Perfiles metabólicos para determinar los efectos bactericidas o bacteriostáticos de nuevos productos naturales utilizando microcalorimetría isotérmica

Resumen

El esclareciótización del modo de acción de un antibiótico novedoso es una tarea difícil en el proceso de descubrimiento de fármacos. El objetivo del método descrito aquí es la aplicación de microcalormetría isotérmica utilizando calScreener en perfiles antibacterianos para proporcionar información adicional sobre las interacciones fármaco-microbio.

Resumen

Debido a la amenaza mundial del aumento de la resistencia a los antimicrobianos, se necesitan urgentemente nuevos antibióticos. Investigamos productos naturales de Myxobacteria como una fuente innovadora de estos nuevos compuestos. Un cuello de botella en el proceso es típicamente la elucidación de su modo de acción. Recientemente establecimos microcalormetría isotérmica como parte de una canalización de perfilado de rutina. Esta tecnología permite investigar el efecto de la exposición a antibióticos en la respuesta metabólica bacteriana total, incluidos los procesos que se desacoplan de la formación de biomasa. Es importante destacar que los efectos bacteriostáticos y bactericidas son fácilmente distinguibles sin intervención del usuario durante las mediciones. Sin embargo, la microcalorimetría isotérmica es un enfoque bastante nuevo y aplicar este método a diferentes especies bacterianas generalmente requiere una evaluación previa de las condiciones de medición adecuadas. Hay algunos termogramas de referencia disponibles de ciertas bacterias, facilitando en gran medida la interpretación de los resultados. A medida que el conjunto de datos de referencia está creciendo constantemente, esperamos que la metodología tenga un impacto cada vez mayor en el futuro y esperamos que permita análisis detallados de huellas dactilares que permitan la diferenciación de las clases de antibióticos.

Introducción

El objetivo de este método es aplicar la microcalorimetría isotérmica (IMC) como un ensayo de rendimiento medio en el perfilado de modo de acción (MoA) de nuevos compuestos antibacterianos. Este método revela datos sobre la actividad de los compuestos en especies bacterianas y proporciona información sobre la naturaleza bactericida o bacteriostática del propio compuesto.

El aumento de la resistencia a los antimicrobianos emergentes es un problema mundial y conduce a tratamientos menos eficaces de infecciones comunes con antibióticos conocidos¹. Sin embargo, la búsqueda de nuevos compuestos y medicamentos que pueden reemplazar o trabajar en combinación con antibióticos conocidos están en curso y esto se basa en diversos enfoques. Los productos naturales son un actor clave en las campañas actuales de descubrimiento de fármacos y particularmente en el descubrimiento de fármacos antiinfecciosos². Sin embargo, la identificación de nuevas estructuras de plomo para el desarrollo de antibióticos es un proceso largo y financieramente exigente³. Por lo tanto, los primeros pasos de descubrimiento son extremadamente importantes para filtrar en los andamios más prometedores ya en una etapa temprana. Los pasos iniciales en el descubrimiento de fármacos de productos naturales incluyen la obtención de la estructura de un compuesto, la determinación de la actividad in vitro junto con el MoA y la identificación del objetivo. La mayoría de los compuestos exitosos que son elegibles para un desarrollo posterior deben mostrar un espectro favorable de actividad (es decir, actividad de amplio espectro en el caso de los antibacterianos) y un nuevo Ministerio de Defensa con el que se pueda superar la RMN preexistente. Los andamios prometedores se examinan típicamente en ensayos secundarios, que incluyen biodisponibilidad in vivo, toxicidad y metabolismo^4. Además de las preocupaciones financieras, el descubrimiento de fármacos de productos naturales se enfrenta a nuevos desafíos relacionados con los costos y dificultades técnicas relacionadas con el aislamiento y la purificación de compuestos, lo que, a su vez, puede dificultar la obtención de cantidades de varios miligramos o incluso gramos en las primeras etapas del proceso de descubrimiento^5,,6. Por lo tanto, es de suma importancia en la investigación de productos naturales poder realizar un cribado primario de última generación con cantidades compuestas mínimas con el fin de tomar una decisión bien informada sobre nuevas inversiones para hacer que un producto natural novedoso sea accesible para el desarrollo preclínico. Con el uso de IMC para el perfilado antibacteriano, la cantidad de compuesto necesario se reduce significativamente en comparación con los métodos estándar. La técnica también proporciona información más detallada sobre la interacción de nuevos fármacos con la comunidad microbiana⁷.

