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Artículo de método

Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales

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DOI:

10.3791/61773

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31 de marzo de 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los productos naturales representan prometedores puntos de partida para el desarrollo de nuevos fármacos y agentes terapéuticos. Sin embargo, debido a la alta diversidad química, encontrar nuevos compuestos terapéuticos de las plantas es una tarea difícil y que consume mucho tiempo. Describimos un enfoque simplificado para identificar moléculas antimicrobianas y antibiócidas a partir de extractos y fracciones vegetales.

Resumen

Los productos naturales proporcionan sustancias estructuralmente diferentes, con una miríada de actividades biológicas. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de compuestos activos de las plantas son difíciles debido a la compleja matriz vegetal y los procedimientos de aislamiento e identificación que consumen mucho tiempo. Por lo tanto, se presenta un enfoque escalonado para la detección de compuestos naturales de las plantas, incluyendo el aislamiento y la identificación de moléculas potencialmente activas. Incluye la recogida del material vegetal; preparación y fraccionamiento de extractos crudos; enfoques de cromatografía y espectrometría (UHPLC-DAD-HRMS y NMR) para la identificación de análisis y compuestos; bioensayos (actividades antimicrobianas y antibióticas; "fuerza de adhesión" bacteriana al pellicle salival y matriz glucana inicial tratada con tratamientos seleccionados); y análisis de datos. El modelo es simple, reproducible y permite la detección de alto rendimiento de múltiples compuestos, concentraciones y pasos de tratamiento se pueden controlar constantemente. Los datos obtenidos proporcionan la base para futuros estudios, incluyendo formulaciones con los extractos y/o fracciones más activos, aislamiento de moléculas, modelado de moléculas a objetivos específicos en células microbianas y biofilms. Por ejemplo, un objetivo para controlar el biofilm cariogénico es inhibir la actividad de Streptococcus mutans glucosyltransferases que sintetizan los glucanos de la matriz extracelular. La inhibición de esas enzimas impide la acumulación de biofilm, disminuyendo su virulencia.

Introducción

Los primeros modelos de medicina utilizados en las sociedades se basaron en productos naturales (NPs). Desde entonces, los seres humanos han estado buscando nuevos productos químicos en la naturaleza que pueden transformarse en drogas1. Esta búsqueda causó una mejora continua de tecnologías y métodos para la detección etnobotánica1,2,3. Los NPs ofrecen una rica fuente de sustancias estructuralmente diversas, con una amplia gama de actividades biológicas útiles para el desarrollo de terapias alternativas o adyuvantes. Sin embargo, la matriz vegetal compleja inherente hace que el aislamiento y la identificación de los compuestos activos sea una tarea desafiante y que consume mucho tiempo4.

Los medicamentos o formulaciones basados en NPs se pueden utilizar para prevenir y/o tratar varias afecciones que afectan oralmente, incluidos los caries dentales4. Los caries dentales, una de las enfermedades crónicas más prevalentes a nivel mundial, derivan de la interacción de la dieta rica en azúcar y biofilms microbianos (placa dental) formados en la superficie dental que conduce a la desmineralización causada por ácidos orgánicos derivados del metabolismo microbiano, y si no se tratan, conduce a la pérdida de dientes5,6. Aunque otros microorganismos pueden estar asociados7, Streptococcus mutans es una bacteria cariogénica crítica porque es acidogénico, acidurico, y un constructor de matriz extracelular. Esta especie codifica múltiples exoenzimas (por ejemplo, glicosiltransferasas o Gtfs) que utilizan sacarosa como sustrato8 para construir la matriz extracelular rica en exopolísacáridos, que son un determinante de virulencia9. Además, el hongo Candida albicans puede impulsar la producción de esa matriz extracelular7. Aunque el flúor, administrado en diversas modalidades, sigue siendo la base para prevenir caries dentales10,se necesitan nuevos enfoques como adyuvantes para aumentar su eficacia. Además, las modalidades anti-placa disponibles se basan en el uso de agentes microbicidas de amplio espectro (por ejemplo, clorhexidina)11. Como alternativa, los NPs son terapias potenciales para controlar biofilms y prevenir caries dentales12,13.

El avance adicional en el descubrimiento de nuevos compuestos bioactivos de las plantas incluye pasos o enfoques necesarios tales como: i) el uso de protocolos fiables y reproducibles para el muestreo, teniendo en cuenta que las plantas a menudo muestran variabilidad intraespecífica; (ii) la preparación de extractos completos y sus respectivas fracciones a pequeña escala; (iii) la caracterización y/o desreplicación de sus perfiles químicos pensó en la adquisición de datos multidimensionales como GC-MS, LC-DAD-MS o NMR, por ejemplo; (iv) el uso de modelos viables y de alto rendimiento para evaluar la bioactividad; (v) la selección de nuevos éxitos potenciales basados en análisis de datos multivariantes u otras herramientas estadísticas; (vi) realizar el aislamiento y purificación de los compuestos objetivo o candidatos prometedores; y vii) la validación de las actividades biológicas correspondidas utilizando los compuestos aislados2,14.

