Summary
Præsenteret her er en protokol for kryogen overførsel af frosne prøver i den dynamiske nukleare polarisering (DNP) magiske vinkel spinning (MAS) nukleare magnetiske resonans (NMR) sonde. Protokollen indeholder anvisninger til rotorlagring forud for eksperimentet og anvisninger for levedygtighedsmålinger før og efter forsøget.
Abstract
Dynamisk nuklear polarisering (DNP) kan dramatisk øge følsomheden af magiske vinkel spinning (MAS) nukleare magnetiske resonans (NMR) spektroskopi. Disse følsomhedsgevinster stiger, efterhånden som temperaturerne falder, og er store nok til at gøre det muligt at studere molekyler ved meget lave koncentrationer ved driftstemperaturerne (~100 K) for de fleste kommercielle DNP-udstyrede NMR-spektrometre. Dette fører til muligheden for in-cell strukturel biologi på kryopreserverede celler til makromolekyler på deres endogene niveauer i deres oprindelige miljøer. De frysehastigheder, der kræves for cellulær kryopræservering, overskrides dog under typisk prøvehåndtering for DNP MAS NMR, og dette resulterer i tab af cellulær integritet og levedygtighed. I denne artikel beskrives en detaljeret protokol for tilberedning og kryogen overførsel af en frossen prøve af pattedyrceller til et MAS NMR-spektrometer.
Introduction
Indførelsen af dynamisk nuklear polarisering for magiske vinkel spinning nukleare magnetiske resonans spektroskopi kan øge følsomheden af MAS NMR med flere størrelsesordener. Dette har gjort det muligt at påvise biomolekyler ved eller i nærheden af deres fysiologiske koncentrationer. DNP kan og giver den følsomhed, der kræves for at påvise et isotopisk mærket protein ved endogene (~1 μM) koncentrationer i komplekst biologisk miljø1. Da der findes veletablerede protokoller om at indføre isotopisk mærkede molekyler i umærkede pattedyrsceller uden at påvirke deres levedygtighed, åbner dette mulighed for at studere istopisk berigede biomolekyler på deres endogene niveauer i deres oprindelige miljø. Da DNP-forbedringer desuden er mere effektive ved lavere temperaturer2,3,4, flugter de eksperimentelle temperaturer for DNP MAS NMR pænt med dem, der kræves til langtidsopbevaring af levedygtige pattedyrceller5. Den konventionelle metode til overførsel af en prøve til et DNP MAS NMR-spektrometer udsætter den imidlertid for temperaturudsvingshastigheder, der brister pattedyrsceller.
MAS NMR-eksperimenter kræver, at prøven roteres om den magiske vinkel ved frekvenser, der er lig med eller større end størrelsen af den anisotropiske interaktion, for at den kan beregnes til nul, typisk mindst 4 kHz og ofte meget højere6,7,8,9. Prøver pakkes derfor ind i rotorer, der har en finned spids, der bruges til at drive rotorens rotation med en strøm af gas og har et mærke i den anden ende, så rotationsfrekvensen kan overvåges af et omdrejningstæller. Prøveoverførsel for de fleste MAS NMR-instrumenter opnås ved at injicere rotoren fra instrumentets yderside ind i statoren i slutningen af NMR-sonden med en strøm af tør luft eller nitrogengas. Når rotoren når statoren, som holder rotoren i den magiske vinkel, drives prøverotationen af en luftturbinemekanisme. Separate strømme af gasstøtte, fremdrive og styre temperaturen på rotoren. Indsættelse af en rotor i NMR-spektrometeret og opnåelse af stabil MAS-spinding kræver fint bearbejdede drevspidser og stram kontrol af temperaturen og trykket i de separate gasstrømme. På trods af disse tekniske krav er indsættelse og opnåelse af stabil MAS stort set automatiseret til kommercielle MAS NMR-sonder til rumtemperaturapplikationer.
