El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

La epidermis es la capa más externa de la piel, en la interfaz directa entre el cuerpo humano y el medio ambiente externo. Sus principales funciones son proporcionar protección e hidratación^1. La epidermis actúa como una barrera física eficaz contra los agentes externos y previene la pérdida excesiva de agua del cuerpo. Estas funciones de la piel dependen principalmente de la disposición celular en las capas más externas de la piel, la composición y la organización de los lípidos intercelulares². La epidermis se compone principalmente de queratinocitos que migran hacia arriba hacia el lado externo del tejido y se someten a la diferenciación. Existen 4-5 capas epidérmicas que se caracterizan por su etapa de diferenciación. Del interior al exterior, las capas epidérmicas parten de la epidermis viable, es decir, el estrato basal (SB), el estrato espinoso (SS) y el estrato granuloso (SG), hasta la capa superior no viable, es decir, el estrato córneo (SC)^3. La capa basal está compuesta principalmente por queratinocitos enriquecidos con queratina proliferantes, que migran a través de las SS tras la diferenciación^4. Durante la maduración de los queratinocitos, se producen varios cambios en la expresión y estructura de las proteínas. Los queratinocitos se adhieren a través de la formación de uniones desmosómicas⁵. En el SG se inicia la generación de cuerpos laminares. Consisten en precursores lipídicos y enzimas que son cruciales para la formación de la función barrera cutánea⁶. El SG también se caracteriza por la presencia de gránulos de queratohyalina en el citoplasma de los queratinocitos. En la interfaz con el SC, el contenido de los cuerpos laminares se extruye en los espacios intercelulares y los lípidos no polares como ceramidas, colesterol y ácidos grasos libres se organizan en bicapas lipídicas laminares apiladas para formar la matriz lipídica extracelular^7. En el SC, las células pierden todos los orgánulos celulares incluyendo el núcleo, debido a los procesos de degradación enzimática y adoptan una morfología aplanada. Están rodeados por una envoltura cornificada hecha de capas de proteínas reticenadas, y se conocen como corneocitos^8,9. Los componentes demosomales están reticenados a la envoltura cornificada para formar corneodesmosomas y unir los corneocitos. El epitelio resultante se renueva continuamente a partir de células madre, con un tiempo de rotación de aproximadamente 5-6 semanas¹⁰. El proceso de diferenciación de los queratinocitos, que resulta en una epidermis completamente estratificada, es crucial para la formación de la función barrera de la piel¹¹.

Durante la herida y la inflamación, los queratinocitos inducen cambios en las moléculas de adhesión y los receptores de superficie y desencadenan respuestas proinflamatorias a través de la secreción de citoquinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos^12. La piel no es sólo una barrera física contra las sustancias exógenas; también actúa como un sensor inmunológico tras la exposición a patógenos. Además, regula la difusión de varias sustancias a través de sus capas, como el contenido de agua para proteger el cuerpo humano de la deshidratación. La piel también participa en la síntesis de vitamina D y tiene varias otras funciones metabólicas^3,13,14.

Para evaluar los efectos adversos de las sustancias exógenas, los toxicólogos han confiado durante décadas en la experimentación con animales, pero hoy en día no es el enfoque preferido. Además de tener una capacidad predictiva limitada para la toxicidad humana, los modelos animales implican numerosas cuestiones éticas. La prohibición de la experimentación con animales en la industria cosmética y la recomendación de seguir el principio de las 3R (es decir, sustitución, reducción y perfeccionamiento) en la investigación han dado lugar al desarrollo de métodos de ensayo alternativos basados en enfoques in vitro¹⁵. Los primeros modelos in vitro de células cutáneas ya han sido descritos en los años 90, y se ha logrado un impresionante desarrollo de simples monocultivos de queratinocitos humanos a modelos de epidermis y espesor completo totalmente diferenciados^16. Hoy en día, la ingeniería de tejidos cutáneos ha ganado importancia tanto en el campo farmacéutico como en el dermato-cosmético. En las últimas dos décadas, varias compañías han comercializado epidermis humana reconstruida tridimensional (3D) (RhE) que representan herramientas estandarizadas y reproducibles para estudios relacionados con la piel. Se aceptan varios modelos comerciales de RhE para las pruebas in vitro de productos químicos en la piel de acuerdo con las directrices de la OCDE para las pruebas de irritación de la piel^17,18 (es decir, la directriz de ensayo 439¹⁹⁾y la corrosión de la piel²⁰ (es decir, la directriz de ensayo 431^21). La prueba in vitro para la sensibilización de la piel²² (es decir, el ensayo SENS-IS) se encuentra actualmente en la vía de aprobación y en revisión por pares²³. También hay numerosos otros ensayos desarrollados que utilizan modelos comerciales de RhE, para evaluar la fototoxicidad^24,para probar formulaciones de fármacos^25,formulaciones cosméticas e ingredientes activos^26,para estudiar la función de barrera cutánea²⁷ y para probar la respuesta biológica a los estresores ambientales^28,29,30,31.