La desreplicación es el proceso de identificación rápida de compuestos conocidos en extracto crudo y permite diferenciar compuestos novedosos de los que ya han sido estudiados. Además, este proceso evita el aislamiento cuando ya se ha descrito la bioactividad para ciertos compuestos, y es particularmente útil detectar "bateadores frecuentes". Se ha utilizado en diferentes flujos de trabajo no dirigidos que van desde la identificación de compuestos principales o la aceleración del fraccionamiento guiado por actividad hasta la elaboración de perfiles químicos de colecciones de extractos. Se puede integrar completamente con estudios metabolómicos para la elaboración de perfiles químicos no dirigidos de CE o la identificación específica de metabolitos. Todo esto conduce en última instancia a priorizar los extractos antes de los procedimientos de aislamiento1,15,16,17.

Por lo tanto, en el presente manuscrito, describimos un enfoque sistemático para identificar moléculas antimicrobianas y antibiócidas a partir de extractos y fracciones vegetales. Incluye cuatro pasos multidisciplinarios: (1) recolección de material vegetal; 2) preparación de extractos crudos (CE) y fracciones (CEF), seguidos de su análisis de perfil químico; 3) bioensayos; y (4) análisis biológicos y químicos de datos (Figura 1). Así, presentamos el protocolo desarrollado para analizar las actividades antimicrobianas y antibióquidas de extractos y fracciones de Casearia sylvestris contra Streptococcus mutans y Candida albicans13,así como los procedimientos para la caracterización fitoquímica y el análisis de datos. Para simplificar, el enfoque aquí es demostrar el enfoque para la detección de compuestos naturales utilizando la bacteria.

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Figura 1: Diagrama de flujo del enfoque sistemático para identificar moléculas activas de extractos y fracciones de plantas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. Recogida de material vegetal

  1. Material vegetal
    1. Registre el acceso al material vegetal en plataformas electrónicas que regulan el acceso al patrimonio genético en el país donde se llevará a cabo la recolección. Por ejemplo, en Brasil, regístrese en el Sistema Nacional para la Gestión del Patrimonio Genético y los Conocimientos Tradicionales Asociados – SisGen (sitio web https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx).
    2. Recoger muestras del material vegetal de interés (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores, frutas). Regístrese si el material se recogió durante la fase reproductiva o vegetativa.
    3. Registre los parámetros de la colección (fecha, georreferenciación, temperatura media anual y porcentaje medio de humedad).
    4. Identifique las muestras con precisión, y un taxonomista debe confirmar la autenticidad.
  2. Muestras de plantas estabilización y almacenamiento
    1. Separe los órganos vegetales en bolsas de plástico o matraces individuales inmediatamente después de las colecciones.
    2. Inactivar posibles reacciones enzimáticas por (i) congelación inmediata en nitrógeno líquido, (ii) deshidratarse en un horno de aire circulante (40 °C), o (iii) congelar las muestras por liofilización.
    3. Guarde el material estabilizado en bolsas herméticamente selladas a temperatura ambiente o en un congelador hasta su uso (-20 u -80 °C, dependiendo del período de almacenamiento o uso previsto).
    4. Moler las muestras en un molino analítico (cuchillo o bola, dependiendo del tipo de tejido o disponibilidad) y estandarizar el tamaño de las partículas utilizando tamices estandarizados.
    5. Pesar las muestras individualmente para los pasos de extracción posteriores.

