Perfilado de proteoma profundo y de alto rendimiento mediante etiquetado de etiquetas de masas en tándem de 16 complejos junto con cromatografía bidimensional y espectrometría de masas

Zhen Wang; Kanisha Kavdia; Kaushik  Kumar Dey; Vishwajeeth  Reddy Pagala; Kiran Kodali; Danting Liu; Dong  Geun Lee; Huan Sun; Surendhar  Reddy Chepyala; Ji-Hoon Cho; Mingming Niu; Anthony  A. High; Junmin Peng

doi:10.3791/61684

Artículo de método

Perfilado de proteoma profundo y de alto rendimiento mediante etiquetado de etiquetas de masas en tándem de 16 complejos junto con cromatografía bidimensional y espectrometría de masas

DOI:

10.3791/61684

⸱

18 de agosto de 2020

Zhen Wang^*¹ , Kanisha Kavdia^*² , Kaushik Kumar Dey¹ , Vishwajeeth Reddy Pagala² , Kiran Kodali² , Danting Liu¹ , Dong Geun Lee¹ , Huan Sun¹ , Surendhar Reddy Chepyala¹ , Ji-Hoon Cho² , Mingming Niu¹ , Anthony A. High² , Junmin Peng¹^,²

¹Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, ²Center for Proteomics and Metabolomics, St. Jude Children's Research Hospital

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo optimizado de alto rendimiento desarrollado con reactivos de marcado masivo en tándem 16-plex, que permite la creación de perfiles cuantitativos de proteomas de muestras biológicas. El amplio fraccionamiento básico del pH y el LC-MS/MS de alta resolución mitigan la compresión de la relación y proporcionan una cobertura profunda del proteoma.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El marcaje isobárico con etiquetas de masa en tándem (TMT) se usa ampliamente en proteómica debido a su alta capacidad de multiplexación y su profunda cobertura de proteoma. Recientemente, se ha introducido un método TMT ampliado de 16 plex, que aumenta aún más el rendimiento de los estudios proteómicos. En este manuscrito, presentamos un protocolo optimizado para el perfilado de proteoma profundo basado en TMT 16-plex, que incluye la preparación de muestras de proteínas, la digestión enzimática, la reacción de marcaje de TMT, el fraccionamiento de cromatografía líquida de fase inversa bidimensional (LC/LC), la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y el procesamiento de datos computacional. Se destacan los pasos cruciales del control de calidad y las mejoras en el proceso específico para el análisis TMT de 16 complejos. Este proceso multiplexado ofrece una poderosa herramienta para perfilar una variedad de muestras complejas, como células, tejidos y muestras clínicas. Más de 10.000 proteínas y modificaciones postraduccionales como la fosforilación, la metilación, la acetilación y la ubiquitinación en muestras biológicas altamente complejas de hasta 16 muestras diferentes se pueden cuantificar en un solo experimento, lo que proporciona una potente herramienta para la investigación básica y clínica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los rápidos desarrollos en la tecnología de espectrometría de masas han permitido lograr una alta sensibilidad y una cobertura profunda del proteoma en aplicaciones de proteómica ^1,2. A pesar de estos avances, la multiplexación de muestras sigue siendo el cuello de botella para los investigadores que manejan el análisis de una gran cohorte de muestras.

Las técnicas de marcaje isobárico multiplexado se utilizan ampliamente para la cuantificación relativa de todo el proteoma de grandes lotes de muestras 3,4,5,6.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los tejidos humanos para el estudio se obtuvieron con la aprobación del Programa de Donación de Cerebro y Cuerpo del Instituto de Investigación de Salud Banner Sun.

1. Extracción de proteínas de tejidos y control de calidad

NOTA: Para reducir el impacto de la recolección de muestras en el proteoma, es crucial recolectar muestras en un tiempo mínimo a baja temperatura si es posible³¹. Esto es especialmente importante cuando se analizan modificaciones postraduccionales, ya que suelen ser lábiles, por ejemplo, algunos eventos de fosforilación solo tienen unos p....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo para el TMT16 recientemente desarrollado, que incluye la reacción de etiquetado, la desalinización y las condiciones de LC-MS, se ha optimizado sistemáticamente⁴¹. Además, comparamos directamente los métodos 11-plex y 16-plex utilizándolos para analizar las mismas muestras humanas de EA⁴¹. Después de la optimización de los parámetros clave para TMT16, los métodos TMT11 y TMT16 producen una cobertura, identificación y cuantificación de proteomas similares > 1.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocolo optimizado para el perfil de proteoma profundo basado en TMT16 se ha implementado con éxito en publicaciones anteriores 12,13,41. Con este protocolo actual, más de 10.000 proteínas únicas de hasta 16 muestras diferentes se pueden cuantificar de forma rutinaria en un solo experimento con alta precisión.

