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Biology

क्रायोजेनिक नमूना लोड िंग एक मैजिक एंगल कताई परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोमीटर में जो सेलुलर व्यवहार्यता को बरकरार रखता है

Published: September 1, 2020 doi: 10.3791/61733
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Disease and Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (डीएनपी) जादू कोण कताई (MAS) परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) जांच में जमे हुए नमूनों के क्रायोजेनिक हस्तांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल है । प्रोटोकॉल में प्रयोग से पहले रोटर भंडारण के लिए निर्देश शामिल हैं और प्रयोग से पहले और बाद में व्यवहार्यता माप के लिए निर्देश।

Abstract

गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण (डीएनपी) नाटकीय रूप से जादू कोण कताई (MAS) परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी की संवेदनशीलता को बढ़ा सकता है। तापमान में कमी के रूप में ये संवेदनशीलता लाभ में वृद्धि होती है और अधिकांश वाणिज्यिक डीएनपी-सुसज्जित एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के ऑपरेटिंग तापमान (~ 100 K) पर बहुत कम सांद्रता पर अणुओं के अध्ययन को सक्षम करने के लिए काफी बड़ी होती है। इससे उनके मूल वातावरण में अपने अंतर्जात स्तरों पर मैक्रोमॉलिक्यूल्स के लिए क्रायोप्रेरेवित कोशिकाओं पर इन-सेल संरचनात्मक जीव विज्ञान की संभावना होती है। हालांकि, सेलुलर क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए आवश्यक फ्रीजिंग दरें डीएनपी एमएएस एनएमआर के लिए विशिष्ट नमूना हैंडलिंग के दौरान पार हो जाती हैं और इसके परिणामस्वरूप सेलुलर अखंडता और व्यवहार्यता की हानि होती है। यह लेख एमएएस एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में स्तनधारी कोशिकाओं के जमे हुए नमूने की तैयारी और क्रायोजेनिक हस्तांतरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Introduction

जादू कोण कताई परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए गतिशील परमाणु ध्रुवीकरण की शुरूआत परिमाण के कई आदेशों से MAS एनएमआर की संवेदनशीलता को बढ़ा सकती है । इससे उनकी शारीरिक सांद्रता पर या उसके पास जैव अणुओं का पता लगाने में सक्षम हो गया है। DNP जटिल जैविक वातावरण1में अंतर्जात (~ 1 माइक्रोन) सांद्रता पर आइसोटोपिकल रूप से लेबल प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता प्रदान कर सकता है और प्रदान करता है। क्योंकि उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना अवेलेबल स्तनधारी कोशिकाओं में आइसोटोपिकल लेबल वाले अणुओं को पेश करने के लिए अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल हैं, यह उनके मूल वातावरण में अपने अंतर्जात स्तर पर आइसोटोपिक रूप से समृद्ध जैव अणुओं का अध्ययन करने की संभावना को खोलता है। इसके अलावा, क्योंकि डीएनपी संवर्द्धन कमतापमान2,3,4पर अधिक कुशल होते हैं, इसलिए डीएनपी एमएएस एनएमआर के लिए प्रायोगिक तापमान व्यवहार्य स्तनधारी कोशिकाओं के दीर्घकालिक भंडारण के लिए आवश्यक लोगों के साथ बड़े करीने से संरेखित होता है5। हालांकि, एक नमूना को डीएनपी एमएएस एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में स्थानांतरित करने की पारंपरिक विधि यह तापमान में उतार-चढ़ाव दरों के अधीन है जो स्तनधारी कोशिकाओं को टूटना है।

एमएएस एनएमआर प्रयोगों के लिए आवश्यक है कि नमूने को एनिसोट्रोपिक इंटरैक्शन के परिमाण के बराबर या उससे अधिक आवृत्तियों पर जादू कोण के बारे में घुमाया जाए, जो आमतौर पर कम से कम 4 किलोहर्ट्ज और अक्सर कम से कम6,7,8,9से अधिक होता है। इसलिए, नमूनों को रोटर में पैक किया जाता है जिसमें एक फिन्ड टिप होता है जिसका उपयोग गैस की धारा द्वारा रोटर के घूर्णन को चलाने के लिए किया जाता है और दूसरे छोर पर एक निशान होता है ताकि रोटेशन आवृत्ति की निगरानी टैकोमीटर द्वारा की जा सके। अधिकांश एमएएस एनएमआर उपकरणों के लिए नमूना हस्तांतरण शुष्क हवा या नाइट्रोजन गैस की धारा के साथ एनएमआर जांच के अंत में उपकरण के बाहरी से स्टेटर में रोटर इंजेक्शन द्वारा पूरा किया जाता है। रोटर के स्टेटर तक पहुंचने के बाद, जो जादू कोण पर रोटर रखता है, नमूना रोटेशन एक एयर टरबाइन तंत्र द्वारा चालित होता है। गैस समर्थन की अलग धाराएं, रोटर के तापमान को प्रेरित और नियंत्रित करें। एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में एक रोटर डालने और स्थिर MAS कताई को प्राप्त करने के लिए पतले मशीन ड्राइव सुझावों और तापमान और गैस की अलग धाराओं के दबाव के तंग नियंत्रण की आवश्यकता है । इन तकनीकी मांगों के बावजूद, प्रविष्टि और स्थिर MAS प्राप्त करने के लिए काफी हद तक कमरे के तापमान अनुप्रयोगों के लिए वाणिज्यिक MAS एनएमआर जांच के लिए स्वचालित हैं ।