Situationen er dog mere kompliceret for applikationer med lav temperatur. Prøver til lavtemperaturapplikationer indsættes typisk i spektrometeret ved stuetemperatur og nedfryses i statoren. I det første minut falder prøvetemperaturen hurtigt (> −100 °C/min),og systemtemperaturen kræver flere minutter at ekvilibrere. På grund af samspillet mellem temperatur og tryk håndteres indsættelse og nærmer sig den ønskede MAS ofte manuelt til lavtemperaturapplikationer. På trods af kravet om manuel indgriben er frysning af rotoren inde i instrumentet gavnlig, fordi den minimerer indførelsen af vand og kondens i sonden, hvilket er afgørende for vellykket spinding. Ikke alene kan kondens og isophobning fra omgivende fugt blokere gasledninger, kondens, eller frost på rotoren selv kan mekanisk forhindre MAS. Prøver til lavtemperatur MAS NMR fryses således typisk inde i instrumentet med hastigheder, der overstiger -100 °C/min.
Pattedyrceller kan bevare deres integritet gennem en fryse-optøningscyklus, hvis afkølingen er langsom5,10,11,12, med en hastighed, der er lig med eller langsommere end 1 °C/min. Alternativt bevarer cellerne også deres integritet, hvis kølehastigheden er ultrahurtig13,14,15, med en hastighed, der er hurtigere end 104 °C/min. Satser mellemliggende til disse to ekstremer brud og dræbe pattedyr celler på grund af is krystal dannelse både i og uden for cellerne, selv i nærværelse af kryobeskyttende midler16. Prøvekølingshastighederne for en rumtemperaturrotor inde i en forkølet sonde falder mellem disse to yderpunkter, således at man studerer kryogent bevarede intakte levedygtige pattedyrceller, prøverne skal fryses, før de overføres til instrumentet og overføres til instrumentet uden temperaturudsving, der kan beskadige prøven eller ophobningen af frost på rotoren, der kan forhindre rotoren i at rotere. Protokollen beskriver en metode til frostfri, forkølet rotorindsættelse i et kryogen MAS NMR-system til undersøgelse af kryogent bevarede intakte levedygtige pattedyrscelleprøver. Den kryogene prøveoverførsel, der er beskrevet her, blev udviklet til NMR-karakterisering af levedygtige intakte celler. Det gælder dog for ethvert system, hvor temperaturudsving kan kompromittere prøvens integritet. Dette omfatter enhver række komplekse systemer, såsom fryse slukkede reaktioner for kemisk og strukturel karakterisering af fanget reaktion mellemprodukter17,18, enzymologi19,20 eller protein foldning21,22.
Protocol
1. Kultur og kryoprotektion af pattedyrsceller
- Kultur og høst af pattedyrsceller
- Optø en aliquot af frosne menneskelige embryonale nyreceller (HEK 293).
- Kultur HEK 293 celler i vækstmedier (f.eks. DMEM med 10% føtalt kvægserum og 1% Pen-Strep) ved 37 °C med 5% CO2 i 100 mm plader i to til tre passager (7-10 dage).
- Split cellerne og kulturen i en 150 mm plade, indtil cellerne når 90-95% sammenløb.
BEMÆRK: En 150 mm plade ved > 90% sammenløb vil være tilstrækkelig til at fylde to safirrotorer med en diameter på 3,2 mm. - Høst celler ved hjælp af 4 mL trypsin (se materialetabel)og 10 mL medier. Suspensionen overføres til en steril 15 mL konisk og centrifuge ved 673 x g (1000 omdrejninger i minuttet) i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten.
- Cellepillen vaskes med fosfatbufferet saltvand (PBS) (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2).
- Cryoprotection af celler
- Der opsamles en 50 μL cellepille i et mikrocentrifugerør. Der fremstilles en blanding af 50 μL PBS og 18 μL glycerol i et separat rør.
- Bland forsigtigt 50 μL cellepille med 68 μL glycerol-PBS-blanding ved at tilsætte glycerol-PBS-blandingen til toppen af pellet'en og genbruge pellet'en ved forsigtigt at trykke på siden af røret, indtil der ikke er klumper tilbage.