IMC es un método bien establecido para medir la energía total como resultado de todos los procesos y reacciones biológicas, físicas y bioquímicas en un sistema biológico. La liberación de energía bacteriana es proporcional a las reacciones metabólicas totales⁸. Dentro de un sistema cerrado, como el microcalorímetro utilizado, los niveles de calor se pueden medir en el rango de microvatios para estudiar la cinética metabólica de las bacterias^9,10,11,12. El calor (energía) que es liberado por las bacterias está vinculado a funciones celulares que subyacen a su metabolismo y que no son necesariamente proporcionales a la biomasa celular.

Inicialmente, la aplicabilidad de la calorimetría isotérmica para ensayos microbiológicos ha sido limitada debido a su bajo rendimiento y altos volúmenes de prueba. Sin embargo, el microcalorímetro utilizado es único, ya que combina las ventajas de la calorimetría isotérmica con un mayor rendimiento y menores requisitos de compuestos, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para aplicaciones de descubrimiento de fármacos^10. Además, el instrumento ofrece otras ventajas sobre métodos alternativos para medir la cinética del crecimiento bacteriano, como el método de turbidez estándar, que se basa en la medición de la densidad óptica a 600 nm (OD<₆₀₀). La medición de OD₆₀₀ se basa en la suposición de que el aumento de la densidad óptica es igual al crecimiento microbiano, descuidando así la presencia de células no viables. Este método también ha sido criticado ya que excluye pequeñas variantes de colonias y células persisteres^11. Por el contrario, IMC permite la observación en tiempo real de cualquier tipo de células viables. Si las células están latentes, todavía presentan actividad metabólica y por lo tanto pueden ser detectadas por IMC, mientras que tales fenómenos no son detectables por el método de turbidez estándar¹¹. Otras ventajas de IMC incluyen un menor tiempo de prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos, la medición de las interacciones farmacológicas en una comunidad compleja y los métodos de análisis estándar sin destruir la muestra⁷.

La tecnología IMC se ha implementado en una amplia gama de estudios, que van desde la microbiología hasta la termogénesis y la biología del cáncer^{13,,14,,15,,16,,17.} Las aplicaciones microbianas incluyen la determinación de concentraciones inhibitoras mínimas (MIC) de compuestos contra diversas cepas bacterianas. Se han realizado varios estudios y se ha llegado a la conclusión de que los datos MIC de calorimetría isotérmica para la mayoría de las especies bacterianas se pueden obtener más rápido y los resultados son similares en comparación con otros métodos (estándar) para la determinación MIC^12,,18,,19. Otras aplicaciones de IMC incluyen la observación de la interacción de fármacos y la combinación de tratamientos farmacológicos con comunidades bacterianas complejas como las biopelículas¹¹. Un estudio centrado en el perfilado del MoA mostró que el microcalorímetro puede detectar una diferencia en las cefalosporinas de primera y segunda generación, mientras que diferentes antibióticos con el mismo MoA exhiben una curva de flujo de calor similar en comparación con los^{demás 18}.

Aquí, describimos el uso de IMC para el perfilado de MoA de nuevos productos naturales utilizando el nuevo instrumento de microcalormetría isotérmica. El método se utiliza para determinar las concentraciones eficaces de antibióticos y para describir las características de los antibióticos en términos de mecanismos bactericidas o bacteriostáticos. El método puede implementarse ampliamente en el perfilado de compuestos del Ministerio de Defensa y podría reemplazar o al menos complementar los métodos microbiológicos estándar. Los estudios futuros incluirán análisis detallados de huellas dactilares que permitirán la diferenciación de las clases de antibióticos en función de los mecanismos objetivo.

Protocolo

NOTA: La temperatura del instrumento debe ajustarse de acuerdo con la bacteria utilizada con al menos un día de antelación para garantizar la estabilidad del sistema. Aquí, las muestras de Acinetobacter baumannii DSM30008 se ejecutan a 30 oC.

1. Preparación de la cultura

1. Estirar la cepa bajo investigación (aquí: A. baumannii) en una placa de agar CASO e incubar durante la noche en una incubadora estática a 30 oC.
2. Preparar un cultivo nocturno inoculando una sola colonia en MHB (caldo de Mueller-Hinton) e incubar en una incubadora de temblores a 180 rpm a 30 oC.