हालांकि, कम तापमान अनुप्रयोगों के लिए स्थिति अधिक जटिल है। कम तापमान अनुप्रयोगों के लिए नमूने आम तौर पर कमरे के तापमान पर स्पेक्ट्रोमीटर में डाला जाता है और स्टेटर में जमे हुए। पहले मिनट में सैंपल का तापमान जल्दी कम हो जाता है (>−100 डिग्री सेल्सियस/मिनट) और सिस्टम के तापमान को बराबरी करने के लिए कई मिनट की जरूरत होती है । तापमान और दबाव के परस्पर क्रिया के कारण, वांछित MAS के सम्मिलन और आ अक्सर कम तापमान वाले अनुप्रयोगों के लिए मैन्युअल रूप से संभाला जाता है। मैनुअल हस्तक्षेप के लिए आवश्यकता के बावजूद, उपकरण के अंदर रोटर को ठंडा करना फायदेमंद है क्योंकि यह जांच में पानी और संघनन की शुरूआत को कम करता है, जो सफल कताई के लिए महत्वपूर्ण है। न केवल संघनन और बर्फ का निर्माण कर सकते है परिवेश नमी ब्लॉक गैस लाइनों, संघनन, या रोटर पर ठंढ से ही यंत्रवत् MAS को रोका जा सकता है । इस प्रकार, कम तापमान MAS एनएमआर के लिए नमूने आम तौर पर -100 डिग्री सेल्सियस/मिनट से अधिक दरों पर उपकरण के अंदर जमे हुए हैं।

स्तनधारी कोशिकाएं फ्रीज-गल चक्र के माध्यम से अपनी अखंडता को बनाए रख सकती हैं यदि ठंडा5,10,11,12, 1डिग्री सेल्सियस/मिनट के बराबर या धीमी दर पर धीमा है। वैकल्पिक रूप से कोशिकाएं भी अपनी अखंडता बनाए रखती हैं यदि ठंडा दर अल्ट्रा-फास्ट13,14,15है, जो 104 डिग्री सेल्सियस/मिनट से तेज दर पर है। इन दो चरम सीमाओं के मध्यवर्ती दरों टूटना और दोनों कोशिकाओं के अंदर और बाहर बर्फ क्रिस्टल गठन के कारण स्तनधारी कोशिकाओं को मारने, यहां तक कि क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंटों की उपस्थिति में16। इन दो चरम सीमाओं के बीच एक पूर्व-ठंडा जांच गिरावट के अंदर एक कमरे के तापमान रोटर के लिए नमूना ठंडा दर, इस प्रकार क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित अक्षुण्ण व्यवहार्य स्तनधारी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, नमूनों को उपकरण में स्थानांतरित करने से पहले जमे हुए होना चाहिए और तापमान में उतार-चढ़ाव के बिना उपकरण में स्थानांतरित किया जाना चाहिए जो रोटर पर ठंढ के नमूने या संचय को नुकसान पहुंचा सकता है जो रोटर को कताई से रोक सकता है। प्रोटोकॉल क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित अक्षुण्ण व्यवहार्य स्तनधारी कोशिका नमूनों के अध्ययन के लिए क्रायोजेनिक एमएएस एनएमआर प्रणाली में ठंढ मुक्त, पूर्व-कूल्ड रोटर प्रविष्टि के लिए एक विधि का वर्णन करता है। यहां वर्णित क्रायोजेनिक नमूना हस्तांतरण व्यवहार्य अक्षुण्ण कोशिकाओं के एनएमआर लक्षण वर्णन के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, यह किसी भी प्रणाली पर लागू होता है जहां तापमान में उतार-चढ़ाव नमूना अखंडता से समझौता कर सकता है। इसमें किसी भी प्रकार की जटिल प्रणालियां शामिल हैं, जैसे फंसे हुए प्रतिक्रिया मध्यवर्ती17, 18,एंजायमोलॉजी19,20 या प्रोटीन फोल्डिंग21, 22के रासायनिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए फ्रीज शमन प्रतिक्रियाएं।