Para obtener resultados de alta calidad, es important.......

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, RF1AG064909 y U54NS110435) y ALSAC (American Lebanese Syrian Associated Charities). El análisis de la EM se realizó en el Centro de Proteómica y Metabolómica del St. Jude Children's Research Hospital, que cuenta con el apoyo parcial de la Subvención (P30CA021765) del Centro de Cáncer de los NIH. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

....

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10% Criterion TGX Precast Midi Protein Gel	Biorad 5671035
10X TGS (Tris/Glycine/SDS) Buffer	BioRad	161-0772
4– 20% Criterion TGX Precast Midi Protein Gel	Biorad	5671095
50% Hidroxilamina	Thermo Scientific	90115
6 x SDS Tampón de carga de muestras	Boston Bioproducts Inc	BP-111R
Formiato de amonio (NH4COOH)	Sigma	70221-25G-F
Hidróxido de amonio, 28%	Sigma	338818-100ml
Bullet Batidora	Next Advance	BB24-AU
Butterfly Portfolio Heater	Phoenix S& T	PST-BPH-20
C18 Ziptips	Harvard Aparato	74-4607	Utilizado para desalinizar
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545
DMSO	Sigma	41648
Ácido fórmico	Sigma	94318
Colector de fracciones	Gilson	FC203B
Código de gel Reactivo	de manchas azulesThermo	24592
Perlas de vidrio	Next Advance	GB05
HEPES	Sigma	H3375
Acetonitrilo de grado HPLC	Burdick & Jackson	AH015-4
Agua de grado HPLC	Burdick & Jackson	AH365-4
Yodoacetamida (IAA)	Sigma	I6125
Lys-C	Wako	125-05061
Espectrómetro de masas	Thermo Scientific	Q Exactive HF
MassPrep BSA Digestión	Aguas	186002329
Metanol	Burdick & Jackson	AH230-4
Nanoflow UPLC	Thermo Scientific	Ultimate 3000
Pierce BCA Kit de ensayo	Thermo Scientific	23225
ReproSil-Pur C18 resina, 1.9um	Dr. Maisch GmbH	r119.aq.0003
Columnas autoempaquetadas	Nuevo objetivo	PF360-75-15-N-5
SepPak 1cc 50mg	Aguas	WAT054960	Se utiliza para la desalinización
Desoxicolato de sodio	Sigma	30970
Speedvac	Thermo Scientific	SPD11V
TMTpro 16plex Juego de reactivos para etiquetas Thermo	Scientific	A44520
Ácido trifluoroacético (TFA)	Applied Biosystems	400003
tripsina	Promega	V511C
Columna de centrifugado ultramicro, C18	Aparato de Harvard	74-7206	Utilizado para desalinizar
Urea	Sigma	U5378
Columna Xbridge Columna C18	Aguas	186003943	Utilizado para LC de pH básico

estándar

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Levy, M. J., Washburn, M. P., Florens, L. Probing the sensitivity of the orbitrap lumos mass spectrometer using a standard reference protein in a complex background. Journal of Proteome Research. 17 (10), 3586-3592 (2018).
Bekker-Jensen, D. B., et al.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Marcaje TMT de 16 plex preparaci n de muestras de prote nas digesti n enzim tica fraccionamiento LC LC espectrometr a de masas en t ndem procesamiento computacional de datos

Perfilado de proteoma profundo y de alto rendimiento mediante etiquetado de etiquetas de masas en tándem de 16 complejos junto con cromatografía bidimensional y espectrometría de masas

En este artículo

Resumen

Resumen

Introducción

Protocolo

Resultados

Discusión

Divulgaciones

Agradecimientos

Materiales

Referencias

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Artículos relacionados