2. Preparación de muestras

1. Utilice tubos de 1,5 ml para preparar el rango de concentración de fármaco o compuesto seleccionado (por ejemplo, añadiendo 1,5 l de soluciones de stock de 100x en DMSO; ver paso 2.3).
2. Diluir el cultivo nocturno en medio MHB.
   1. Mida la densidad óptica del cultivo nocturno utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm.
   2. Diluir el cultivo para obtener 5 x 10⁵ unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en medio MHB fresco. Una OD₆₀₀ de una es igual a aproximadamente 5 x 10⁸ CFU/ml (por ejemplo, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
      NOTA: Es importante calibrar el factor de conversión OD₆₀₀ a CFU/ml para cada cepa bacteriana individual en las condiciones de cultivo aplicadas.
3. Añadir 150 l de las células a los tubos de ensayo preparados en el paso 2.1, asegurando la correcta concentración final del fármaco o compuesto probado y la concentración final correcta de células.
4. Mezclar el compuesto con las células por vórtice.
   NOTA: La placa de muestra (ver Tabla de Materiales)tiene seis filas, cada una con ocho pozos, un total de 48 pozos; La fila A y la fila F son la referencia termodinámica. Por lo tanto, no se pueden cargar muestras en esos pozos, los medios correspondientes se cargan en esos pozos. Se pueden medir 32 muestras de prueba por ejecución, utilizando pozos en las filas B-E. La muestra de prueba individual debe ejecutarse como mínimo por duplicado (aquí: todas las muestras se ejecutaron como triplicados). Deben incluirse controles de crecimiento.

3. Inserte la preparación

1. Transfiera 120 l de la mezcla preparada en el paso 2.4 a las plaquitas de plástico.
   NOTA: Utilice el pipeteo inverso en el paso 3.1 para evitar que el líquido se rocíe en los lados de las plaquitas de plástico, lo que puede provocar interferencias con las lecturas correctas de la señal.
2. Coloque todos los viales de titanio en los soportes (ver Tabla de Materiales)con pinzas.
3. Transfiera suavemente las plaquitas a los viales de titanio en la placa del soporte.
4. Coloque ligeramente las tapas de titanio en todos los viales de titanio.

4. Inserte la carga

1. Transfiera el soporte con copas de titanio a la estación de muestra y colóquelo en el área designada.
2. Utilice la llave de torsión, ajustada a 40 cNm de fuerza, para apretar todas las tapas.

5. Ejecución de muestras

1. En el software calView, inicie un nuevo experimento(Figura suplementaria 1).
2. Retirar el brazo de inserción de la muestra del instrumento.
3. Coloque el soporte de la taza en el "puente", columna 8 frente a la abertura de inserción de la muestra y empuje suavemente el soporte de la taza en el instrumento en la "Posición 1" designada. Espere 10 minutos hasta que el sistema se estabilice. Etiqueta los pozos experimentales.
4. Empuje el brazo de inserción de la muestra hasta que el soporte de la copa esté en la "Posición 2" designada. Espere 20 minutos hasta que el sistema se estabilice.
5. Empuje el brazo de inserción de la muestra en "Posición 3" y retraiga el brazo de inserción de la muestra hasta que esté en la "Posición de funcionamiento". Resalte todos los pozos en el software y seleccione Inicio de reacción (Figura suplementaria 4).
6. Ejecute el experimento hasta que las lecturas de emisión de calor vuelvan a ser estables en cero.
   NOTA: Asegúrese de que todos los pozos se comportan de manera similar dentro de estos pasos. La Figura 5 suplementaria ilustra lo que se debe observar si los pozos se cargan correctamente. Si se carga incorrectamente, repita los pasos 5.2-5.4.

6. Retire el soporte de la taza

1. En el software, seleccione Detener (Figura suplementaria 6). A continuación, el software le preguntará si "está seguro", seleccione Sí (Figura suplementaria 7) y guarde el experimento en una unidad o escritorio para el análisis de datos(Figura complementaria 8).
2. Inserte el brazo de inserción de la muestra completamente en el instrumento y enganche los imanes para recuperar el soporte de la copa.
3. Afloje las tapas, retire las plaquitas y coloque los viales y tapas en soportes de vidrio y colóquelos durante 4 horas a 180 oC seguido de colocar los viales y tapas en un desecador para garantizar que las tapas y los viales estén secos.

7. Análisis de datos

1. Abra el software (Figura suplementaria 9), seleccione Abrir experimento en la esquina superior izquierda(Figura suplementaria 10). En la ventana emergente seleccione el experimento de interés y pulse Abrir (Figura suplementaria 11). La aplicación abrirá el experimento en la vista predeterminada de pozos(figura suplementaria 12).
2. Pulse Seleccionar todo o Ctrl+A (Figura complementaria 13).
3. Pulse Definir línea base, este parámetro normaliza los datos en cada posición(Figura complementaria 14). En la ventana emergente seleccione un período de tiempo de > 30 min situado en la fase de retardo (el flujo de calor tiene que ser bajo, entre cero y diez W; Figura complementaria 15). Después de la selección del período de tiempo de la línea base, la línea base elegida aparecerá en verde en el termograma. Cierre la ventana Definir sección de línea base.
4. Pulse Guardar o Ctrl+S y cierre el software(Figura complementaria 16).
5. Abra la aplicación de análisis De Symcel Calorimetry basada en web (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
6. Para cargar el archivo en la aplicación de análisis de Calorimetry, presione Examinar (Figura suplementaria 17), seleccione el experimento y presione Abrir (Figura suplementaria 18). Los parámetros metabólicos se calcularán automáticamente para las 32 muestras de la aplicación web(figura complementaria 19).
7. Para ajustar los datos de flujo de calor a los modelos de crecimiento de Gompertz y/o Richard, haga clic en Función de crecimiento. El ajuste de los modelos de crecimiento se mostrará en la sección "Acumulativo", también en comparación con los datos sin procesar en la sección "Flujo" (Figura complementaria 20).
8. Para descargar todos los parámetros calculados, pulse Descargar medidas. Seleccione la ubicación del archivo y pulse Guardar (figura complementaria 21). El archivo se exportará a una hoja de cálculo para realizar cálculos adicionales.

