Análisis del repertorio inmune del receptor de células T y B mediante secuenciación de próxima generación

Resumen

El protocolo actual describe un método para el aislamiento del ADN de muestras de sangre y biopsias intestinales, la generación de bibliotecas de TCRβ y IGH PCR para la secuenciación de próxima generación, la realización de una ejecución de NGS y el análisis de datos básicos.

Resumen

La memoria inmunológica, el sello distintivo de la inmunidad adaptativa, es orquestada por linfocitos T y B. En la circulación y diferentes órganos, hay miles de millones de clones únicos de células T y B, y cada uno puede unirse a un antígeno específico, lo que lleva a la proliferación, diferenciación y / o secreción de citoquinas. La gran heterogeneidad en las células T y B es generada por la recombinación aleatoria de diferentes segmentos genéticos. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), desarrolladas en la última década, permiten una visión en profundidad sin precedentes del repertorio inmunológico de los receptores de células T y B. Los estudios en varias condiciones inflamatorias, inmunodeficiencias, infecciones y malignidades demostraron cambios marcados en clonality, uso del gen, y propiedades biofísicas del repertorio inmune, proporcionando penetraciones importantes sobre el papel de inmunorespuestas adaptante en diversos desordenes.

Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para NGS del repertorio inmune de las células de T y de B de la sangre y del tejido. Presentamos una tubería a partir del aislamiento de ADN a través de la preparación de la biblioteca, la secuenciación en el secuenciador NGS y terminando con análisis básicos. Este método permite la exploración de células T y B específicas a nivel de nucleótidos o aminoácidos, y por lo tanto puede identificar cambios dinámicos en las poblaciones de linfocitos y parámetros de diversidad en diferentes enfermedades. Esta técnica está entrando lentamente en la práctica clínica y tiene el potencial para la identificación de nuevos biomarcadores, estratificación de riesgos y medicina de precisión.

Introducción

El sistema inmune adaptante, comprendido de linfocitos de T y de B, utiliza memoria inmunológica para reconocer un antígeno previamente encontrado e iniciar una respuesta rápida. Los linfocitos se generan en la médula ósea y maduran en el timo (células T) o la médula ósea (células B). Tanto el receptor de células T (TCR) como el receptor de células B (BCR) muestran configuraciones únicas que permiten el reconocimiento de antígenos específicos. En la homeostasis, las células T y B circulan y examinan constantemente los billones de péptidos diferentes presentados en las células presentadoras de antígenos. La ligadura TCR o BCR de un antígeno específico con alta afinidad....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del Sheba Medical Center, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos participantes.

1. Aislamiento y cuantificación del ADN

1. Digestión y lisis celular de biopsias intestinales
   1. Recuperar biopsias intestinales, ya sean recién recogidas o almacenadas a -20 °C u -80 °C. Si usa biopsias congeladas, descongele sobre hielo.
   2. Añadir 600 μL de solución de lisis de núcleos a un tubo de microcentrifuga estéril de 1,7 mL, refrigerado sobre hielo.
   3. Coloque la biopsia en un tubo de microcentrífuga con solución de lisis e in....

Resultados

Adjunto, describimos un método para el aislamiento de la DNA del tejido y de la sangre intestinales, la preparación de las bibliotecas para ngs, y los pasos básicos de un funcionamiento de la secuenciación para la secuencia del repertorio inmune. La ejecución generará archivos fastq, que se pueden convertir en archivos fasta para su uso en la plataforma internacional ImMunoGeneTics (IMGT) / HighV-QUEST. Este HTS realiza y gestiona muchos análisis de decenas de miles de secuencias tcrβ y IGH reorganizadas, a nivel de nucl.......

Discusión

Los cambios en la abundancia y la función de los linfocitos B y T se encuentran a menudo en diferentes neoplasias malignas^18,trastornos inflamatorios crónicos (por ejemplo, colitis ulcerosa y artritis reumatoide)^10,19,y en diversas inmunodeficiencias^17,20. El método actual utiliza NGS para facilitar una visión en profundidad de los repertorios de TCR y BCR, lo que permite la detecc.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2 propanol	Sigma	I9516-500ML
1,7 mL Tubos de centrífuga	Axygen	8187631104051
15 mL	Greiner	188261
Etanol absoluto	Merck	1.08543.0250
Amplitaq Gold	Thermo Fisher	N8080241
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
Bloque de calor	Bioer	No aplicable
Alta sensibilidad D1000 Tampón de muestras	Agilent	5067-5603	para cintas
de alta sensibilidad D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	para cintas. Los tubos se venden por separado
Kit de ensayo Lymphotrack	Invivoscribe	TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019	Cada uno incluye 24 índices
MiSeq Recomponent Kit v2 (500 ciclos)	Illumina	MS-102-2003	Incluye el tipo de celda de flujo estándar y todos los reactivos necesarios
MiSeq Sequencer	Illumina	SY-410-1003
Tiras de PCR	4titude	4ti-0792
Proteinasa K	Invitrogen	EO0491
Qubit 4 Fluorímetro	Thermo Fisher	Q33226
Qubit dsDNA HS Kit de ensayo	Thermo Fisher	Q32854	Incluye tampón, colorante, patrones y tubos especializados
Agitador	Biosan	No aplicable
Tapestation 2100 Bioanalizador	Agilent	G2940CA
ultra agua pura	Bio-lab	7501
Wizard Kit de aislamiento de ADN	Promega	A1120	Incluye solución de lisis celular, solución de lisis nucleial y tampón de precipitación de proteínas

Tubos de microcentrífuga de de