di coltura ESC da 30 μL sul letto di polvere utilizzando una punta di pipetta da 200 μL, tagliata sul bordo (vedere passaggi 4.9.; 5.3.).
- Ruotare delicatamente la capsula di Petri da 35 mm con un movimento circolare per formare un nuovo micro-bioreattore di marmo liquido, raccoglierlo usando una punta della pipetta da 1.000 μL, tagliare sul bordo e posizionare il micro-bioreattore appena formato in un pozzo di piastra a 96 pozzetti (un marmo / pozzetto) (vedere i passaggi 4.3.-4.6.).
- Per far galleggiare i microbioreattori, aggiungere 100 μL di mezzi dal margine del pozzo per bagnare lentamente il marmo (vedi nota 4.7.).
- Micro-bioreattori di marmo liquido di coltura a 37 °C in incubatore a CO2 al 5% per tutto il tempo necessario. Cambiare mezzo a giorni alterni, seguendo la procedura descritta al punto 5.3.-5.7.
NOTA: Nel presente manoscritto vengono forniti i risultati ottenuti con la coltura di organoidi per 28 giorni. Tuttavia, se necessario, è possibile eseguire un periodo di coltura più lungo.
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Representative Results
Il presente protocollo descrive tutti i passaggi da eseguire per generare e mantenere stabilmente cellule pluripotenti di mammiferi da cellule somatiche adulte. Questo metodo ha avuto successo con fibroblasti isolati da diverse specie di mammiferi, vale a dire topi, suini e umani. I risultati rappresentativi qui riportati sono ottenuti da tutte le linee cellulari, indipendentemente dalla specie di origine.
Le analisi morfologiche mostrano che, dopo 18 ore di incubazione con l'agente demetilante 5-aza-CR, i fibroblasti incapsulati in micro-bioreattori in PTFE (3D Post 5-aza-CR) si aggregano e formano strutture sferiche 3D che mostrano una geometria dimensionale uniforme, in tutte e tre le specie considerate. (Figura 2A-C, 3D Post 5-aza-CR). 86,31 ± il 4,13% delle cellule incapsulate ha notevolmente modificato il proprio fenotipo, mostrando caratteristiche tipicamente correlate a un fenotipo8 ad alta plasticità. Al contrario, le cellule post-5-aza-CR coltivate in condizioni standard 2D, sebbene sostituite dalla tipica forma allungata dei fibroblasti con una rotonda o ovale, erano considerevolmente più piccole di dimensioni con nuclei più grandi e granulati, mantengono una distribuzione monostrato (Figura 2). I cambiamenti morfologici sono stati accompagnati dall'insorgenza dell'espressione genica correlata alla pluripotenza sia in cellule 3D che 2D Post 5-aza-CR. È stata osservata anche la trascrizione per l'omeobox 1 (OCT4) di classe 5 POU, l'omeobox Nanog (NANOG), la proteina del dito di zinco ZFP42 (REX1) e la regione di determinazione del sesso Y-box 2 (SOX2), che è assente nei fibroblasti non trattati (T0), è stata rilevata (Figura 3, Figura 4, Figura 5). Inoltre, l'analisi quantitativa della PCR ha dimostrato una significativa up-regulation dei geni sopra menzionati, nonché dei dieci-undici geni di traslocazione-2 (TET2), della molecola di adesione delle cellule epiteliali (EPCAM) e della caderina 1 (CDH1) nelle cellule 3D Post 5-aza-CR (Figura 3, Figura 4, Figura 5, barre blu) rispetto alle cellule coltivate in piastre di plastica standard 2D (2D Post 5-aza-CR) (Figura 3, Figura 4, Figura 5, barre arancioni). Parallelamente, una significativa downregulation del marcatore specifico dei fibroblasti Thy-1 cell surface antigen (THY1) era chiaramente rilevabile nelle cellule 3D e 2D Post 5-aza-CR (Figura 3, Figura 4, Figura 5).