2. Preparación de extractos crudos (CE) y fracciones (CEF) para análisis de perfiles químicos y bioensayos

  1. Preparación de extractos crudos (CE)
    NOTA: Los pasos se ilustran en el diagrama de flujo en la Figura 2A.
    1. Preparar un disolvente de extracción con una mezcla hidroalcohólica (por ejemplo, etanol (EtOH) mezclas 70% o ternarias de agua, EtOH, y otros modificadores, definidos por el diseño experimental de según informes anteriores).
    2. Utilice el peso de la muestra de relación (peso seco, mg)/ disolvente de extracción (ml) que varía de 50 a 100 mg por cada ml de disolvente.
    3. Para extracciones rápidas y reproducibles, utilice extracciones por lotes utilizando microtubos.
      NOTA: Al menos tres réplicas deben utilizarse en este momento para permitir el análisis estadístico.
    4. Realice extracciones asistidas por ultrasonido (EAU) para que sea rápido, fácil y barato.
    5. Repita el procedimiento tres veces (15 minutos cada una) para obtener la mejor eficiencia.
    6. Después de cada paso de extracción, decantar los residuos sólidos por centrifugación y eliminar el sobrenadante.
    7. Combine los sobrenadantes individualmente, filtre y ahorre alícuotas para análisis químicos y bioensayos simultáneos. Si es necesario, retire el disolvente de extracción bajo vacío, flujo de nitrógeno o liofilización, y registre el peso y el rendimiento.
    8. Conservar a -20 °C protegido de la luz.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí para examinar el CE y seleccionar los que presentan la actividad deseada.
  2. Fraccionamiento de extractos crudos (CEF)
    NOTA: Los pasos se ilustran en el diagrama de flujo en la Figura 2B.
    1. Utilice cartuchos con al menos 1 g de adsorbente. Si los alcaloides están potencialmente presentes en el CE, utilice disolventes que contengan el 0,1% del ácido fórmico (FA).
    2. Diluir la muestra en el disolvente (o mezcla de disolventes) más adecuado para obtener una solución de muestra de 100 mg/ml. A continuación, transfiera 1 ml de la solución de muestra a un cartucho de extracción en fase sólida precondicionado - SPE (1 g de adsorbente, 6 ml de capacidad).
    3. Realizar el fraccionamiento utilizando alrededor de tres volúmenes muertos de cada eluent de extracción (a un cartucho de 1 g, corresponderá a 2 ml de cada disolvente). Si los alcaloides están potencialmente presentes en el CE, utilice disolventes que contengan el 0,1% de fa.
    4. Recoger una fracción por composición eluent y ahorrar alícuotas para el análisis químico simultáneo y bioensayos.
    5. Retire el disolvente bajo vacío, flujo de nitrógeno o liofilización y registre el peso y el rendimiento.
      NOTA: Si el CE es difícil de disolver en la mezcla de elución inicial, disperse el CE en una fase sólida (por ejemplo, C18 o celita) en proporción de 1:1 (w/w) antes de cargar el material en la parte superior del cartucho.
      PRECAUCIÓN: Pesar los microtubos de antemano para calcular el rendimiento en masa de extractos y fracciones.
  3. Análisis de perfiles químicos
    NOTA: Teniendo en cuenta que cada especie de planta requiere métodos optimizados y específicos para su análisis químico, en las secciones siguientes, describimos los enfoques analíticos más comunes utilizados para analizar los materiales vegetales. Como ejemplo práctico, se desarrolló y validó una cromatografía líquida en fase inversa para el análisis simultáneo de compuestos fenólicos y diterpenos de tipo clerodano biosintéticos diferencialmente por dos variedades de Casearia sylvestris Swartz (Salicaceae). El aparato UPLC-DAD estaba equipado con un degasser, una bomba cuaternaria, un sampler automático, un detector de matriz de fotodiodos UV-Vis y un horno (ver detalles en Bueno et al. 201518). Enfoques similares descritos en los siguientes ejemplos pueden optimizarse de acuerdo con otras especies vegetales y/o materiales vegetales.
    1. Posibilidades de análisis cromatográfico y partición
      1. Para separaciones utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC), utilice una columna cromatográfica C18 (por ejemplo, 150 × 2,1 mm, 2,6 μm, 100 Å) protegida por una pre-columna compatible.
        NOTA: Se pueden utilizar otras fases de columna o modos cromatográficos dependiendo de las especies/materiales vegetales. También se puede utilizar HPLC convencional; en ese caso, debe elegirse una columna cromatográfica adecuada. Para lograr excelentes separaciones, ajuste las condiciones cromatográficas teniendo en cuenta el caudal (μL/min), la temperatura de la columna (°C) y el volumen de inyección (μL). La fase móvil generalmente consiste en agua (A) y acetonitrilo o metanol (B) utilizando gradientes de elución lineales o multipaso o elución isocrática. También se pueden utilizar modificadores como búferes, ácidos, bases u otros.
      2. Realice el análisis de material vegetal (CE y/o CEF) y registre todos los datos relacionados, como datos espectrales (utilizando un detector UV-Vis y/o, preferentemente, MS), tiempo de retención (min) y otros, dependiendo de la partición disponible.