BEMÆRK: Blid pipetting kan også bruges til at genbruge cellen, men sørg for, at cellulær integritet ikke kompromitteres.
2. Kryopræservering af pattedyrceller i en NMR rotor
- Overførsel af celler til en 3,2 mm safirrotor.
- For at lave en tragt skal du skære en 200 μL pipettespids og indsætte den smalle ende af den afskårne pipettespids i 3,2 mm rotoren.
- Overfør cellerne til tragten, der sidder på rotoren. Placer rotoren sammen med tragten i et mikrocentrifugerør, og pellet cellerne i bunden af rotoren ved centrifugering ved 673 x g i 2-3 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og eventuel overskydende prøve fra rotoren. Gentag disse to trin, indtil rotoren er fuldt pakket med cellerne.
BEMÆRK: Det er eventuelt muligt at bestemme prøvens cellulære levedygtighed inden frysning. 10 μL af den overskydende cellepille i 100 μL FBS-fri DMEM. 10 μL af suspensionen blandes med en 0,4% trypanblå opløsning, og der foretages straks en vurdering af levedygtigheden ved hjælp af en automatiseret celletæller. Brug kun FBS frie medier til at fortynde celler som serum forstyrrer trypan blå farvning. - Forsegl rotoren med et siliciumstik ved hjælp af det kommercielt tilgængelige pakkeværktøj.
- Luk rotoren med en keramisk drevspids ved at trykke den lodret nedad. Undgå at røre ved de sarte finner på siden af drevspidsen.
- Marker halvdelen af safirrotorens nederste kant med en permanent sølvmarkør og den anden halvdel af rotorens nederste kant med en sort permanent markør for at muliggøre nøjagtig overvågning af rotationen af rotoren inde i spektrometeret.
BEMÆRK: Ufuldkommenheder i mærkningen af rotoren forhindrer nøjagtig optælling af spindingfrekvensen, hvilket resulterer i, at det ikke lykkes at opnå stabil spinding. Da markører ikke vil skrive på en frossen rotor, og rotoropvarmning kompromitterer prøveintegriteten, er det et kritisk skridt at markere rotoren før frysning.
- Kryopræservering af celler inde i en 3,2 mm safirrotor.
- Placer en pude lavet af et stykke væv eller køkkenrulle under låget og i bunden af kryogent hætteglas (se Materialeoversigt).
BEMÆRK: Silkepapiret beskytter rotormarkeringen mod skader, der opstår ved at støde mod siderne af kryogene hætteglas. - Placer 3,2 mm safirrotoren i kryogent hætteglasset polstret med silkepapiret med markeret ende mod bunden af kryogent hætteglas.
- Rotoren fryses langsomt ved at anbringe kryogene hætteglasset i kølebeholderen (-1 °C/min) og anbringe beholderen i fryseren på -80 °C i mindst 3 timer.
- Det kryogene hætteglas, der indeholder den frosne rotor, overføres til flydende nitrogenopbevaring.
- Placer en pude lavet af et stykke væv eller køkkenrulle under låget og i bunden af kryogent hætteglas (se Materialeoversigt).
3. Kryogen overførsel af en frossen prøve til NMR-spektrometeret
- Transporter den frosne prøve til NMR-anlægget.
- Det kryogene hætteglas, der indeholder den frosne rotor, overføres til en lille dewar fyldt med flydende nitrogen til transport til NMR-anlægget.
- Overførsel af frossen rotor til det flydende nitrogenbad.
- Fyld en tør, termisk isoleret bred mund skum dewar med 500 mL - 1 L flydende nitrogen.
- Overfør rotoren fra kryogene hætteglasset til den brede mund skum dewar fyldt med flydende nitrogen.
- Tag kryogent hætteglas fra overførselsafkølen i hånden og hold det lige over overfladen af det flydende nitrogen for at beskytte det mod atmosfæren.