Il raggiungimento di uno stato di elevata plasticità è stato confermato anche dall'analisi ELISA della metilazione globale del DNA, che dimostra una significativa diminuzione dei livelli di metilazione sia nelle cellule 3D che 2D Post 5-aza-CR (Figura 6A-C). Inoltre, in accordo con i risultati dell'espressione genica, i livelli di metilazione del DNA erano significativamente più bassi nelle cellule 3D Post 5-aza-CR (Figura 6A-C, barre blu), rispetto a quelle 2D Post 5-aza-CR (Figura 6A-C, barre arancioni).
Ancora più interessante, le cellule 3D Post 5-aza-CR mantengono la struttura sferica 3D acquisita (Figura 2A, 3D 28d) e mantengono alti livelli di espressione di geni correlati alla pluripotenza (Figura 3, Figura 4 e Figura 5 barre blu) e bassi livelli di metilazione del DNA (Figura 6A-C, barre blu), durante tutto il successivo periodo di coltura e, in particolare, fino a 28 giorni, quando la cultura è stata arrestata. Al contrario, sebbene le cellule 2D Post 5-aza-CR trascrivano per gli stessi geni di pluripotenza dopo il trattamento con l'agente demetilante, hanno rifiutato tale espressione entro il giorno 7 (Figura 3, Figura 4, Figura 5, nd). Allo stesso modo, la diminuzione dei livelli di metilazione è stata mantenuta per le prime 72 ore; poi la metilazione è aumentata lentamente, tornando paragonabile ai fibroblasti non trattati (Figura 6A-C, T0, barre bianche) entro il giorno 7 della coltura (Figura 6A-C, barre arancioni).
Figura 1: Incapsulamento cellulare in micro-bioreattore PTFE e recupero organoide. (A) Una capsula di Petri batteriologica è stata riempita con PTFE per preparare un letto di polvere. (B) Una singola goccia di cellule contenenti mezzo è stata erogata sopra il letto di PTFE. (C) La capsula di Petri è stata ruotata delicatamente con movimenti circolari per rivestire la goccia e produrre il micro-bioreattore. (D) Una punta della pipetta da 1000 μL è stata tagliata all'estremità (freccia rossa) e (E) utilizzata per raccogliere il microbioreattore. (F) Il marmo liquido è stato trasferito in una capsula di Petri pulita per stabilizzarlo, (G) posto in una piastra da 96 pozzetti (un marmo / pozzo) e (H) galleggiato sul supporto. (I) Per raccogliere l'organoide di nuova formazione, il micro-bioreattore è stato perforato con un ago e (J) gli aggregati cellulari ottenuti sono stati recuperati sotto uno stereomicroscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le cellule epigeneticamente cancellate dai mammiferi incapsulate in micro-bioreattori in PTFE formano strutture sferiche 3D. Cellule murine (A), suine (B) e umane (C) incapsulate in PTFE e trattate con strutture sferiche 3D 5-aza-CR (3D Post 5-aza-CR), che sono state mantenute stabilmente durante tutto il successivo periodo di coltura (3D 28d; Barra della scala, 100 μm). Al contrario, le cellule murine (A), suine (B) e umane (C) placcate su piatti di plastica e trattate con 5-aza-CR hanno sostituito la tipica forma allungata dei fibroblasti (T0) in un fenotipo epitelioide rotondo e hanno mantenuto una distribuzione monostrato (2D Post 5-aza-CR). Entro il giorno 7 della coltura, le cellule 2D sono tornate alla loro forma allungata originale che è stata mantenuta stabilmente per il successivo periodo di coltura (2D 28 d; Barra della scala, 100 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le cellule murine epigeneticamente cancellate incapsulate in microbioreattori in PTFE mostrano un alto livello e un mantenimento a lungo termine dell'espressione genica correlata alla pluripotenza. Livelli di trascrizione per i geni Oct4, Nanog, Rex1, Sox2, Tet2, Epcam, Cdh1 e Thy1 nei fibroblasti murini non trattati (T0, barre bianche), fibroblasti esposti a 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) e in diversi punti temporali di coltura per le cellule coltivate con PTFE incapsulato (barre blu) e piatto di plastica standard (barre arancioni). I valori di espressione genica sono