        NOTA: La cromatografía líquida (LC) suele estar dividida (acoplada) con espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), como LC-HRMS, y se utiliza comúnmente para la anotación rápida de metabolito en CE ou CEF15.
      3. Si se requieren datos cualitativos y se necesitan datos cuantitativos, prepare e inyecte cuidadosamente las curvas de calibración, siguiendo el mismo protocolo.
        NOTA: El desarrollo de las mejores condiciones cromatográficas se puede realizar con la ayuda del diseño de experimentos, como lo describen Bueno et al. 201518,o literatura similar. Es importante considerar la inclusión de normas internas durante el desarrollo del método. Son muy apreciados ya que permiten desviaciones técnicas correctas durante la preparación e inyecciones de la muestra, y una mayor normalización para el análisis de datos.
  4. Análisis de datos univariados y multivariantes
    1. Exporte los cromatogramas registrados en un formato adecuado (por ejemplo, ASCII, .txt. o formato .csv). Se puede establecer una única matriz de datos uniendo y alineando los cromatogramas si se están analizando varias muestras y se requieren comparaciones. Las matrices resultantes deben normalizarse los cromatogramas de acuerdo con el estándar interno utilizado.
    2. Analice los datos de metabolómica de la planta utilizando métodos multivariantes y univariados. Explore y visualice conjuntos de datos metabolómicos a través del análisis simultáneo de múltiples variables utilizando métodos estadísticos multivariantes, incluido el análisis de componentes principales (PCA) no supervisado y el análisis jerárquico de agrupación en clústeres (HCA), o el análisis parcial supervisado de mínimos cuadrados (como PLS, OPLS, PLS-DA). Los métodos univariatos, como ANOVA, Student's, Tukey y Welch's t-test, son especialmente interesantes para el análisis preciso de las diferencias cuantitativas entre las muestras19.
  5. Desreplicación y anotación de compuestos
    NOTA: El objetivo de este paso se dedica a la identificación rápida en línea de NPs conocidos para evitar el aislamiento tedioso que se puede realizar simultáneamente al análisis de datos uni- o multivariante.
    1. Realice los niveles de identificación de los compuestos detectados o objetivo:
      1. Compuesto identificado, incluyendo estructura 3D completa y estereoquímica (nivel 0);
      2. Identificación lograda por dos parámetros ortogonales, como el tiempo de retención y el espectro de EM/EM (nivel 1);
      3. Compuestos anotados de forma putativa y clases compuestas (niveles 2 y 3);
      4. Metabolitos no identificados o no clasificados que se pueden diferenciar en función de datos analíticos (nivel 4)19,20.
    2. Caracterizar los compuestos conocidos utilizando las bases de datos comerciales o públicas. Entre las bases de datos más importantes, cabe destacar: NIST (https://www.nist.gov), Wiley (https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm), MassBank (https://massbank.eu/MassBank/), GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/), METLIN (https://metlin.scripps.edu) y global Natural Products Social Molecular Networking – GNPS database (https://gnps.ucsd.edu)19.
      NOTA: Hay diferentes niveles de anotaciones y dependen de la técnica de guiones empleada durante el estudio y pueden incluir: la asistencia de bases de datos espectrales basadas en MS- (o NMR), y en algoritmos de predicción espectral silico.
    3. Aislamiento, purificación e identificación completa del compuesto
      NOTA: Si un compuesto dado (cuya identidad fue sospechada por los métodos estadísticos) necesita una identificación estructural completa, el primer paso para llevar a cabo esta tarea es aislar y purificar los compuestos deseados en una escala mayor. Se puede lograr ampliando los protocolos ya desarrollados.
      1. Realizar el aislamiento rápido y directo del compuesto objetivo (s) mediante técnicas cromatográficas bien establecidas y optimizadas. El HPLC semi-preparativo con inyección de carga seca se puede utilizar para evitar los compromisos que generalmente deben hacerse entre la alta carga y la solubilización de la muestra1.
      2. Lograr la caracterización estructural completa y la identificación de compuestos aislados. Esto se puede hacer a través de la combinación de diferentes técnicas:
        1. Resonancia Magnética Nuclear (RMN);
        2. Espectrometría de masas (EM);
        3. Las técnicas espectrométricas en las regiones ultravioleta (UV) e infrarroja (IR) también son muy útiles para la caracterización de los grupos funcionales;
        4. El uso de espectroscopia chirriótica como el dichroismo circular electrónico y vibratorio (ECD y VCD, respectivamente), la actividad óptica raman (ROA) y la cristalografía de rayos X son técnicas importantes para la caracterización de la configuración absoluta.