Resultados

Se necesita un número suficiente de bacterias que producen calor para que el instrumento grabe una señal de calor. Si hay un retraso en el tiempo hasta que un flujo de calor es detectable significa que las bacterias todavía no producen una señal de calor por encima del límite de detección. Por lo tanto, la detección del calor liberado de la muestra bacteriana está directamente relacionada con el aumento de la actividad bacteriana, incluido el crecimiento bacteriano. Crecimiento bacteriano y otras actividades metabólicas son conocidos por ser fuertemente influenciado por la adición de un fármaco antibacteriano. Para determinar si un nuevo producto natural bajo investigación ejerce efectos bactericidas o bacteriostáticos o una combinación de ambos MoAs, hemos elegido un pequeño conjunto de fármacos de referencia y hemos registrado termogramas con los que comparamos datos de experimentos con el producto natural. En función de la potencia de los antibióticos seleccionados, se seleccionó una serie de concentraciones al cerrar la concentración inhibitora mínima (MIC) determinada por la dilución del microbroto.

Ciprofloxacino se dirige a la gyrase de ADN bacteriano y topoisomerasa IV y, en consecuencia, exhibe un MoA bactericida. Sin embargo, la matanza bacteriana inducida por ciprofloxacino depende de la concentración y cuando se dosifica a concentraciones insuficientes también puede tener un efecto bacteriostático²¹. La tetraciclina y el cloramphenicol se dirigen al ribosoma en la subunidad 30S y 50S, respectivamente, y actúan bacteriostáticos debido a la inhibición de la síntesis de^{proteínas 22,23}. La rifampicina actúa inhibiendo la ARN polimerasa dependiente del ADN y puede tener efectos bactericidas y bacteriostáticos, dependiendo de la dosis utilizada²⁴. El producto natural que estamos investigando aquí fue aislado de las Myxobacterias y mostró una potente actividad contra patógenos bacterianos Gram-negativos y Gram-positivos. Mientras investigamos su objetivo molecular y de moA, nos interesaba determinar si el nuevo producto natural ejerce efectos bactericidas y/o bacteriostáticos y si los perfiles térmicos de Acinetobacter baumannii tratados son similares a los termogramas de bacterias que fueron tratados con los medicamentos de referencia mencionados anteriormente.

Los termogramas obtenidos mediante la exposición de A. baumannii DSM-30008 a ciprofloxacino en dilución en serie se muestran en la Figura 1A. Las concentraciones entre 0,005 m y 0,1 m tienen un efecto mínimo en el crecimiento y el metabolismo de A. baumannii. Sin embargo, el tratamiento de las células con ciprofloxacino de 0,5 m conduce a un cambio significativo en la duración de la fase de retraso y a un menor flujo de calor máximo. Estos dos cambios juntos afectan el tiempo hasta el pico(Figura 1C), que se incrementa en aproximadamente 6 horas. En la Figura 1B,el calor liberado acumulativo se traza contra el tiempo. Aquí, vemos el efecto de las concentraciones, que se refleja en una inclinación de la pendiente. La cuantificación de la inclinación del termograma nos da la tasa metabólica máxima de A. baumannii en presencia de ciprofloxacino como se muestra en la Figura 1D,donde podemos observar una disminución concomitante de la tasa metabólica de las células tratadas con 0,5 m de ciprofloxacino. Los cambios en la tasa metabólica de las células tratadas con concentraciones más bajas son mínimos. Este experimento podría mejorarse aún más mediante la adición de concentraciones intermedias que cubran el rango de 0,1-1 m para observar un cambio gradual más pronunciado entre las concentraciones que no tienen efecto y una concentración que resulta en un retraso significativo de la fase de retraso y la tasa metabólica. Sin embargo, las tendencias del cambio apoyan un MoA bactericida de ciprofloxacino.