riportati con l'espressione più alta impostata su 1 e tutte le altre relative a questo. Apici diversi denotano differenze significative (P < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Le cellule suicine epigeneticamente cancellate incapsulate in microbioreattori in PTFE mostrano un elevato livello e un mantenimento a lungo termine dell'espressione genica correlata alla pluripotenza. Livelli di trascrizione per i geni OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 e THY1 nei fibroblasti suini non trattati (T0, barre bianche), nei fibroblasti esposti a 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) e in diversi punti temporali di coltura per le cellule coltivate in PTFE incapsulate (barre blu) e piatto di plastica standard (barre arancioni). I valori di espressione genica sono riportati con l'espressione più alta impostata su 1 e tutte le altre relative a questo. Apici diversi denotano differenze significative (P < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Le cellule umane epigeneticamente cancellate incapsulate in microbioreattori di PTFE mostrano un alto livello e un mantenimento a lungo termine dell'espressione genica correlata alla pluripotenza. Livelli di trascrizione per i geni OCT4, NANOG, REX1, SOX2, TET2, EPCAM, CDH1 e THY1 nei fibroblasti umani non trattati (T0, barre bianche), fibroblasti esposti a 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) e in diversi punti temporali di coltura per le cellule coltivate con PTFE incapsulato (barre blu) e piatto di plastica standard (barre arancioni). I valori di espressione genica sono riportati con l'espressione più alta impostata su 1 e tutte le altre relative a questo. Apici diversi denotano differenze significative (P < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Il micro-bioreattore ptfe migliora l'effetto demetilante 5-aza-CR e mantiene l'ipometilazione del DNA a lungo termine nei fibroblasti epigeneticamente cancellati nei mammiferi. Livelli globali di metilazione del DNA di cellule murine (A), suine (B) e umane (C) incapsulate in micro-bioreattori ptfe (barre blu) o placcate su plastica standard (barre arancioni) esposte a 5-aza-CR (Post 5-aza-CR) e coltivate in mezzo ESC per 28 giorni. Fibroblasti non trattati (T0; barre bianche). I risultati rappresentano la media ± SD di tre esperimenti indipendenti con cinque repliche biologiche indipendenti. Apici diversi denotano differenze significative (P < 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Mezzo di isolamento dei fibroblasti (100 mL) | |
| DMEM, alto glucosio, piruvato | 77 ml |
| Siero bovino fetale, qualificato, inattivato dal calore | 20 ml |
| Soluzione di L-Glutammina | 1 ml |
| Soluzione antibiotica antimicotica (100×) | 2 ml |
| Terreno di coltura dei fibroblasti (100 mL) | |
| DMEM, alto glucosio, piruvato | 88 ml |
| Siero bovino fetale, qualificato, inattivato dal calore | 10 ml |
| Soluzione di L-Glutammina | 1 ml |
| Soluzione antibiotica antimicotica (100×) | 1 ml |
| Terreno di coltura ESC (10 mL) | |
| Mix di nutrienti F-10 di Ham | 3,99 ml |
| DMEM, basso contenuto di glucosio, piruvato | 3,99 ml |
| Sostituzione del siero KnockOut | 1 ml |
| Siero bovino fetale, qualificato, inattivato dal calore | 500 μL |
| Soluzione antibiotica antimicotica (100×) | 100 μL |
| Soluzione di L-Glutammina | 100 μL |
| Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100X) | 100 μL |
| 2-Mercaptoetanolo (10 mM) | 100 μL (0,1 mM) |
| Miscela nucleosidica (0,3 M Guanosina, 0,3 M Adenosina, 0,3 M Citidina, 0,3 M Uridina e 0,1 M Timidina) | 100 μL (3 mM Guanosina, 3 mM Adenosina, 3 mM Citidina, 3 mM Uridina e 1 mM Timidina) |
| Proteina LIF di topo ricombinante ESGRO (1000 unità/ml) | 10 μL (1 unità/mL) |
| FGF umano ricombinante di base (bFGF) (5 μg/mL) | 10 μL (5 ng/mL) |
Tabella 1: Composizione del mezzo di isolamento dei fibroblasti, del terreno di coltura dei fibroblasti e del terreno di coltura ESC.