- Mens du holder kryogent hætteglasset med munden peger lidt nedad, skru hætten og lad rotoren glide ind i flydende nitrogenbad.
BEMÆRK: Når hætten er skruet af, skal rotoren hurtigt falde ned fra kryogent hætteglasset i det flydende nitrogenbad (under 1 sekund) for at forhindre kondens på rotoren. Fordampningen af flydende nitrogen danner en "nitrogensky" i den brede mundskumsafvaring og forhindrer kondens på rotoren, før den nedsænkes i det flydende nitrogen. Længere udsættelse af rotoren for luft kan føre til kondensering af fugt på rotorvægge, som vil kondensere i is igen.
- Kryogen overførsel af rotor til NMR prøvefanger.
- Prechill et 1,5 mL mikrocentrifugerør ved at nedsænke det i det flydende nitrogenbad. Luk ikke røret.
BEMÆRK: Undersøg rotoren, før den overføres til mikrocentrifugerøret. Brug pincet til at holde rotoren lige under overfladen af det flydende nitrogen og kontroller, at rotormarkeringerne er intakte, at der ikke er dannet isaflejringer på dens vægge, og at drevspidsen er intakt. Iskrystalaflejringer på rotorvæggene fremstår som hvidt pulver. Vær omhyggelig med altid at holde rotoren ved kroppen og ikke ved drevspidsen. Skrab ikke mærkningen af rotoren med pincetspidserne. - Under overfladen af det flydende nitrogenbad skal du bruge pincet til at overføre rotoren til mikrocentrifugerøret med drevspidsen mod bunden af mikrocentrifugerøret og markeringerne mod åbningen af røret.
BEMÆRK: Tør altid pincet, før du nedsænker flydende nitrogen eller rører rotoren. - Brug pincet til at holde røret, der indeholder rotoren, under flydende nitrogen ved halsen.
- Med et andet par pincet i hånden skal du være forberedt på at nedsænke NMR-prøvefangeren i det flydende nitrogenbad og holde den, så den hælder i en spids vinkel med hensyn til mikrocentrifugerøret.
BEMÆRK: Minimer den tid, prøvefangeren er i kontakt med det flydende nitrogen, for at undgå frysning af O-ringen. Hvis O-ringen fryser, vil det være meget vanskeligt at indsætte catcheren i spektrometeret.
- Prechill et 1,5 mL mikrocentrifugerør ved at nedsænke det i det flydende nitrogenbad. Luk ikke røret.
- Kryogen rotoroverførsel fra NMR-prøvefangeren til NMR-spektrometer
BEMÆRK: Dette trin kræver to personer, en til at betjene cryocabinet og en til at overføre prøven fra det flydende nitrogen ind i sonden.- Placer kryoabinet i udslyngningstilstand ved at trykke på 'EJECT' på kabinettet.
BEMÆRK: Udslyngningstilstanden renser den tørre og kolde nitrogengasstrøm ved højt tryk fra sonden til atmosfæren for at forhindre indtrængen af atmosfærisk fugt. - Overfør rotoren til NMR-prøvefangeren.
- Sæt den åbne ende af NMR-prøvefangeren i mikrocentrifugerøret, mens den stadig er under overfladen af det flydende nitrogen.
- Løft både mikrocentrifugerøret og NMR-prøvefangeren op, så rotoren kan falde ned i prøvefangeren. Ryst NMR-prøvefangeren og mikrocentrifugerøret, hvis rotoren sidder fast på kanten af prøvefangeren.
- Lad det tomme mikrocentrifugerør være oven på NMR-prøvefangeren for at beskytte rotoren mod luft.
- Fjern den anden tomme NMR prøvefanger fra sonden og læg den på gulvet.
- Overfør NMR-prøvefangeren, der indeholder rotoren, til den frie hånd, fjern mikrocentrifugerøret, og sæt det straks ind i sonden.
BEMÆRK: Hvis O-ringen fryser, vil det være vanskeligt at stramme prøvefangeren. Fortsæt med at anvende kraft, indtil den glider på plads. - Signal den person, der driver cryocabinet, til 'STOP EJECT' og 'INSERT'.