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Figura 1D: Efecto de ciprofloxacino en A. baumannii DSM-30008 crecimiento y metabolismo. (A) Los termogramas mostrados como flujo de calor (W) frente al tiempo (h) para el tipo salvaje (WT) A. baumannii DSM-30008, no tratados y expuestos a ciprofloxacino. (B) Calor acumulado (mJ) vs. tiempo (h). (C) Tiempo de pico (h) con barras de error (desviación estándar). (D) Tasa metabólica (W) con barras de error (desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de la tetraciclina, no observamos cambios significativos en los termogramas para todas las concentraciones probadas hasta la fase exponencial tardía a partir de 8 horas (ver Figura 2A). Sin embargo, se observan cambios importantes en la emisión de calor en fase estacionaria, donde el segundo pico de flujo de calor se reduce significativamente para A. baumannii tratado con 5 oM y 10 m de tetraciclina. Las concentraciones más bajas también tuvieron un efecto, que sin embargo fue menos pronunciado. Este efecto también hace que una prolongación en el tiempo llegue a su punto máximo como se muestra en la Figura 2C. Las curvas de calor liberadas acumulativas (Figura 2B) muestran que las células no tratadas y tratadas no muestran diferencias significativas en la forma de la curva general, pero por tendencia, la pendiente de las curvas disminuye a concentraciones más altas de tetraciclina. Esto también se traduce en tasas metabólicas cuantificadas mostradas en la Figura 2D,donde se observa un efecto dependiente de la concentración (es decir, disminución de la tasa metabólica en el aumento de las concentraciones de antibióticos). Estos hallazgos apoyan el hecho de que la tetraciclina tiene un efecto bacteriostático.

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Figura 2D: Efecto de la tetraciclina en A. baumannii DSM-30008 crecimiento y metabolismo. (A) Los termogramas mostrados como flujo de calor (W) frente a tiempo (h) para el tipo salvaje (WT) A. baumannii DSM-30008, no tratados y expuestos a la tetraciclina. (B) Calor acumulado (mJ) vs. tiempo (h). (C) Tiempo de pico (h) con barras de error (desviación estándar). (D) Tasa metabólica (W) con barras de error (desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Efectos aún más pronunciados se pueden observar al tratar A. baumannii con el inhibidor de la síntesis de proteínas cloramphenicol que se dirige a la subunidad ribosomal 50S. La exposición al aumento de las concentraciones de cloramphenicol conduce a la prolongación de la fase de retraso y a cambios significativos de la actividad metabólica en la fase estacionaria(Figura 3A y Figura 3B). No se observa ningún cambio en la tasa metabólica para la concentración probada más baja y la concentración de ensayo más alta elegida (50 m) impide la mayor liberación de energía de la muestra. En cuanto a las concentraciones intermedias de ensayo (5 m y 10 m), el tiempo de pico se incrementa significativamente en aproximadamente 8-9 horas(Figura 3C). Simultáneamente, la tasa metabólica de las células tratadas se reduce significativamente, siendo 50 M letal(Figura 3D). En general, los cambios observados en concentraciones de hasta 10 m de cloramphenicol son consistentes con un efecto bacteriostático de esta clase de antibióticos.

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Figura 3D: Efecto del cloramphenicol en A. baumannii DSM-30008 crecimiento y metabolismo. (A) Los termogramas mostrados como flujo de calor (W) frente a tiempo (h) para el tipo salvaje (WT) A. baumannii DSM-30008, no tratados y expuestos al cloramphenicol. (B) Calor acumulado (mJ) vs. tiempo (h). (C) Tiempo de pico (h) con barras de error (desviación estándar). (D) Tasa metabólica (W) con barras de error (desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El tratamiento de la rifampicina en el rango de concentración seleccionado tiene un efecto dramático en los termogramas de A. baumannii DSM-30008 relacionados con la duración de la fase de retraso y los efectos sobre el crecimiento hasta la fase estacionaria tardía (Figura 4A). Una reducción significativa de la emisión de calor se puede observar en la Figura 4B que va junto con una disminución en la actividad metabólica. La Figura 4C y la Figura 4D ilustran la influencia de la prolongación de la fase de retraso y los cambios de la actividad metabólica en la fase estacionaria. La Figura 4C muestra un aumento definitivo en el tiempo hasta el pico para todas las concentraciones utilizadas. La Figura 4D ilustra la disminución en la tasa metabólica causada por la disminución de la pendiente para todas las concentraciones que generalmente se atribuye a un efecto bactericida. Debido a la muerte inducida por antibióticos de las células bacterianas, se espera que la actividad metabólica sea menor debido a un menor número de bacterias activas presentes. Los datos recogidos están de acuerdo con el hecho de que la rifampicina puede actuar bactericida y bacteriostática, y los datos aquí presentados apoyan principalmente los efectos bactericidas de las concentraciones elegidas.