| Bersaglio | Set di primer PCR | Specie | |
| Cdh1 · | Attaccante: GAGGAACCCACAGCCTCATA | Topo | |
| Retromarcia: GTTGACCGTCCCTTCACAGT | Topo | ||
| Epcam · | Attaccante: TGGCAACAAGTTGCTCTCTG | Topo | |
| Inverso: CTTGTCGGTTCTTCGGACTC | Topo | ||
| Nanog · | Attaccante: AGGCTGATTTGGTTGGTGTC | Topo | |
| Inverso: CCAGGAAGACCCACACTCAT | Topo | ||
| Ott4 | Attaccante: ACACCTGGCTTCAGACTTCG | Topo | |
| Inverso: AGTTGCTTTCCACTCGTGCT | Topo | ||
| Rex1 · | Attaccante: CAGGTTCTGGAAGCGAGTTC | Topo | |
| Inverso: GACAAGCATGTGCTTCCTCA | Topo | ||
| Sox2 · | Attaccante: AGAACCCCAAGATGCACAAC | Topo | |
| Retromarcia: CTCCGGGAAGCGTGTACTTA | Topo | ||
| Tet2 · | Attaccante: GCACAGGGAGCAAGAGATTC | Topo | |
| Inverso: ATGTTGACATTGCCAGTGGA | Topo | ||
| Tuo1 | Attaccante: AACTCTTGGCACCATGAACC | Topo | |
| Inverso: GCACGTGCTTCCTCTTCTCT | Topo | ||
| CDH1 · | Attaccante: GAATGACAATGGCCCCATAC | Porcino | |
| Inverso: AGGTGGTCACCTGGTCTTTG | Porcino | ||
| EPCAM · | Attaccante: GCTTGGTCAGTGCCAGTGTA | Porcino | |
| Inverso: CTTCTGACCCCAGCAGTGTT | Porcino | ||
| NANOG · | Attaccante: ATCCAGCTTGTCCCCAAAG | Porcino | |
| Inverso: ATTTCATTCGCTGGTTCTGG | Porcino | ||
| PTOM4 | Attaccante: GTTCAGCCAAACGACCATCT | Porcino | |
| Inverso: CTCCAGGTTGCCTCTCACTC | Porcino | ||
| REX1 · | Attaccante: CTTCAAGGAGAGCGCAAAAC | Porcino | |
| Inverso: TGTCCCCAATCAAAAATGCT | Porcino | ||
| SOX2 · | Attaccante: GCCCTGCAGTACAACTCCAT | Porcino | |
| Inverso: GCTGATCATGTCCCGTAGGT | Porcino | ||
| TET2 · | Attaccante: CAGAAAACAATGCAGCCAGA | Porcino | |
| Inverso: GAATGGCTCGGTCTCTGAAG | Porcino | ||
| THY1 | Attaccante: GGCATCGCTCTCTTGCTAAC | Porcino | |
| Inverso: GCTGGAGAAGTTGGTTCGAG | Porcino | ||
| CDH1 · | Attaccante: TGCCCAGAAAATGAAAAAGG | Umano | |
| Retromarcia: GTGTATGTGGCAATGCGTTC | Umano | ||
| EPCAM · | Attaccante: GCTGGTGTGTGAACACTGCT | Umano | |
| Inverso: ACGCGTTGTGATCTCCTTCT | Umano | ||
| NANOG · | Attaccante: AGAAAAACAACTGGCCGAAG | Umano | |
| Inverso: TGCTCCAGGACTGGATGTTC | Umano | ||
| PTOM4 | Attaccante: AATTTGCCAAGCTCCTGAAG | Umano | |
| Inverso: GTTGCCTCTCACTCGGTTCT | Umano | ||
| REX1 · | Attaccante: ACGTTTCGTGTGTCCCTTTC | Umano | |
| Retromarcia: TATAACCGCTTGGGGGGTTG | Umano | ||