BEMÆRK: Indsætningstilstanden guider rotoren fra prøvefangeren ind i sonden. - Prøven drejes op til den ønskede spindingshastighed (f.eks. 12 kHz) ved at justere det leje- og kørselstryk, der styres af kryokraabinet. (f.eks. øges lejegassen straks til ~200 mBar og drivgassen til 10 mBar. Når prøven drejer, skal du øge lejegassen til 1000 mBar og køre gas til 200 mBar. Efterhånden som spinding stabiliseres, øges lejet til 2400 mBar, og der derefter øges drevgassen fra 200 mBar til 1700 mBar over flere minutter. VT kølegas er konstant på ~ 1070 L / h.)
BEMÆRK: Når du løfter mikrocentrifugerøret og NMR-prøvefangeren ud af det flydende nitrogenbad, skal du sørge for, at mikrocentrifugerøret har nok flydende nitrogen inde i det til at omgive rotoren. Minimer tiden mellem overførsel af rotoren til NMR-prøvefangeren og indsættelse af NMR-prøvefangeren i spektrometeret. Alle trin i 3.4 skal være afsluttet inden for 30 s.
- Placer kryoabinet i udslyngningstilstand ved at trykke på 'EJECT' på kabinettet.
4. Kryogen fjernelse af prøven fra NMR-spektrometeret
- Forberedelse af det flydende nitrogenbad og kryogenglas
- Hæld 500 mL - 1 L flydende nitrogen i den brede mund skum dewar og læg badet under spektrometeret.
- Forkøl kryogene hætteglasset. Det tomme kryogene hætteglas, der indeholder et stykke silkepapir i det flydende nitrogenbad, nedsænkes.
- Kryogen overførsel af rotor fra sonde til kryogent hætteglas
- Reducer spindingshastigheden til 0 kHz ved at rampe ned i kørsels- og lejegasstrømmen og skubbe rotoren ud ved at skifte til udslyngningstilstanden.
- Hold udslyngningstilstanden tændt, fjern prøvefangeren fra sonden, smid rotoren direkte ind i den brede mundskumsafvar, der indeholder flydende nitrogen.
- Ved hjælp af forkølet pincet overføres rotoren til forkølet kryogent hætteglas under overfladen af det flydende nitrogen.
- Cap kryogene hætteglas. Prechill kryogene hætteglas hætte ved at dyppe det i flydende nitrogen. Fjern kryogent hætteglas, der indeholder rotoren og flydende nitrogen, fra badet, og hætten røret med prechilled cap. Stram ikke hætten, så fordampning af nitrogen kan frigives sikkert.
- Nedsænk kryogene hætteglasset i flydende nitrogen igen. Prøven kan overføres til længerevarende opbevaring af flydende nitrogen eller pakkes ud med det samme til yderligere analyse.
5. Udpakning af rotor- og levedygtighedsmålinger
- Udpakning af rotor og målbarhed
- Forvarme serumfrie medier (DMEM) eller PBS til 37 °C.
- Fjern rotoren fra flydende nitrogen. Fjern drevspids og siliciumstik.
BEMÆRK: Sapphire er en fremragende varmeleder. Undgå at røre rotoren med fingrene, da varmeoverførsel kan forårsage lokale fryse-optø hændelser, der kompromitterer cellulær levedygtighed.
- Måling af levedygtighed
- Der tilsættes 20 μL varme medier til den frosne cellepille i rotoren og genanvendelige celler. Affjedringen fjernes med en pipette, og affjedringen blandes med 100 μL medier.
- 10 μL celleaffjedring fjernes, og der blandes med et tilsvarende volumen på 0,4% trypanblå opløsning (v/v). Inkuber ved stuetemperatur i 30 s til 1 min.
- Mål levedygtigheden ved hjælp af automatiseret celletæller.