Protocol

1. स्तनधारी कोशिकाओं की संस्कृति और क्रायोप्रोटेक्शन

  1. संस्कृति और कटाई स्तनधारी कोशिकाओं
    1. जमे हुए मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK २९३) का एक aliquot गल ।
    2. संस्कृति HEK विकास मीडिया में 293 कोशिकाओं (उदाहरण के लिए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेन-स्ट्रीप के साथ DMEM) 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ 100 मिमी प्लेटों में दो से तीन अंश (7-10 दिन) के लिए।
    3. कोशिकाओं और संस्कृति को 150 मिमी प्लेट में विभाजित करें जब तक कि कोशिकाएं 90-95% की नरमी प्राप्त न करें।
      नोट: 90% > में एक 150 मिमी प्लेट 3.2 मिमी व्यास के साथ दो नीलम रोटरों को भरने के लिए पर्याप्त होगी।
    4. ट्राइप्सिन (सामग्री की तालिका देखें) और मीडिया के 10 एमएल का उपयोग करके हार्वेस्ट कोशिकाएं। निलंबन को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 673 x g (1000 आरपीएम) पर बाँझ 15 एमएल शंकु और अपकेंद्रित्र पर स्थानांतरित करें। सुपरनिट निकालें।
    5. सेल पेलेट को फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) (पीएच 7.4, −सीएसीएल2, −एमजीसीएल2)से धोएं ।
  2. कोशिकाओं का क्रायोप्रोटेक्शन
    1. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 50 माइक्रोल सेल पेलेट ले लीजिए। एक अलग ट्यूब में पीबीएस के 50 माइक्रोन और ग्लाइसरोल के 18 माइक्रोन का मिश्रण तैयार करें।
    2. धीरे-धीरे 50 माइक्रोन सेल पेलेट को ग्लिसेरोल-पीबीएस मिश्रण के 68 माइक्रोन के साथ मिलाएं, जिसमें ग्लिसरोल-पीबीएस मिश्रण को गोली के शीर्ष पर जोड़कर और ट्यूब के किनारे को धीरे-धीरे टैप करके गोली को फिर से खर्च करें जब तक कि कोई झुरमुट न रह जाए।
      नोट: कोमल पिपटिंग का उपयोग सेल को फिर से खर्च करने के लिए भी किया जा सकता है, हालांकि, यह सुनिश्चित करें कि सेलुलर अखंडता से समझौता नहीं किया गया है।

2. एनएमआर रोटर में स्तनधारी कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. कोशिकाओं को 3.2 मिमी नीलम रोटर में स्थानांतरित करना।
    1. एक फ़नल बनाने के लिए, 200 माइक्रोल पिपेट टिप काटें और कट पिपेट टिप के संकीर्ण अंत को 3.2 मिमी रोटर में डालें।
    2. कोशिकाओं को रोटर पर बैठे कीप में स्थानांतरित करें। रोटर को एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कीप के साथ रखें और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए 673 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा रोटर के नीचे में गोली दें।
    3. रोटर से सुपरनैंट और किसी भी अतिरिक्त नमूना निकालें। इन दोनों चरणों को तब तक दोहराएं जब तक कि रोटर पूरी तरह से कोशिकाओं से पैक न हो जाए।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ठंड से पहले नमूने की सेलुलर व्यवहार्यता निर्धारित करें। एफबीएस-मुक्त डीएमईएम के 100 माइक्रोन में अतिरिक्त सेल पेलेट के 10 माइक्रोल को फिर से पेंड करें। 0.4% ट्राइपैन ब्लू समाधान के साथ निलंबन के 10 माइक्रोन मिलाएं और तुरंत स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्यता का आकलन करें। कोशिकाओं को पतला करने के लिए केवल एफबीएस मुक्त मीडिया का उपयोग करें क्योंकि सीरम ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग में हस्तक्षेप करता है।
    4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पैकिंग उपकरण का उपयोग करके सिलिकॉन प्लग के साथ रोटर को सील करें।
    5. रोटर को एक सिरेमिक ड्राइव टिप के साथ बंद करें इसे लंबवत नीचे दबाकर। ड्राइव टिप के किनारे पर नाजुक पंख को छूने से बचें।
    6. एक चांदी के स्थायी मार्कर के साथ नीलम रोटर के निचले किनारे के आधे और एक काले स्थायी मार्कर के साथ रोटर के नीचे के किनारे के दूसरे आधे को चिह्नित करें ताकि स्पेक्ट्रोमीटर के अंदर रोटर के कताई की सटीक निगरानी की अनुमति दी जा सके।
      नोट: रोटर के अंकन में खामियों कताई आवृत्ति की सटीक गिनती को रोकने के परिणामस्वरूप स्थिर कताई प्राप्त करने में विफलता होगी । क्योंकि मार्कर एक जमे हुए रोटर और रोटर वार्मिंग समझौते नमूना अखंडता पर नहीं लिखेंगे, ठंड से पहले रोटर अंकन एक महत्वपूर्ण कदम है ।
  2. 3.2 मिमी नीलम रोटर के अंदर कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेशन।
    1. ढक्कन के नीचे ऊतक या कागज तौलिया के एक टुकड़े द्वारा बनाया गया एक तकिया रखें और क्रायोजेनिक शीशी के तल पर (सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: ऊतक कागज क्रायोजेनिक शीशियों के पक्षों के खिलाफ टकराने से होने वाले नुकसान से रोटर अंकन की रक्षा करता है।
    2. क्रायोजेनिक शीशी के नीचे का सामना करना पड़ निशानात के साथ ऊतक कागज के साथ क्रायोजेनिक शीशी गद्देदार में 3.2 मिमी नीलम रोटर रखें।
    3. क्रायोजेनिक शीशी को नियंत्रित दर (-1 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम) कूलिंग कंटेनर में रखकर रोटर को धीमी गति से फ्रीज करें और कंटेनर को न्यूनतम 3 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    4. जमे हुए रोटर से युक्त क्रायोजेनिक शीशी को तरल नाइट्रोजन भंडारण में स्थानांतरित करें।

3. एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में जमे हुए नमूने का क्रायोजेनिक स्थानांतरण

  1. जमे हुए नमूने को एनएमआर सुविधा के लिए परिवहन करें।
    1. एनएमआर सुविधा के लिए परिवहन के लिए तरल नाइट्रोजन से भरे एक छोटे देवर को जमे हुए रोटर में क्रायोजेनिक शीशी स्थानांतरित करें।
  2. तरल नाइट्रोजन स्नान के लिए जमे हुए रोटर का हस्तांतरण।
    1. 500 एमएल - तरल नाइट्रोजन के 1 एल के साथ एक सूखी, थर्मल अछूता चौड़ा मुंह फोम देवर भरें।
    2. रोटर को क्रायोजेनिक शीशी से तरल नाइट्रोजन से भरे चौड़े मुंह फोम देवर में स्थानांतरित करें।
      1. ट्रांसफर देवर से क्रायोजेनिक शीशी को हाथ में लें और इसे वायुमंडल से बचाने के लिए लिक्विड नाइट्रोजन की सतह के ठीक ऊपर पकड़ लें।
      2. मुंह के साथ क्रायोजेनिक शीशी को थोड़ा नीचे की ओर इशारा करते हुए पकड़े हुए, टोपी को अनस्क्रू करें और रोटर को तरल नाइट्रोजन स्नान में स्लाइड करें।
        नोट: एक बार टोपी को अनस्क्रूड करने के बाद, रोटर को क्रायोजेनिक शीशी से तरल नाइट्रोजन स्नान में जल्दी (1 सेकंड के तहत) गिरना चाहिए ताकि रोटर पर इकट्ठा होने से संघनन को रोका जा सके। तरल नाइट्रोजन का वाष्पीकरण चौड़े मुंह फोम देवर में एक "नाइट्रोजन बादल" बनाता है और तरल नाइट्रोजन में डूबने से पहले रोटर पर संघनन को रोकता है। रोटर से हवा में लंबे समय तक संपर्क में आने से रोटर की दीवारों पर नमी का संघनन हो सकता है जो बर्फ में फिर से गाढ़ा हो जाएगा।
  3. एनएमआर नमूना पकड़ने के लिए रोटर का क्रायोजेनिक स्थानांतरण।
    1. तरल नाइट्रोजन स्नान में जलमग्न करके 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को प्रीचिल करें। ट्यूब बंद न करें।
      नोट: माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले रोटर का निरीक्षण करें। चिमटी का उपयोग करना, तरल नाइट्रोजन की सतह के ठीक नीचे रोटर पकड़ो और जांच करें कि रोटर के निशान बरकरार हैं, कि इसकी दीवारों पर कोई बर्फ जमा नहीं बना है और ड्राइव टिप बरकरार है। रोटर की दीवारों पर बर्फ क्रिस्टल जमा सफेद पाउडर के रूप में दिखाई देते हैं। हमेशा अपने शरीर से रोटर पकड़ और ड्राइव टिप से नहीं सावधान रहें । चिमटी युक्तियों के साथ रोटर से अंकन खरोंच नहीं है।
    2. तरल नाइट्रोजन स्नान की सतह के नीचे, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के नीचे का सामना करना पड़ ड्राइव टिप और ट्यूब के उद्घाटन का सामना करना पड़ निशान के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रोटर हस्तांतरण करने के लिए चिमटी का उपयोग करें ।
      नोट: तरल नाइट्रोजन में डूबने या रोटर को छूने से पहले हमेशा चिमटी सूखी।
    3. चिमटी का उपयोग करना, अपनी गर्दन से तरल नाइट्रोजन के तहत रोटर युक्त ट्यूब पकड़ो।
    4. हाथ में चिमटी की एक दूसरी जोड़ी के साथ, तरल नाइट्रोजन स्नान में एनएमआर नमूना पकड़ने को जलमग्न करने के लिए तैयार रहें और इसे पकड़ें ताकि यह माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के संबंध में एक तीव्र कोण पर झुका हो।