| SOX2 · | Attaccante: ACACCAATCCCATCCACACT | Umano | |
| Inverso: GCAAACTTCCTGCAAAGCTC | Umano | ||
| TET2 · | Attaccante: CCCACTTACCTGCGTTTCAT | Umano | |
| Inverso: ACTGTGACCTTTCCCCACTG | Umano | ||
| THY1 | Attaccante: AGATCCCAGAACCATGAACC | Umano | |
| Inverso: GCACGTGCTTCTTTGTCTCA | Umano | ||
| Bersaglio | Numero di catalogo dei saggi TaqMan | Specie | |
| Actb · | Mm02619580_g1 | Topo | |
| Cdh1 · | Mm01247357_m1 | Topo | |
| Epcam · | Mm00493214_m1 | Topo | |
| Gapdh · | Mm99999915_g1 | Topo | |
| Nanog · | Mm02019550_s1 | Topo | |
| Ott4 | Mm03053917_g1 | Topo | |
| Rex1 · | Mm03053975_g1 | Topo | |
| Sox2 · | Mm03053810_s1 | Topo | |
| Tet2 · | Mm00524395_m1 | Topo | |
| Tuo1 | Mm00493681_m1 | Topo | |
| ACTB · | Ss03376563_uH | Porcino | |
| CDH1 · | Ss06942341_m1 | Porcino | |
| EPCAM · | Ss03384752_u1 | Porcino | |
| GAPDH · | Ss03375629_u1 | Porcino | |
| NANOG · | Ss04245375_s1 | Porcino | |
| PTOM4 | Ss03389800_m1 | Porcino | |
| REX1 · | Ss03373622_g1 | Porcino | |
| SOX2 · | Ss03388002_u1 | Porcino | |
| TET2 · | Ss06880359_m1 | Porcino | |
| THY1 | Ss03376963_u1 | Porcino | |
| ACTB · | Hs01060665_g1 | Umano | |
| CDH1 · | Hs01023895_m1 | Umano | |
| EPCAM · | Hs00901885_m1 | Umano | |
| GAPDH · | Hs02786624_g1 | Umano | |
| NANOG · | Hs02387400_g1 | Umano | |
| PTOM4 | Hs00999632_g1 | Umano | |
| REX1 · | Hs00399279_m1 | Umano | |
| SOX2 · | Hs01053049_s1 | Umano | |
| TET2 · | Hs00325999_m1 | Umano | |
| THY1 | Hs00174816_m1 | Umano | |
Tabella 2: Informazioni introduttive.
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Discussion
Negli ultimi decenni, diversi studi si sono concentrati sullo sviluppo di strategie per invertire una cellula differenziata terminale verso uno stato permissivo meno impegnato e più elevato. Il protocollo qui descritto consente la generazione e il mantenimento a lungo termine di cellule pluripotenti a partire da cellule adulte mature differenziate terminalmente. Il metodo combina due passaggi indipendenti che comportano l'induzione di un elevato stato permissivo che si ottiene attraverso la cancellazione chimica epigenetica e la sua successiva manutenzione assicurata utilizzando un sistema di coltura 3D.