Representative Results
Kryogen indsættelse af præfrosne prøver af pattedyrceller i NMR-spektrometeret understøtter levedygtighed under hele NMR-eksperimentet. Skemaer over kryogen overførsel af en frossen prøve til en forkølet NMR-sonde er vist i figur 1. Cellulær levedygtighed og intakthed kan vurderes ved hjælp af en række forskellige metoder. Her brugte vi et standard farvestofbaseret mål for membranintegritet, som flugter godt med andre metoder23. Intakte celler er uigennemtrængelige for trypanblå, mens celler med kompromitteret membranintegritet er gennemtrængelige. Antallet af trypanblå gennemtrængelige og uigennemtrængelige celler kan hurtigt vurderes ved hjælp af en automatiseret celletæller. Ved hjælp af den her beskrevne protokol svarer prøvepanblå permeabilitet af pattedyrceller efter MAS NMR (dvs. punkt 5.2.3) til prøvepanblå permeabilitet af pattedyrceller før enhver temperaturændring (dvs. punkt 2.1.3). Men hvis cellerne er langsomt frosne, derefter opvarmet til stuetemperatur før indsættelse (dvs. efter protokollen til punkt 3, før rotoren opvarmes til stuetemperatur, før de indsættes i den kølede sonde), falder cellulær levedygtighed som vurderet ved trypanblå til mindre end 10% af cellerne (Figur 2). Således resulterer frysning af celler inde i spektrometeret i tab af cellulær membranintegritet, mens kryogen indsættelse af frosne prøver af pattedyrceller understøtter cellegabilitet under hele NMR-eksperimentet.
Figur 1: Skematisk kryogen overførsel af en frossen prøve til en forkølet NMR-sonde. (A) Nærme overfladen af det flydende nitrogen og skrue toppen af kryogene hætteglasset. (B) Skub rotoren ind i det flydende nitrogenbad. (C) Nedsænke et mikrocentrifugerør ved hjælp af pincet og holde det på plads, indtil det køler helt af. (D) Sæt rotoren i mikrocentrifuge med drevspidsen mod bunden af røret. Skub, snarere end grab, med pincet. (E) Hold mikrocentrifugerøret lige under overfladen af det flydende nitrogenbad, og undersøg rotoren visuelt for at sikre, at den er frostfri og godt mærket. (F) Hold prøvefangeren i en vinkel over overfladen. g) Løft prøvefangeren og røret ud af det flydende nitrogen, så snart prøvefangeren er inde i mikrocentrifugerøret. (H) Ryst prøvefangeren, hvis rotoren er fanget på fælgen. (I) Fjern den tomme prøvefanger fra sonden og læg den på jorden. (J) Fjern mikrocentrifugerøret fra prøvefangeren med rotoren indeni, sæt prøvefangeren i sonden, og tryk på "INSERT" på kontrolkonsollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kryogen indsættelse af en forfrosset prøve af pattedyrceller resulterer i målinger af cellulær intakthed, der ligner pattedyrscellerprøver, der aldrig er blevet frosset. Procentdelen af trypanblå uigennemtrængelige celler for prøver, der aldrig er blevet frosset (f.eks. trin 2.1.3), svarer til celle for prøver efter MAS NMR (f.eks. trin 5.2.3 med 12 kHz MAS). Langsomme frosne celler (f.eks. trin 3), der blev opvarmet til stuetemperatur før indføring i NMR-instrumentet, der var blevet forkølet til 100 K, havde meget lavere procentdele af intakte celler efter MAS NMR med 12 kHz MAS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den kryogene overførsel af frosne prøver til et NMR-spektrometer har held til at bevare levedygtigheden af frosne pattedyrceller gennem NMR-dataindsamlingen. Denne metodes succes fremgår af målinger af levedygtigheden før og efter MAS NMR. Denne fremgangsmåde er vellykket og generaliserbar for ethvert system, hvor temperaturudsving kan kompromittere prøveintegriteten. Den aktuelt præsenterede protokol udføres med HEK 293-cellelinjen. Da kryopræserveringsbetingelserne for mange pattedyrscellelinjer er meget ens, er det sandsynligt, at de her rapporterede tilstande kan oversættes til andre cellulære systemer; de kan dog kræve yderligere optimering af kryobeskyttere, prøvemængder og frysehastigheder for at opnå de samme resultater.