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Figura 4D: Efecto de la rifampicina en el crecimiento y metabolismo de A. baumannii DSM-30008. (A) Los termogramas mostrados como flujo de calor (W) frente a tiempo (h) para el tipo salvaje (WT) A. baumannii DSM-30008, no tratados y expuestos a rifampicina. (B) Calor acumulado (mJ) vs. tiempo (h). (C) Tiempo de pico (h) con barras de error (desviación estándar). (D) Tasa metabólica (W) con barras de error (desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La concentración de ensayo seleccionada más baja del antibiótico del producto natural (0,25 M) no tiene o sólo efectos marginales en el termograma de A. baumannii DSM-30008. Sin embargo, otras concentraciones probadas presentan algún efecto sobre la duración de la fase de retraso, y afectan al crecimiento hasta la fase estacionaria tardía (Figura 5A). El efecto más evidente es la reducción significativa de la emisión de calor en la fase estacionaria. Los datos mostrados en la Figura 5B muestran claramente que la energía liberada se reduce significativamente para todas las concentraciones efectivas y la pendiente también se reduce. Estos efectos se traducen en una disminución del tiempo hasta el pico (Figura 5C) y, lo que es más importante, se observa una disminución significativa y claramente dependiente de la dosis en la tasa metabólica (Figura 5D). La investigación del nuevo producto natural mixobacteriano reveló un efecto bacteriostático y bactericida combinado.

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Figura 5D: Efecto de un nuevo producto natural antibacteriano en el crecimiento y metabolismo de A. baumannii DSM-30008. (A) Los termogramas mostrados como flujo de calor (W) frente a tiempo (h) para el tipo salvaje (WT) A. baumannii DSM-30008, no tratados y expuestos al producto natural. (B) Calor acumulado (mJ) vs. tiempo (h). (C) Tiempo de pico (h) con barras de error (desviación estándar). (D) Tasa metabólica (W) con barras de error (desviación estándar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Selección de un nuevo experimento en la interfaz de software. En un cuadrado rojo se muestra el paso para seleccionar un nuevo experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 2: Nombrar un nuevo experimento en la interfaz de software. En un cuadrado rojo se representa el paso para nombrar y confirmar el nuevo experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 3: Inicio de un nuevo experimento en la interfaz de software. En un cuadrado rojo se representa el paso para iniciar un nuevo experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 4: La selección del pozo y el inicio de la reacción en la interfaz del software. Se seleccionan todos los pozos de reacción (pozos coloreados en color azul profundo, botón Seleccionar todo representado en un cuadrado rojo) y se selecciona el inicio de reacción (representado en un cuadrado rojo). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 5: Carga correcta del portavasos. Los pozos de referencia se seleccionan (color azul profundo, cuadrado rojo) y los termogramas se muestran en una ventana emergente. Cuando la carga se realiza correctamente, observamos una fuerte disminución en la señal de emisión de calor detectada que debe alcanzar una fase de meseta y permanecer en esta fase durante aproximadamente 2-3 minutos, después la señal vuelve al punto de partida. Cuando esto se observa, la carga del soporte de la taza es correcta. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 6: Fin del experimento. En rojo, se muestra el botón Detener del experimento. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 7: Confirmación del final del experimento. En rojo, se muestra el botón Sí para confirmar el final del experimento en ejecución. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 8: Guardar el archivo de experimento. Se muestra una ventana emergente con las opciones de guardar archivo y en rojo se muestra el botón Guardar. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 9: Interfaz de software. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 10: Acceso a experimentos guardados. En rojo se muestra el botón Abrir experimento para acceder a los experimentos guardados. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 11: Apertura del archivo de experimento seleccionado. En rojo se muestra el botón Abrir. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 12: Vista predeterminada de pozos. Todos los pozos experimentales y los termogramas correspondientes son visibles. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 13: Selección de pozos para análisis. En rojo se muestra el botón Seleccionar todo. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 14: Definición de la línea de base. En rojo se muestra el botón Definir línea base. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 15: Selección de la señal de línea de base. Se selecciona un mínimo de 30 minutos de señal en la fase de retraso (caja roja). Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 16: Guardar cambios en el archivo experimental. En rojo se muestra el botón Guardar. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 17: Aplicación de análisis de calorimetría basada en web. Se muestra la interfaz de software en línea y la ruta de carga de archivos. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 18: Carga del archivo experimental seleccionado. En rojo se muestra el botón Abrir. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura suplementaria 19: Análisis de los termogramas. Los parámetros metabólicos calculados para cada pozo experimental se representan en rojo. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 20: Ajuste de los datos experimentales a modelos de crecimiento teóricos. Los datos de flujo de calor se ajustan a un modelo de crecimiento de Gompertz o De Richard. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 21: Exportación de las medidas. En rojo se muestran los botones Descargar medidas y Guardar. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Discusión

La microcalorimetría isotérmica mide la energía emitida por una muestra a lo largo del tiempo y esta liberación de energía es el resultado de todos los procesos biológicos, físicos y (bio-) químicos. El flujo de calor medido se puede explotar para evaluar o determinar los efectos antibacterianos de las sustancias, ya que permite el monitoreo continuo en tiempo real de la actividad metabólica.