      नोट: ओ-रिंग को ठंडा करने से बचने के लिए नमूना पकड़ने वाले तरल नाइट्रोजन के संपर्क में होने वाले समय को कम करें। अगर ओ-रिंग जम जाती है तो पकड़ने वाले को स्पेक्ट्रोमीटर में डालना काफी मुश्किल होगा।
  4. एनएमआर नमूना पकड़ने वाले एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर से क्रायोजेनिक रोटर स्थानांतरण
    नोट: इस कदम के लिए दो लोगों की आवश्यकता होती है, एक क्रायोकाबीनेट संचालित करने के लिए और एक तरल नाइट्रोजन से नमूने को जांच में स्थानांतरित करने के लिए ।
    1. कैबिनेट पर 'रिजेक्ट' दबाकर क्रायोकाबीनेट को रिजेक्शन मोड में रखें।
      नोट: रिजेक्शन मोड वायुमंडलीय नमी के प्रवेश द्वार को रोकने के लिए जांच से वायुमंडल तक उच्च दबाव पर शुष्क और ठंडे नाइट्रोजन गैस प्रवाह को शुद्ध करता है ।
    2. रोटर को एनएमआर नमूना पकड़ने में स्थानांतरित करें।
      1. तरल नाइट्रोजन की सतह के नीचे अभी भी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में एनएमआर नमूना पकड़ने के खुले छोर डालें।
      2. रोटर को नमूना पकड़ने में गिरने की अनुमति देने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब और एनएमआर नमूना पकड़ने वाले दोनों को उठाएं। एनएमआर नमूना पकड़ने और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को हिलाएं मामले में रोटर नमूना पकड़ने के रिम पर अटक जाता है।
      3. रोटर को हवा से ढालने के लिए एनएमआर नमूना पकड़ने वाले के शीर्ष पर खाली माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब छोड़ दें।
    3. जांच से अन्य खाली एनएमआर नमूना पकड़ने वाले को निकालकर फर्श पर रख दें।
    4. रोटर युक्त एनएमआर नमूना पकड़ने वाले को अपने मुक्त हाथ में स्थानांतरित करें, माइक्रोसेंट्राइज ट्यूब को हटा दें और इसे तुरंत जांच में डालें।
      नोट: यदि ओ-रिंग जमा देता है, तो नमूना पकड़ने वाले को कसना मुश्किल होगा। जब तक यह जगह में स्लाइड बल लागू रखें ।
    5. क्रायोकाबीनेट को 'स्टॉप इजेक्ट' और 'डालने' के लिए संचालित करने वाले व्यक्ति को संकेत दें।
      नोट: प्रविष्टि मोड जांच में नमूना पकड़ने से रोटर गाइड ।
    6. क्रायोकाबीनेट द्वारा नियंत्रित असर और ड्राइविंग प्रवाह दबाव को समायोजित करके वांछित कताई दर (जैसे, 12 किलोहर्ट्ज) पर नमूना स्पिन करें। (उदाहरण के लिए, तुरंत असर गैस को ~ 200 mBar और ड्राइव गैस को 10 मीटर बार तक बढ़ाएं। एक बार नमूना स्पिन होने के बाद, असर गैस को 1000 मीटर बार तक बढ़ाएं और गैस को 200 मीटर तक चलाएं। कताई स्थिर होने के रूप में, असर को 2400 मीटर बार तक बढ़ाएं और फिर कई मिनटों में ड्राइव गैस को 200 मीटर बार से 1700 मीटर तक बढ़ाएं। वीटी कूलिंग गैस ~ 1070 एल/एच पर स्थिर है)
      नोट: तरल नाइट्रोजन स्नान से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब और एनएमआर नमूना पकड़ने को उठाते समय, सुनिश्चित करें कि माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रोटर को घेरने के लिए इसके अंदर पर्याप्त तरल नाइट्रोजन है। एनएमआर नमूना पकड़ने में रोटर स्थानांतरित करने और स्पेक्ट्रोमीटर में एनएमआर नमूना पकड़ने के बीच के समय को कम करें। 3.4 में सभी चरणों को 30 एस के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।

4. एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर से नमूने को क्रायोजेनिक हटाने

  1. तरल नाइट्रोजन स्नान और क्रायोजेनिक शीशी की तैयारी
    1. 500 एमएल डालो - 1 एल तरल नाइट्रोजन को चौड़े मुंह फोम देवर में डालें और स्नान को स्पेक्ट्रोमीटर के नीचे रखें।
    2. क्रायोजेनिक शीशी को प्री-कूल करें। तरल नाइट्रोजन स्नान में ऊतक कागज का एक टुकड़ा युक्त खाली क्रायोजेनिक शीशी जलमग्न।
  2. रोटर का क्रायोजेनिक स्थानांतरण जांच से क्रायोजेनिक शीशी तक
    1. ड्राइविंग और असर गैस प्रवाह को कम करके 0 किलोहर्ट्ज के लिए कताई दर को कम करें और रिजेक्शन मोड पर स्विच करके रोटर को बाहर निकालें।
    2. रिजेक्शन मोड पर रखें, जांच से नमूना पकड़ने वाले को हटा दें, रोटर को सीधे तरल नाइट्रोजन युक्त चौड़े मुंह फोम देवर में छोड़ दें।
    3. प्री-ठंडा चिमटी का उपयोग करके, रोटर को तरल नाइट्रोजन की सतह के नीचे पूर्व-ठंडा क्रायोजेनिक शीशी में स्थानांतरित करें।
    4. क्रायोजेनिक शीशी को कैप करें। क्रायोजेनिक शीशी टोपी को तरल नाइट्रोजन में डुबोकर प्रीकहिल करें। रोटर और तरल नाइट्रोजन युक्त क्रायोजेनिक शीशी को स्नान से निकालें और ट्यूब को प्रीचिल्ड कैप के साथ कैप करें। टोपी को कस न लें ताकि वाष्पीकरण नाइट्रोजन को सुरक्षित रूप से जारी किया जा सके।
    5. तरल नाइट्रोजन में क्रायोजेनिक शीशी को फिर से जलमग्न करें। नमूना को आगे के विश्लेषण के लिए दीर्घकालिक तरल नाइट्रोजन भंडारण या अनपैक करने के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है।

5. रोटर और व्यवहार्यता माप अनपैकिंग

  1. रोटर और मापने की व्यवहार्यता को अनपैकिंग करना
    1. प्री-वार्म सीरम फ्री मीडिया (डीएमईएम) या पीबीएस को 37 डिग्री सेल्सियस तक।
    2. लिक्विड नाइट्रोजन से रोटर निकालें। ड्राइव टिप और सिलिकॉन प्लग निकालें।
      नोट: नीलम एक उत्कृष्ट गर्मी कंडक्टर है। अपनी उंगलियों से रोटर को छूने से बचें क्योंकि हीट ट्रांसफर स्थानीय फ्रीज-गल घटनाओं का कारण बन सकता है जो सेलुलर व्यवहार्यता से समझौता करते हैं।
  2. व्यवहार्यता मापने
    1. रोटर और resuspend कोशिकाओं में जमे हुए सेल गोली के लिए गर्म मीडिया के 20 μL जोड़ें। एक पिपेट के साथ निलंबन निकालें और निलंबन को मीडिया के 100 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
    2. सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन निकालें और 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन (v/v) की बराबर मात्रा के साथ मिलाएं। 30 एस से 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    3. स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्यता को मापें।