Denne metode kan forbedres ved at pakke rotoren hurtigere ud efter NMR-eksperimentet. Dette trin er i øjeblikket sub optimalt, og dets udførelse påvirker cellernes levedygtighed. Før cellerne kan genbruges i medier, skal drevspidsen og siliciumproppen fjernes fra rotoren. Prøven optøs ujævnt, når rotoren holdes under fjernelse af drevspidsen og siliciumproppen, så kortere rotorhåndteringstider resulterer i højere viabilities. Udviklingen af rotorholdere eller andre værktøjer til at lette ensartet optøning og hurtig fjernelse af drevspidsen og siliciumproppen vil hjælpe med at gøre vurderingen af levedygtigheden efter NMR mere nøjagtig.
Den tilgang til kryogen prøvebelastning, der er beskrevet i denne artikel, er begrænset til NMR-sonder, der understøtter indsættelse og udslyngning af prøver med sonden på plads i NMR-magnetens boring. Mens ekstern prøveindsætning og udslyngning er standard for kommercielle DNP-systemer, har brugerdefinerede sonder ikke altid denne mulighed. Denne tilgang til kryogen prøvebelastning kan også kræve en vis ændring for NMR-sonder, der er bygget til at være kompatible med rotorer i forskellige størrelser. Denne protokol er optimeret til 3,2 mm rotorer og kan kræve ændring, hvis prøvefangerens ydre diameter overstiger den indre diameter af et mikrocentrifugerør (f.eks. trin 3.4.2).
Med anvendelsen af DNP til MAS NMR er det nu muligt at detektere proteiner og andre biomolekyler ved endogene fysiologiskekoncentrationer 24,25,26. Dette åbner mulighed for at studere biomolekyler i deres oprindelige miljøer. Opretholdelse af cellulær integritet og levedygtighed under hele forsøget vil sandsynligvis være afgørende for at forbinde spektroskopiens eksperimentelle resultater med biologiske fænomener. Ukontrolleret frysning af prøver , der indeholder rensede proteiner eller cellulære lysater , kompromitterer typisk ikke prøvekvalitet7,27, selv om der er tegn på , at frysehastigheden kan være en vigtig variabel selv i rensede systemer28. Prøver af pattedyrceller skal dog nedfryses i kontrolleret hastighed, hvis det er vigtigt for fortolkningen at bevare cellulær intakthed og levedygtighed. Her præsenterer vi en protokol for frysning og overførsel af frosne prøver af pattedyrceller til et forkølet DNP MAS NMR-instrument, der undgår potentielt skadelige temperaturudsving og understøtter måling på levedygtige celler.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Cancer Research Prevention &Research Institute of Texas [RR150076], National Science Foundation [1751174]; National Institutes of Health [NS-111236], Welch Foundation [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Foundation, Ted Nash Long Life Foundation og Kinship Foundation (Searle Scholars Program) til K.K.F.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
| 100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
| 3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
| 45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
| AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
| Black and Silver marker | Sharpie | ||
| Cap removal tool | Bruker | HZ16913 | |
| Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
| Ceramic cap | Cortecnet | HZ12372 | |
| CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
| Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
| d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
| Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| DNP NMR system with frequency-matched gyrotron | Bruker | ||
| Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
| Kimwipes | Kimwipes | ||
| Packing tool | Bruker | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
| Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Silicon plug | Bruker | B7089 | |
| Standard Vessel forceps | |||
| Tryp-L | Gibco | 12605010 |
References
- Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
- Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
- Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
- Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
- Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
- Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
- Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
- Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
- Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
- Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
- Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
- Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
- Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
- Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
- Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928 (2015).
- Pegg, D. E.
- Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
- Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717 (2019).
- Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
- Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
- Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
- Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
- Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D.
- Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
- Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
- Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
- Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
- Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).