Con el fin de obtener datos fiables para el análisis, las unidades de formación de colonias iniciales (CFU) correctas deben determinarse individualmente para cada especie o cepa utilizada. En caso de que el recuento de UFC sea demasiado bajo, esto conduce a una fase de retraso prolongada, ya que el sistema tarda más en alcanzar una cantidad crítica de biomasa que produce suficiente calor para ser detectado. En caso de que el recuento de UFC sea demasiado alto, la fase de retraso será muy corta, y la cantidad de calor producida puede causar la transferencia de calor a las células del sensor vecinas (pozos de referencia y experimentales) y causar distorsiones de los termogramas. Un alto número de UFC también conducirá a un agotamiento más rápido del oxígeno y cambiará a condiciones anaeróbicas. También hay que tener en cuenta que durante los primeros 30 minutos del experimento, cuando el sistema se está equilibrando, la recopilación de datos no es posible y la grabación real de los efectos se retrasa. Además, la determinación incorrecta de la CFU conduce a una determinación falsa de MIC, afectando en última instancia al experimento y a los cambios observados²⁵. Otro punto crítico es la determinación correcta de la línea de base. Por lo general, la señal de línea base se selecciona durante la fase de retardo cuando la señal de flujo de calor es cero e idealmente, el intervalo de tiempo para la definición de línea base es >30 min. Sin embargo, esto no siempre es posible ya que el tiempo que las bacterias requieren para alcanzar el límite de detección de la señal de calor difiere entre cepas y especies. Algunas especies o cepas requieren más de 30 minutos para alcanzar el límite de detección de la señal de calor, mientras que otras cepas o especies lo alcanzan en los primeros 30 minutos. En ese caso, es posible seleccionar la señal de línea de base al final del experimento cuando todas las señales de calor han vuelto a cero y se mantienen estables. Alternativamente, se pueden utilizar líneas base de otros experimentos con la misma cepa bacteriana, lo que sin embargo no se recomienda.

El sistema permite cierta flexibilidad en términos de diseño y optimización de experimentos y solución de problemas. Los volúmenes utilizados se encuentran en el rango de 100-300 l cuando se utilizan inserciones de plástico y 100-600 l cuando se utilizan vasos de titanio sin las inserciones de plástico. El volumen de trabajo recomendado por el fabricante es de 120 l. El uso de diferentes volúmenes en la configuración de una nueva serie experimental, y al mismo tiempo que se encuentran condiciones óptimas para las mediciones, tiene un impacto principalmente en dos parámetros. Mediante el uso de volúmenes más bajos, la cantidad de compuesto de prueba requerido puede disminuir, que es particularmente importante para los compuestos, que están disponibles sólo en pequeñas cantidades. Además, el volumen utilizado afecta directamente a la disponibilidad de oxígeno durante la medición con volúmenes más bajos aumentando la cantidad de oxígeno disponible necesario para el crecimiento bacteriano. El agotamiento del oxígeno es uno de los principales factores que contribuyen a la duración máxima posible del experimento. Es importante destacar que es posible utilizar medios sólidos, no sólo medios líquidos. Esto es especialmente importante para los microorganismos de crecimiento lento, ya que el crecimiento en la interfaz entre la fase sólida y la fase gaseosa permite un mejor acceso al oxígeno⁹.

IMC es una útil herramienta analítica para descubrir procesos desconocidos con aplicaciones en física, química y biología. El método mide el intercambio de calor dentro de un sistema cerrado y el análisis del intercambio de calor registrado proporciona información adicional que no siempre se puede obtener con métodos estándar. En la investigación de microbiología y antibióticos, una de las mayores ventajas de IMC es su capacidad para distinguir entre células vivas, muertas y insitentes o inactivas, lo que no es posible utilizando métodos de turbidez estándar¹¹. Además, IMC es altamente sensible y puede detectar la emisión de calor de tan sólo 10⁴-10⁵ células⁹. Otra ventaja es que la configuración experimental es rápida y fácil, y permite un seguimiento continuo y en tiempo real con una interferencia mínima o ninguna del usuario. Además, IMC no es destructivo, lo que permite un análisis adicional de las muestras. El análisis de datos permite el desacoplamiento de la formación de biomasa hasta la fase estacionaria exponencial o temprana tardía y la actividad metabólica en fase estacionaria.