3. Bioensayos

NOTA: Cribado biológico: Para evaluar rápidamente la bioactividad potencial de CE y CEF, el cribado inicial de sustancias naturales debe organizarse y ser sencillo.

  1. Preparación de CE y CEF para bioensayos
    1. Reconstituir la materia seca con los mejores disolventes posibles (que se pueden determinar experimentalmente). El diseño experimental21,22 definen la solución de stock y la concentración de disolventes.
    2. Calcular la concentración de disolvente de la solución de stock. Para ello, utilice la fórmula: C1 x V1 = C2 x V2, donde C1 representa la solución de stock (mg) de CE y/o CEF; V1 representa el volumen de disolvente; C2 es el peso del CE y/o CEF; V2 es el volumen final (mL) de la solución de stock.
      NOTA: Por ejemplo, seleccionamos 84.15% EtOH y 15% sulfóxido de dimetil (DMSO) como la concentración solvente de la solución de stock. Preparamos la concentración de stock del CE a 6 mg/ml y el CEF a 1 mg/mL13. El disolvente para diluir el CE y el CEF dependerá del método de evaluación de la actividad biológica. El disolvente utilizado como vehículo no debe interferir con la actividad biológica y toxicológica. Normalmente, agua, DMSO, EtOH, o un disolvente acuoso basado en EtOH se utiliza para solubilizar extractos vegetales o derivados de plantas4,13.
  2. Preparación de organismos de ensayo
    1. Reactivar una cepa microbiana, por ejemplo S. mutans UA159 en agar sanguíneo (48 h, 37 °C, 5% CO2), y cultee en medio de cultivo líquido (por ejemplo, caldo de extracto de triptona-levadura [TYE: 2.5% (w/v) tryptone con 1.5% (w/v) extracto de levadura] que contiene 1% de glucosa (w/v) (TYEg) para 16 h, 37 ° C, 5% CO2.
    2. Realizar una dilución 1:20 del cultivo inicial del microorganismo en el mismo medio de cultivo (la relación de dilución del cultivo inicial puede cambiar según el diseño experimental).
    3. Incubar hasta que llegue a la fase de crecimiento de mediados del registro.
    4. Preparar el inoculum para bioensayos con una población definida (por ejemplo, 2x106 unidades formadoras de colonias por mililitro - CFU/mL) en TYEg para ensayos antimicrobianos y TYE con 1% de sacarosa (w/v) (TYEs) para ensayos de biofilms.
      NOTA: Las condiciones de crecimiento dependerán del microorganismo probado.
  3. Actividad antimicrobiana
    NOTA: Los pasos se ilustran en la Figura 3.
    1. En una placa de 96 pozos, agregue una alícuota (μL) de la solución de stock CE y/o CEF (tratamientos). El volumen del alícuota se define mediante la concentración de ensayo, que debe seleccionarse en función de estudios anteriores. Por ejemplo, para probar CE a la concentración de prueba de 0,5 mg/ml, utilice una alícuota de 16,67 μL de la solución de stock a 6 mg/ml. Para este cálculo, utilice la fórmula: C1 x V1 = C2 x V2,donde C1 es la concentración de stock, V1 es el volumen de la solución de stock aliquot, C2 es la concentración de prueba, y V2 es el volumen de la placa de 96 pozos (que corresponde a 200 μL). En esta condición experimental, la concentración de prueba de los disolventes (vehículo) será de 7% EtOH y 1.25% DMSO.
    2. Incluir un conjunto de controles para cada plato: una columna con tratamientos, sin el inóculo (control en blanco por tratamiento, ayudan a diferenciar la turbidez por el tratamiento utilizado por sí mismo del crecimiento microbiano); una columna con vehículo e inoculum (diluyente de CE o CEF o control de 0 mg/ml); una columna con sólo el medio de cultivo (control medio de cultivo) y una columna con sólo inóculo (control de crecimiento microbiano).
    3. Con TYEg, ajuste el volumen a 100 μL. A continuación, incubar, por ejemplo, 24 h, 37 °C, 5% CO2 (dependiendo del microorganismo probado).
    4. Inocular 100 μL de inoculum microorganismo (1x 106 CFU/ml) en la placa de 96 pozos.
    5. Analizar el crecimiento bacteriano según la turbidez mediante la inspección visual de los pozos (despejado o nublado). Claro: significa que no hay crecimiento visual del microorganismo. Nublado: significa que hay crecimiento visual del microorganismo.
    6. Medición de la absorbancia (densidad óptica o O.D.) del cultivo bacteriano en cada pozo (lector ELISA utilizando 540 nm). A continuación, transfiera 100 μL de los cultivos a microtubos que contengan 900 μL de solución salina (0,89% NaCl), mezcle bien por vórtice. A continuación, continúe realizando una dilución serie diez veces hasta el valor deseado.
    7. Inocular una alícuota de la dilución deseada en placas de agar específicas (en duplicado). Por ejemplo, 10 μL de una dilución específica en placas de agar sanguíneo.
    8. Incubar. Las condiciones pueden cambiar entre microorganismos, por ejemplo, S. mutans: 48 h, 37 °C, 5% CO2.