La formazione di strutture sferoidi 3D osservata nelle cellule incapsulate in PTFE (Figura 2) è coerente con altri studi che dimostrano la capacità del PTFE di incoraggiare efficacemente l'aggregazione cellulare, facilitando la creazione di strutture sferoidie delle cellule di rivestimento olfattivo (OEC)25 o la formazione di aggregati toroidali 3D26. Questi cambiamenti morfologici sono paralleli all'insorgenza dell'espressione genica correlata alla pluripotenza (Figura 3, Figura 4, Figura 5) che mostra livelli significativamente più alti nelle cellule 3D Post 5-aza-CR, rispetto alle cellule 2D Post 5-aza-CR (Figura 3, Figura 4, Figura 5). Coerentemente, le cellule 3D Post 5-aza-CR mostrano una maggiore ipometilazione del DNA rispetto a quelle 2D Post 5-aza-CR (Figura 6). Nel complesso, questi risultati indicano la capacità di 5-aza-CR di indurre uno stato di elevata plasticità, indipendentemente dal sistema di coltura cellulare utilizzato. Tuttavia, lo stato di pluripotenza indotta chimicamente raggiunto dalle cellule, è significativamente promosso utilizzando un micro-bioreattore ptfe che aumenta la trascrizione genica a pluripotenza e aumenta gli effetti demetilanti 5-aza-CR. Ancora più interessante, solo le cellule 3D Post 5-aza-CR mantengono stabilmente la struttura sferica 3D acquisita (Figura 2) e mantengono alti livelli di espressione di geni correlati alla pluripotenza (Figura 3, Figura 4, Figura 5) e bassi livelli di metilazione del DNA (Figura 6), durante tutto il successivo periodo di coltura. Complessivamente, i risultati rappresentativi qui riportati dimostrano che questa strategia in due fasi è altamente efficiente e robusta, e l'uso di un micro-bioreattore in PTFE non solo aumenta l'elevata plasticità, ma consente anche il suo mantenimento stabile e a lungo termine nelle specie di mammiferi considerate. Abbiamo recentemente dimostrato che questi effetti benefici sono legati all'attivazione della via di segnalazione dell'ippopotamo e dei suoi segnali correlati alla meccanotrasduzione10, che hanno precedentemente dimostrato di avere un ruolo chiave nella regolazione attiva della pluripotenza cellulare 28,29,30.
I due passaggi più critici per una procedura di successo sono il rigoroso mantenimento delle cellule a 37 °C, in ogni momento, compresa la loro manipolazione sotto il flusso laminare sterile e il microscopio e l'uso di un numero di cellule corretto / velocità di volume liquido durante la produzione di micro-bioreattore, che può variare in base al tipo di cellula specifica utilizzato. Nella nostra esperienza, si consiglia inoltre vivamente di preparare i reagenti freschi, prima del loro utilizzo in coltura (questo è assolutamente cruciale per la soluzione madre 5-aza-CR). Inoltre, il media refreshing deve essere effettuato sotto uno stereomicroscopio poiché gli organoidi sferici 3D possono essere persi durante i cambi di mezzo.
I principali punti di forza di questo metodo non sono il requisito di vettori transgenici e/o virali; la robustezza e la riproducibilità in diverse specie di mammiferi; bassi costi; e alta flessibilità a diversi tipi di cellule. D'altra parte, una possibile limitazione potrebbe essere rappresentata dal numero limitato di dati ottenuti, a causa dei piccoli volumi dei micro-bioreattori. Inoltre, l'uso di un'alta densità cellulare può causare basse velocità di trasferimento di ossigeno e una crescita limitata della sospensione. Per superare questi problemi, rimane necessario un ulteriore lavoro su strategie scale-up e/o scale-down.
È importante sottolineare che gli aspetti chiave comuni a tutte le applicazioni 3D basate su sferoidi sono la riproducibilità, l'efficienza produttiva, l'uniformità delle dimensioni organoidiche e l'influenza sulla fisiologia cellulare. Queste caratteristiche sono strettamente correlate alle forze meccaniche generate all'interno del sistema di coltura e variano a seconda dei diversi metodi utilizzati. Ad esempio, gli organoidi multicellulari possono essere coltivati utilizzando piatti non aderenti in sistemi stazionari. Questo approccio si basa principalmente su condizioni di diffusione limitata e, di solito, si traduce nella formazione di cluster aggregati sciolti. La tecnica del hanging-drop mostra la stessa limitazione. Infatti, la deposizione di gocce di sospensione cellulare sul lato inferiore del coperchio di un piatto di coltura tissutale porta alla creazione di un ambiente di microgravità che concentra le cellule all'interfaccia liquido-aria libera, inducendo la generazione di sfere multicellulari a bassa aggregata. Una possibile alternativa è rappresentata dalla tecnica del pallone spinner. Tuttavia, questo metodo è molto costoso poiché richiede elevate quantità di terreno di coltura. Inoltre, gli organoidi formati devono essere trasferiti al sistema di coltura stazionario quando vengono utilizzati per la caratterizzazione o ulteriori test in vitro. Tutti questi problemi possono essere superati utilizzando micro-bioreattori di marmo liquido. Forniscono infatti una superficie liquida non aderente che combina i vantaggi dei metodi sia stazionari che di filatura, inducendo una rapida aggregazione cellulare e la generazione di sferoidi compatti. Parallelamente, il fondo concavo, la forma sferica e il flusso liquido interno di ciascun marmo consentono alle cellule di depositarsi sul fondo del micro-bioreattore, con conseguente formazione di organoidi uniformi per dimensioni e forma. Un altro vantaggio significativo nell'utilizzo dei marmi liquidi è rappresentato dagli scambi gassosi ottimali che, grazie alla loro forma sferica, possono avvenire attraverso l'intera superficie.