Además de las características de aplicación novedosas y emocionantes mencionadas anteriormente, también hay inconvenientes a este método. La principal limitación es que los instrumentos del IMC miden el calor total producido y liberado dentro de un sistema específico, que también incluyen señales no específicas. Esto pone de relieve la importancia de la planificación experimental con los controles adecuados para poder evaluar los cambios de señal de calor que se miden mediante el registro del flujo de calor^9,,20.

En nuestras manos, IMC es una herramienta importante para estudiar los efectos antibacterianos de nuevos productos naturales y para determinar rangos de concentración eficaces. Aparte de los efectos bacteriostáticos y bactericidas diferenciadores, podría utilizarse en el futuro como parte de los estudios de identificación objetivo y la determinación del Ministerio de Defensa. Esto se puede hacer comparando termogramas de diferentes clases de antibióticos con termogramas de nuevos compuestos activos como se muestra aquí. Sin embargo, todavía hay que investigar si ciertos parámetros cuantificables que se pueden extraer de los datos medidos son suficientes para tales comparaciones o si será necesario trabajar en algoritmos que dan huellas dactilares basadas en termogramas completos. Otra posible aplicación en el campo de la investigación de antibióticos es la comparación de los tipos silvestres con los clones resistentes, junto con la secuenciación del genoma completo, que puede ayudar a esclarecer el modo de resistencia (MoR) de los nuevos antibacterianos. Debido a la naturaleza estática del método, la investigación de la eficacia de los nuevos agentes en la formación de biopelículas o en biopelículas ya establecidas podría conducir a una mejor comprensión del proceso biológico y el efecto de los agentes seleccionados en los microbios en diferentes etapas de la latencia. IMC registra la energía total liberada en forma de calor, por lo que es un método adecuado para investigar también los efectos subcons inhibidores de sustancias activas que podrían acoplarse a la transcriptómica. Este método también se puede utilizar en entornos clínicos para detectar la contaminación de muestras o para la determinación de antibiogramas que ayudan a decidir rápidamente sobre el tratamiento definido de los pacientes¹¹.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acinetobacter baumannii	DSMZ	DSM-30008	cepa de referencia utilizada en este estudio
calPlate	Symcel	1220093	placa de 48 pocillos para la inserción de copas de titanio
calScreener	Symcel	1200001	instrumento de microcalorimetría isotérmica
software calView Software	recolección y análisis	Symcel
calWell	Symcel	1901004	placa de 48 pocillos de grado microbiológico (no activo) con insertos de plástico que se insertan en las tazas de titanio
agar CASO	Carl Roth	X937.1	aislamiento y cultivo de microorganismos
Cloroanfenicol	Sigma-Aldrich	C0378	antibiótico
Ciprofloxacina	Sigma-Aldrich	17850	antibiótico
Cubetas	Marca	759015	Cubetas de 1,5 mL
Asas de inoculación desechables	Sarsted	86.1562.050	10 µ Asas de inoculación L
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	85190
Tubos Eppendorf	Eppendorf		30120086 1,5 mL Tubos Eppendorf Safe-Lock
Etanol	Thermo Fisher Scientific	10428671
Tubos Falcon	Sarsted	62.554.502	15 mL tubos
falcon Clorhidrato (HCL)	Thermo Fisher Scientific	10316380
Metanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500
Caldo Mueller Hinton	Medio líquido Sigma-Aldrich	70192	para estudios de susceptibilidad
Caldo Mueller Hinton II medios ajustados a cationes	Sigma-Aldrich	90922	Caldo Mueller Hinton catión ajustado a 1,25 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2
Placas de Petri	LABSOLUTE 7696404
Pipeta 100 - 1000 µ Marca L		705880
Pipeta 2 - 20 y micro; Marca L		705872
Pipeta 20 - 200 µ Marca L		705878
Puntas de pipeta 100 - 1000 L	Marca	732032
Puntas de pipeta 2 - 200 µ Marca L		732028
Sulfato de polimixina B	Sigma-Aldrich	P0972	antibiótico
Rifampicina	Sigma-Aldrich	R3501	Antibiótico
Pipeta serológica	Thermo Fisher Scientific	170356N	10 mL Pipeta serológica Nunc
Espectrofotómetro	Eppendorf AG	6135 000.017
Filtros estériles	Minisart	16534----------K	0.2 y micro; m Tamaño de poro Filtros estériles
Jeringa 50	mL NORM-JECT	22778
Tetraciclina	Sigma-Aldrich	87128
antibiótico Vasos de titanio	Symcel	1220089	insertados en 48 pocillos calPlate
de titanio Tapas de titanio	Symcel	1220091	atornilladas y ajustadas a las copas de titanio
Trimethroprim	Sigma-Aldrich	T7883	antibiótico
Pinzas	Symcel	1900602