    9. Realizar recuentos de colonias en las placas para su posterior transformación en CFU/mL como (Unnúmero de colonias x 10n)/q. En esta fórmula,n es igual al valor absoluto de la dilución (0, 1, 2 o 3), y q es igual a la cantidad, en ml, pipeteada para cada dilución chapada en la placa de agar. Además, el CFU/mL se puede convertir a valores de registro.
      NOTA: Cuando se agregan extractos vegetales al medio de cultivo, puede producirse la precipitación de partículas de los extractos. Este hecho puede dificultar la interpretación de los resultados. Lo mismo ocurre cuando un lector de microplacas mide la turbidez ya que, en algunos casos, las células se agrupan en la parte inferior de la microplaca. Además, dependiendo del extracto utilizado, el color de los extractos de hojas vegetales puede dificultar la cuantificación de la turbidez23,24. Un método alternativo utiliza tintes que revelan si las células microbianas están metabólicamente activas o no24.
  4. Actividad antibiofilm
    NOTA: Los pasos para evaluar el efecto de los tratamientos en la formación de biofilmes se ilustran en la Figura 4.
    1. Formación y procesamiento de biofilms
      1. Diluir los tratamientos en medios de cultivo (TYEs) en una placa de 96 pozos como se describe en los pasos del protocolo de actividad antimicrobiana.
      2. Incuba el plato. En el ejemplo con S. mutans, la incubación se realiza durante 24 h, a 37 °C, y 5% CO2.
      3. Después de la incubación, coloque las placas en una coctelera orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm) para aflojar las células no adheridas al biofilm. A continuación, deseche el medio de cultivo que contiene las células no adheridas y lave los biofilms restantes tres veces con 0,89% NaCl para eliminar las células noadherentes.
    2. Cuantificación de biomasa a partir de biofilms tratados
      NOTA: Los pasos se ilustran en el diagrama de flujo en la Figura 4A.
      1. Mantenga los biofilms lavados en la placa y agregue 50 μL de solución acuosa violeta cristalina al 1% a cada pozo.
      2. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 35 min.
      3. Lave los pozos manchados con agua MilliQ (tres veces) y luego séquelos al aire durante 60-90 minutos.
      4. Elute la violeta cristalina de los pozos manchados con 200 μL de 99% EtOH incubando la placa en un agitador orbital (5 min, 37 °C, 75 rpm).
      5. Transfiera una alícuota de 150 μL de cada pozo con el tinte elutado a otra placa y cuantifique la biomasa de muestra (lector ELISA 570 nm).
    3. Cuantificación de la población microbiana viable (CFU/ml) de los biofilms tratados
      NOTA: Los pasos se ilustran en el diagrama de flujo en la Figura 4B.
      1. Retire los biofilms lavados de la placa con una pipeta y 200 μL de NaCl 0,89% y transfiera la suspensión resultante individualmente a microtubos estériles.
      2. Utilice 200 μL adicionales de NaCl 0,89% por pozo y transfiéralo al tubo correspondiente, que ya contiene 200 μL de la suspensión inicial del biofilm. Realice este proceso hasta alcanzar una suspensión total de 1 mL de biofilm por pozo original.
      3. Utilice una alícuota de cada tubo para realizar una dilución serie de diez veces.
      4. Inocular una alícuota de la dilución deseada en placas de agar específicas (en duplicado). Por ejemplo, 10 μL de una dilución específica en placas de agar sanguíneo.
      5. Incubar placas de agar (por ejemplo, 48 h, 37 °C, 5% CO2),luego contar las colonias para determinar la CFU/ mL como se describió anteriormente.
  5. Fase de validación de la actividad biológica
    1. Formación de pellicle salival
      1. Utilice cuentas de hidroxiapatita (HA) (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I 80 μm) como superficie para formar la película salival25. Estas cuentas superficiales imitan el esmalte dental.
      2. Pesar las cuentas de HA (por ejemplo, 10 mg) en microtubos y esterilizar. A continuación, utilice el búfer de adsorción (búfer AB: 50 mM KCl, 1 mM KPO4, 1 mM CaCl2,1 mM MgCl2, en dd-H2O, pH 6.5]25 que contiene 0.1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) y 0.02% azida sódica (NaN3)para lavar las cuentas.
      3. Recoger y preparar saliva humana26. Es necesario contar con la aprobación del comité de ética institucional.
      4. Añadir 500 μL de saliva en microtubos e incubar (40 min, 37 °C, 24 rpm).
      5. A continuación, retire el sobrenadante de saliva y lave las cuentas (tres veces con el búfer AB que contiene PMSF y NaN3). Las cuentas sHA (cuentas HA con pellicle salival) ya están listas para ensayos posteriores.