In conclusione, il protocollo qui descritto consente una generazione efficiente e semplice di cellule pluripotenti di mammifero. Poiché questa strategia è priva di vettori virali e non comporta l'uso di alcuna trasfezione genica, è molto promettente per le applicazioni di medicina traslazionale e può essere considerata un passo avanti nella terapia cellulare specifica per il paziente. Inoltre, l'uso di sistemi di coltura di micro-bioreattori 3D può rappresentare un notevole passo avanti nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali e può costituire un microambiente vantaggioso per la coltura a lungo termine di diversi tipi di cellule, come ESC, iPSC e MSC. Un ulteriore vantaggio è rappresentato dal piccolo volume che permette di studiare l'effetto della segnalazione paracrina/autocrina del ricco ambiente stabilito all'interno del micro-bioreattore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da Fondazione Carraresi e MiND FoodS Hub ID: 1176436. Tutti gli autori sono membri del COST Action CA16119 In vitro 3-D total cell guidance and fitness (CellFit).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Component of ESC medium |
| 5-Azacytidine | Sigma-Aldrich | A2385 | 5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | Component of fibroblast and ESC media |
| CFX96 Real-Time PCR | Bio-Rad Laboratories | NA | Thermal cycler for quantitative PCR |
| Cytidine | Sigma-Aldrich | C4654 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966052 | For fibroblast isolation and culture medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31885023 | For ESC medium |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D5652 | PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation |
| Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | 61021 | mRNA estraction |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein | Sigma-Aldrich | ESG1106 | Component of ESC medium |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Component of fibroblast and ESC media |
| FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Component of ESC medium |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | For dish coating |
| GeneAmp PCR System 2700 | Applied Biosystems | NA | Thermal cycler for qualitative PCR |
| Global DNA Methylation ELISA Kit | CELL BIOLABS | STA-380 | Methylation study |
| GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7801 | Qualitative PCR |
| Guanosine | Sigma-Aldrich | G6264 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | For ESC medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Component of ESC medium |
| KOVA glasstic slide 10 with grids | Hycor Biomedical | 87144 | For cell counting |
| Leica MZ APO Stereo Microscope | Leica | NA | For organoid observation |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Component of fibroblast and ESC media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Component of ESC medium |
| Millex-GS 0.22 µm pore filters | Millipore | SLGS033SB | For solution sterilization |
| M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant | Promega | M3681 | mRNA reverse transcription |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | 51119000 | For ELISA plate reading |
| Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | NA | For cell observation |
| Perkin Elmer Thermal Cycler 480 | Perkin Elmer | NA | Thermal cycler for reverse transcription |
| Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size | Sigma-Aldrich | 430935 | For generating micro-bioreactor |
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | K182001 | Genomic DNA estraction |
| TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1728 | Quantitative PCR |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
| Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard | Sarstedt | 833902 | For fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard | Sarstedt | 833900 | For Fibroblast isolation |
| Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension | Sarstedt | 833900500 | Bacteriology petri dish for liquid marble culture |
| Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F | Sarstedt | 833924005 | For liquid marble culture |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 | For fibroblast dissociation |
| Tube 15ml, 120x17mm, PS | Sarstedt | 62553041 | For cell suspension centrifugation |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | Component of nucleoside mix for ESC medium |
References
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