Representative Results

एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में स्तनधारी कोशिकाओं के पूर्व-जमे हुए नमूनों का क्रायोजेनिक सम्मिलन एनएमआर प्रयोग में व्यवहार्यता का समर्थन करता है। एक जमे हुए नमूने के क्रायोजेनिक हस्तांतरण की योजनाबद्ध चित्रा 1में दिखाया गया है । सेलुलर व्यवहार्यता और बरकरारता का आकलन विभिन्न तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है। यहां हमने झिल्ली अखंडता के एक मानक डाई-आधारित उपाय का उपयोग किया, जो अन्य तरीकों23के साथ अच्छी तरह से संरेखित करता है। बरकरार कोशिकाओं को नीले रंग की कोशिश करने के लिए अभेद्य हैं, जबकि समझौता झिल्ली अखंडता के साथ कोशिकाओं पारम कर रहे हैं । ट्राइपैन ब्लू पारमी और अभेद्य कोशिकाओं की संख्या को स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एमएएस एनएमआर (यानी, बिंदु 5.2.3 पर) के बाद स्तनधारी कोशिकाओं की ट्राइपैन ब्लू पारमेबिलिटी किसी भी तापमान परिवर्तन (यानी, बिंदु 2.1.3) से पहले स्तनधारी कोशिकाओं की ट्राइपैन ब्लू पारमेबिलिटी के समान है। हालांकि, अगर कोशिकाओं को धीमी गति से जमे हुए हैं, तो प्रविष्टि से पहले कमरे के तापमान के लिए गरम (यानी प्रोटोकॉल के बाद ठंडा जांच में डालने से पहले कमरे के तापमान के लिए रोटर वार्मिंग से पहले 3 बिंदु), सेलुलर व्यवहार्यता के रूप में trippan नीले द्वारा मूल्यांकन कोशिकाओं के 10% से भी कम हो जाती है(चित्रा 2)। इस प्रकार, स्पेक्ट्रोमीटर के अंदर ठंड कोशिकाओं के परिणामस्वरूप सेलुलर झिल्ली अखंडता की हानि होती है जबकि स्तनधारी कोशिकाओं के जमे हुए नमूनों का क्रायोजेनिक सम्मिलन एनएमआर प्रयोग में कोशिका व्यवहार्यता का समर्थन करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक पूर्व ठंडा एनएमआर जांच में एक जमे हुए नमूने के क्रायोजेनिक हस्तांतरण की योजनाबद्ध । (क)तरल नाइट्रोजन की सतह से संपर्क करें और क्रायोजेनिक शीशी के शीर्ष को अनस्क्रू करें। (ख)रोटर को तरल नाइट्रोजन स्नान में स्लाइड करें। (ग)चिमटी का उपयोग करके एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को जलमग्न करें और इसे तब तक रखें जब तक कि यह पूरी तरह से ठंडा न हो जाए। (घ)ट्यूब के नीचे का सामना करना पड़ ड्राइव टिप के साथ माइक्रोसेंट्रफ्यूज में रोटर डालें। चिमटी के साथ, हड़पने के बजाय पुश। (ई)तरल नाइट्रोजन स्नान की सतह के ठीक नीचे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पकड़ो और नेत्रहीन रोटर का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह ठंढ मुक्त और अच्छी तरह से चिह्नित है । (च)नमूना पकड़ने वाले को सतह के ऊपर एक कोण पर रखें। (जी)सैंपल पकड़ने वाले माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के अंदर होते ही सैंपल पकड़ने वाले और ट्यूब को लिक्विड नाइट्रोजन से बाहर उठाएं। (ज)रिम पर रोटर पकड़े जाने पर सैंपल पकड़ने वाले को हिलाएं। (I)जांच से खाली नमूना पकड़ने वाले को हटाकर जमीन पर बिछाएं। (जम्मू)अंदर रोटर के साथ नमूना पकड़ने से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब निकालें, डालें, जांच में नमूना पकड़ने वाले को कसें और नियंत्रण कंसोल पर "डालने" दबाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्तनधारी कोशिकाओं के पूर्व-जमे हुए नमूने का क्रायोजेनिक सम्मिलन सेलुलर बरकरारता के माप में परिणाम देता है जो स्तनधारी कोशिकाओं के नमूनों के समान होते हैं जो कभी भी जमे नहीं रहे हैं। नमूनों के लिए ट्राइपैन ब्लू अभेद्य कोशिकाओं का प्रतिशत जो कभी भी जमे हुए नहीं हैं (उदाहरण के लिए चरण 2.1.3) एमएएस एनएमआर के बाद नमूनों के लिए कोशिकाओं के समान है (उदाहरण के लिए 12 kHz MAS के साथ चरण 5.2.3)। धीमी गति से जमे हुए कोशिकाओं (जैसे कदम 3) है कि एनएमआर साधन है कि पूर्व १०० कश्मीर के लिए ठंडा किया गया था में प्रविष्टि से पहले कमरे के तापमान के लिए गरम किया गया था 12 kHz MAS के साथ MAS एनएमआर के बाद बरकरार कोशिकाओं के बहुत कम प्रतिशत था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में जमे हुए नमूनों का क्रायोजेनिक हस्तांतरण एनएमआर डेटा अधिग्रहण के माध्यम से जमे हुए स्तनधारी कोशिकाओं की व्यवहार्यता को संरक्षित करने में सफल है। इस पद्धति की सफलता पूर्व और पोस्ट MAS एनएमआर व्यवहार्यता माप में प्रदर्शित की जाती है। यह दृष्टिकोण किसी भी प्रणाली के लिए सफल और सामान्य रूप से है जहां तापमान में उतार-चढ़ाव नमूना अखंडता से समझौता कर सकता है। वर्तमान में प्रस्तुत प्रोटोकॉल HEK 293 सेल लाइन के साथ किया जाता है। क्योंकि कई स्तनधारी कोशिका रेखाओं के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन की स्थिति बहुत समान है, इसकी संभावना है कि यहां रिपोर्ट की गई स्थितियां अन्य सेलुलर प्रणालियों में अनुवाद योग्य हैं; हालांकि, उन्हें समान परिणाम प्राप्त करने के लिए क्रायोप्रोटेक्टेंट, नमूना मात्रा और फ्रीजिंग दरों के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

एनएमआर प्रयोग के बाद रोटर को तेजी से अनपैक करके इस पद्धति में सुधार किया जा सकता है। यह कदम वर्तमान में उप इष्टतम है और इसका निष्पादन कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है। इससे पहले कि कोशिकाओं को मीडिया में फिर से निलंबित किया जा सकता है, ड्राइव टिप और सिलिकॉन प्लग रोटर से हटा दिया जाना चाहिए । नमूना असमान रूप से गल जाता है जब रोटर ड्राइव टिप और सिलिकॉन प्लग को हटाने के दौरान आयोजित किया जाता है तो कम रोटर हैंडलिंग समय उच्च वायाबिलिटी में परिणाम होता है। रोटर धारकों या अन्य उपकरणों के विकास के लिए एक समान विगलन और ड्राइव टिप और सिलिकॉन प्लग के त्वरित हटाने की सुविधा के लिए व्यवहार्यता के बाद एनएमआर आकलन और अधिक सटीक बनाने में सहायता करेगा ।