        NOTA: La saliva se recoge de voluntarios sanos. Después de la recolección, diluya la saliva (1: 1 v/v) con amortiguador AB y centrífuga (1699 x g, 20 min, 4 °C). Esterilizar por filtración (filtro de membrana polietersulfone con baja unión a 0,22 μm de proteínas)26. El Comité de Ética Institucional debe aprobar el estudio. En nuestro caso, el Comité de Ética de la Institución aprobó el estudio (CAAE: 68161417.0.0000.5416).
    2. Desprendimiento de S. mutans después de la adhesión a la película salival y glucanos tratados con extractos seleccionados
      1. Cultivar el microorganismo hasta la fase de crecimiento del tronco medio, como se describió anteriormente.
      2. Cuando los cultivos alcanzaron el O.D. deseado, centrífuga (4000 × g durante 20 min), lavar con solución NaCl 0.89% y resuspend el pellet con 0.89% NaCl utilizando el mismo volumen inicial del medio de cultivo.
      3. Si utiliza un estreptococos, como S. mutans,sonica los cultivos con una sonda para dechain (30 s, 7 W, tres veces). Si se utiliza un solo organismo celular, este paso se puede omitir.
      4. Compruebe el O.D. (540 nm) para ajustar la concentración a 2 x 106 CFU/mL.
    3. Adhesión de S. mutans al pellicle salival (sHA) y desprendimiento de células adherentes
      NOTA: Los pasos se ilustran en el diagrama de flujo en la Figura 5.
      1. Obtenga las muestras sHA como se describió anteriormente.
      2. Añadir una coartada (en el ejemplo, añadimos 500 μL) de tratamientos seleccionados (a la concentración de prueba; por ejemplo, 0,5 mg/ml) o controles en microtubos que contengan muestras de sHA.
      3. Incubar las muestras sHA con tratamientos o controles (30 min, 37 °C, 24 rpm); a continuación, lave las cuentas tres veces con el búfer AB (que contiene PMSF y NaN3).
      4. Añadir el cultivo de microorganismos. En el ejemplo, añadimos 500 μL de cultivo S. mutans (2 x 106 CFU/mL) a cada microtubo.
      5. Incubar (1 h, 37 °C, 24 rpm) y luego eliminar las células no enlazadas lavando tres veces con el búfer AB.
      6. Resuspend cada muestra con un aliquot (en el ejemplo, añadimos 1000 μL) de búfer AB y sonicato con una sonda (30 s, 7 W).
      7. Utilice una alícuota de cada suspensión para una dilución serie de diez veces para determinar el número de colonias viables amontonando en placas de agar específicas (48 h, 37 °C, 5% CO2). A continuación, cuente las colonias para determinar el CFU/ml como se describió anteriormente.
        NOTA: El paso del sonicato se realiza para separar las células adheridas a sHA.
    4. Adhesión de S. mutans a la matriz glucana inicial(gsHA)y desprendimiento de células adherentes
      NOTA: Los pasos se ilustran en el diagrama de flujo en la Figura 6. La enzima GtfB fue purificada a partir del cultivo superncial Streptococcus milleri KSB8 diseñado para producir GtfB. La purificación se realizó con una columna de cromatografía que contenía cuentas de hidroxiapatita utilizando tampones que contenían dos inhibidores de la proteasa (0,1 mM PMSF y 0,02% NaN3)27,28. Luego, la enzima se revisó en gel de acrilamida (SDS-PAGE) y se tiñó con nitrato de plata. Las alícuotas de la enzima se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
      1. Obtenga las muestras sHA como se describió anteriormente. A continuación, agregue una alícuota (en el ejemplo, añadimos 500 μL) de enzima GtfB a cada tubo e incubar en un homogeneizador (40 min, 37 °C, 24 rpm). A continuación, lave tres veces con el búfer AB (que contiene PMSF y NaN3).
      2. Añadir una alícuota (por ejemplo, 500 μL) de sustrato de sacarosa (100 mmol de sacarosa) que contenga los tratamientos (o controles en la concentración de prueba, por ejemplo, 0,5 mg/ml) a cada microtubo.
      3. Incubar las muestras en un homogeneizador (4 h, 37 °C, 24 rpm). A continuación, realice tres lavados con amortiguador AB (con PMSF y NaN3)para eliminar los tratamientos y el exceso de sacarosa no incorporado en los glucanos sintetizados (muestras de gsHA).
      4. Agregue una alícuota (en el ejemplo, añadimos 500 μL) de S. mutans inoculum (2 x 106 CFU/mL) a cada microtubo.
      5. Incubar en un homogeneizador (1 h, 37 °C, 24 rpm) y lavar tres veces con búfer AB (con PMSF y NaN3)para eliminar las células no enlazadas.
      6. Resuspend cada muestra con un aliquot (por ejemplo, 1000 μL) de búfer AB (con PMSF y NaN3)y sonicato con una sonda para separar células adheridas a gsHA (30 s, 7 W).
      7. Utilice una alícuota de cada suspensión para una dilución serie de diez veces para determinar el número de colonias viables amontonando en placas de agar específicas (48 h, 37 °C, 5% CO2). A continuación, cuente las colonias para determinar el CFU/ml como se describió anteriormente.

4. Análisis biológico de datos

  1. Datos de bioensayos
    1. Introduzca datos sin procesar para los bioensayos en una hoja de cálculo. Calcular el registro de inhibición del crecimiento microbiano por cada tratamiento como (ACFU/mL de tratamientos + 1) x log10. A continuación, calcule el porcentaje de registro de inhibición del crecimiento microbiano, en comparación con el control del vehículo utilizando (Unregistro10 CFU/ml de tratamiento/media Unregistro10 CFU/mL de control del vehículo)x 100%.
    2. Correcto O.D. de cultivos planctónicos y biomasa tratadas por tratamientos (grupos tratados por CE y CEF) y por control del vehículo (control negativo). Para la corrección, reste la absorbancia de los pozos tratados de la obtenida en pozos que contengan sólo medio de cultivo (Ablank) como (Medio decontrol medio/A degrupos tratados) x 100%.
    3. Después de esta corrección, calcule el porcentaje de la inhibición de la biomasa, en comparación con el control del vehículo como (Unabiomasa tratada/media Uncontrol del vehículo)x 100%.
    4. Envíe los datos sin procesar generados para el análisis estadístico de los datos utilizando software específico.
      NOTA: La interpretación de la eficacia de un tratamiento determinado se determina mediante puntos de interrupción, como el IC50/IC90. Estos valores se definen como la concentración mínima de un tratamiento capaz de inhibir el 50% y el 90%, respectivamente, del crecimiento bacteriano o la formación de biofilm24. Estos parámetros pueden ayudar a interpretar los datos y proporcionar una base para seleccionar compuestos con mejor actividad13,29.

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Resultados

Proporcionamos un ejemplo de uso de un enfoque sistemático para examinar la actividad biológica de extractos y fracciones vegetales para identificar moléculas potencialmente activas para posibles nuevas terapias anti-caries: actividades antimicrobianas y antibiófonas de extractos de Casearia sylvestris de biomas brasileños distintos contra Streptococcus mutans y Candida albicans13.

Fondo
Las interacciones complejas entre mi...

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Discusión

Los principales desafíos relacionados con el trabajo con extractos de crudo natural comprenden su composición compleja y las insuficiencias de los estudios clásicos de aislamiento bioguiado. Aunque este proceso es lento, es eficaz y ha llevado a importantes hallazgos en la investigación np. Para racionalizar, se necesitan estudios basados en la priorización para racionalizar. Por lo tanto, el uso de enfoques modernos de elaboración de perfiles químicos para el análisis del CE y la desreplicación antes del aislamiento son...

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Divulgaciones

No se declararon conflictos de intereses.

Agradecimientos

Expresamos nuestro agradecimiento al Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais (NuBBE) del Instituto de Química de la UNESP, Araraquara/SP por proporcionar los laboratorios para la preparación de material vegetal. También agradecemos al Laboratorio de Microbiología Aplicada del Departamento de Materiales y Prostodoncia Dental, UNESP, Araraquara/SP. Esta investigación fue apoyada por una beca de investigación de la São Paulo Research Foundation (FAPESP #2013/07600–3 a AJC) y becas más fondos generales (FAPESP #2017/07408-6 y FAPESP #2019/23175-7 a SMR; #2011/21440–3 y #2012/21921–4 a PCPB). El Consejo Nacional para el Desarrollo Científico y Tecnológico en asociación con la FAPESP brindó apoyo adicional (INCT CNPq #465637/2014-0 y FAPESP #2014/50926-0 a AJC).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microplacas de 96 pocillos KasviFondo plano
Carbón activadoLABSYNTHEtapa
Molino analíticoIka LabortechniKModelo A11 Basic
Placas de agar sangreLaborclin
Columna cromatográfica C18Phenomenex Kinetex150 × 2,1 mm, 2,6 y micro; m, 100 y Acirc;
Dimetilsulfóxido Sigma-AldrichSolución
Lector de placas ELISABiochrom Ez
EthanolJ. T. BakerPara las etapas de extracción y fraccionamiento, y la composición
EtanolSigma-AldrichSolución
Acetato de etiloJ. T. BakerEtapa de fraccionamiento GraphPad
SoftwareLa JollaGraphPad Prism7
HexaneJ. T. BakerIncubadora de etapas
Thermo Scientific
IsopropanolJ. T. BakerPara la etapa
Liofilizador (un liofilizador)SavantModulyo
Nylon MilliporeLAC0.22 µ m x 13 mm
Agitador orbitalQuimis ModeloG816  M20
Poliamida cartucho de extracción en fase sólidaMacherey-Nagellimpieza y/o fraccionamiento
Gel de síliceMerck40– 63  μ m, 60 y delgados; Â
Cloruro de sodio (NaCl)Synth0,89% en agua
Cartuchos de extracción en fase sólida (SPE)Macherey-Nagellimpieza y/o fraccionamiento
TriptonaDifco
UHPLC-DADDionexUltimate 3000 RS
Baño ultrasónicoUNIQUEModelo USC 2800
Extracto de levaduraDifco
de limpieza y/o fraccionamientopara vehículosde fases móvilespara vehículosde fraccionamientode extracción Etapa de Etapa de

Referencias

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