इस लेख में वर्णित क्रायोजेनिक नमूना लोडिंग के दृष्टिकोण एनएमआर जांच तक सीमित है जो एनएमआर चुंबक के बोर में जांच के साथ नमूना प्रविष्टि और इंजेक्शन का समर्थन करता है। जबकि बाहरी नमूना प्रविष्टि और रिजेक्शन वाणिज्यिक डीएनपी सिस्टम के लिए मानक है, कस्टम जांच हमेशा यह विकल्प नहीं है। इसके अलावा, क्रायोजेनिक नमूना लोडिंग के लिए इस दृष्टिकोण को विभिन्न आकार के रोटरों के साथ संगत होने के लिए निर्मित एनएमआर जांच के लिए कुछ संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रोटोकॉल को 3.2 मिमी रोटर के लिए अनुकूलित किया गया है और यदि नमूना पकड़ने वाले का बाहरी व्यास माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (जैसे, चरण 3.4.2) के आंतरिक व्यास से अधिक है तो संशोधन की आवश्यकता हो सकती है।

एमएएस एनएमआर को डीएनपी के आवेदन के साथ, अब अंतर्जात शारीरिक सांद्रता24, 25, 26में प्रोटीन और अन्य जैव अणुओं का पतालगानासंभव है। यह उनके मूल वातावरण के भीतर जैव अणुओं का अध्ययन करने की संभावना को खोलता है। पूरे प्रयोग में सेलुलर अखंडता और व्यवहार्यता का रखरखाव स्पेक्ट्रोस्कोपी के प्रयोगात्मक परिणामों को जैविक घटनाओं से जोड़ने में महत्वपूर्ण होने की संभावना है। शुद्ध प्रोटीन या सेलुलर lysates युक्त नमूनों की अनियंत्रित ठंड आमतौर पर नमूना गुणवत्ता 7,27से समझौता नहीं करती है, हालांकि कुछ संकेत हैं कि शुद्ध प्रणालियों में भी ठंड की दर एक महत्वपूर्ण परिवर्तनीय हो सकती है28. हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं के नमूनों को नियंत्रित दर पर जमे हुए होने की जरूरत है अगर सेलुलर बरकरारपन और व्यवहार्यता के संरक्षण व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है । यहां हम स्तनधारी कोशिकाओं के जमे हुए नमूनों को पूर्व-कूल्ड डीएनपी एमएएस एनएमआर उपकरण में ठंडा करने और स्थानांतरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो संभावित रूप से हानिकारक तापमान में उतार-चढ़ाव से बचता है और व्यवहार्य कोशिकाओं पर माप का समर्थन करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को टेक्सास के कैंसर रिसर्च प्रिवेंशन एंड रिसर्च इंस्टीट्यूट [RR150076], नेशनल साइंस फाउंडेशन [1751174] के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान [एनएस-111236], वेल्च फाउंडेशन [1-1923-20170325]; Lupe Murchison फाउंडेशन, टेड नैश लांग लाइफ फाउंडेशन और रिश्तेदारी फाउंडेशन (Searle विद्वानों कार्यक्रम) केकेएफ के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4% Trypan blue stain Invitrogen T10282
100 mm cell culture dish Thomas Scientific 430167
150 mm cell culture dish Nunc 157150
3.2 mm sapphire rotor Bruker
45 ° angled forceps Hampton Research HR4-859
AMUPol Cortecnet C010P005
Black and Silver marker Sharpie
Cap removal tool Bruker HZ16913
Cell culture grade water HyClone SH30529.03
Ceramic cap Cortecnet HZ12372
CoolCell Corning/ Biocision UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10288
Countess II automated cell counter Invitrogen AMQAF1000
Cryogen tubes Nalgene 03-337-7Y
d8-glycerol Aldrich 447498
Deuterium oxide, 99.8 % atom D Aldrich 756822-1
DMEM Gibco 10569-010
DNP NMR system with frequency-matched gyrotron Bruker
Foam dewar Spearlab FD-800
Kimwipes Kimwipes
Packing tool Bruker
Pen-Strep Gibco 15140-122
Powdered PBS VWR VWRRV0780
Protonated PBS Gibco 10010-023
Silicon plug Bruker B7089
Standard Vessel forceps
Tryp-L Gibco 12605010

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References

  1. Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
  2. Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
  3. Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
  4. Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
  5. Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
  6. Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
  7. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  8. Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
  9. Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
  10. Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
  11. Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
  12. Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
  13. Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
  14. Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
  15. Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928 (2015).
  16. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
  17. Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
  18. Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717 (2019).
  19. Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
  20. Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
  21. Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
  22. Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
  23. Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
  24. Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
  25. Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
  26. Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
  27. Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
  28. Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).

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जीव विज्ञान अंक 163 क्रायोप्रिजर्वेशन डीएनपी एमएएस एनएमआर सॉलिड-स्टेट एनएमआर इन-सेल एनएमआर एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी
क्रायोजेनिक नमूना लोड िंग एक मैजिक एंगल कताई परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोमीटर में जो सेलुलर व्यवहार्यता को बरकरार रखता है
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Ghosh, R., Kragelj, J., Xiao, Y., Frederick, K. K. Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability. J. Vis. Exp. (163), e61733, doi:10.3791/61733 (2020).

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