Además de los modelos de piel 3D disponibles en el mercado, múltiples grupos de investigación han desarrollado sus propios RhEs^{32,33,34,35,36,37.} Los RhEs internos ofrecen la ventaja para controlar las condiciones de la cultura según el propósito del estudio. Específicamente, los investigadores pueden seleccionar el tipo y la fuente de los queratinocitos que se utilizarán para la reconstitución de su modelo epidérmico 3D (es decir, primario vs inmortalizado, neonatal vs. envejecido, donantes aleatorios individuales frente a donantes aleatorios agrupados, sexo, etnia, hábitos de vida individuales como fumar, etc.). Tienen la posibilidad de variar la composición del medio de cultivo e incorporar factores de crecimiento, vitaminas u otros compuestos que pueden modular la expresión de proteínas diana o lípidos. Con los RhEs internos, los investigadores también pueden investigar las respuestas biológicas y las propiedades biomecánicas en función del estado de diferenciación del modelo 3D. Además de esos parámetros intuitivos, hay esfuerzos continuos para aumentar la complejidad de los modelos de piel 3D y hacerlos más relevantes fisiológicamente, por ejemplo, agregando otros tipos de células epidérmicas (por^ejemplo,melanocitos y células inmunes)^38,39,cultivando los queratinocitos sobre una matriz de colágeno poblada por fibroblastos^40,41,42,e incluyendo componentes de la red vascular^43,44,45.

Aunque es posible ajustar las condiciones del cultivo según las necesidades específicas, existen parámetros que deben respetarse para garantizar tanto la calidad como la relevancia de un RhE. Para cultivar los tejidos de RhE, los keratinocytes epidérmicos humanos normales (NHEKs) se siembran en los rellenos permeables específicos de la cultura cuya membrana sintética porosa separa los pozos en dos compartimientos, es decir, el compartimiento apical y basolateral. La porosidad de la membrana (es decir, un tamaño de poro de 0,4 μm) es tal que permite la formación de una monocapa celular en el compartimento apical sin migración de las células al lado del inserto basal, y la alimentación de los queratinocitos con nutrientes esenciales del medio de cultivo contenido en el compartimento basolateral. Al comienzo del proceso de reconstitución, los NHEKs se cultivan en condiciones sumergidas durante unos días para permitir su adhesión a la membrana. El nivel de calcio en ambos compartimentos se incrementa en comparación con la concentración de calcio utilizada para el cultivo 2D de NHEKs para ralentizar la proliferación de las células y promover en su lugar su diferenciación⁴⁶. Un gradiente epidérmico de calcio es esencial para regular la formación de barreras y la homeostasis^47,48. Los niveles altos de calcio (es decir, hasta 1,5 mM) promueven la formación de uniones intercelulares y modulan la formación de la envoltura cornificada durante la diferenciación terminal⁴⁹. Una vez que los queratinocitos forman una monocapa continua y firmemente adherente en la membrana de soporte, se elimina el medio del compartimento apical y el proceso de cultivo continúa en la interfaz aire-líquido (ALI) para estimular la estratificación y establecer una barrera epidérmica^50,51. Las condiciones específicas de cultivo son cruciales para obtener un epitelio completamente estratificado³⁶. Durante el proceso de reconstitución en ALI, el medio en el compartimiento basolateral se complementa con el factor de crecimiento del keratinocyte (KGF), la insulina, el calcio, y el ácido ascórbico. El ácido ascórbico juega un papel importante en la formación de una barrera lipídica sc apropiada, muy parecida a la de la piel humana nativa⁵². Los queratinocitos cultivados en medio suplementado con ácido ascórbico demuestran un fenotipo diferenciado, con un mayor número de gránulos de queratohyalina, así como laminillas lipídicas intercelulares organizadas en los interstiticos de los corneocitos^52. Dicha suplementación es esencial para mejorar la función de barrera epidérmica aumentando el contenido de envoltura cornificada y evitando el agotamiento de las reservas de antioxidantes hidrófilos^53,54. KGF, un mediador paracrino importante de la proliferación y de la diferenciación epidérmicas, se utiliza para estimular el NHEKs^55.

Las principales desventajas de las REs internas incluyen la pérdida de estandarización entre las instituciones de investigación y el aumento de la intensidad laboral y el consumo de tiempo (hasta 3 semanas en comparación con los modelos comerciales listos para usar). El objetivo del presente documento es abordar estos inconvenientes, sentando las bases para la producción a mayor escala. Además de las ventajas antes mencionadas de las REs internas, el protocolo actual tiene como objetivo reducir la variabilidad intra e interescal entre los tejidos, reducir los riesgos de contaminación y agilizar el proceso de cultivo.

El protocolo actual describe un método reproducible y robusto para cultivar RhEs usando NHEKs neonatal. Por otra parte, muestra resultados representativos de la caracterización de la morfología de rhes, integridad de la barrera, y la expresión de proteínas que son específicas para la diferenciación epidérmica. La estructura morfológica de RhEs fue examinada usando la coloración del hematoxylin y de la eosina (H&E) y la microscopia electrónica de transmisión (TEM). Para evaluar la integridad de la barrera, se midió la resistencia eléctrica transepidérmica (TEER) y el tiempo de exposición a Triton X-100 para reducir el 50% de la viabilidad tisular (ET_50). La formación de ensambladuras desmosomal (es decir, desmoglein 1) era analizada por la inmunofluorescencia (SI) para evaluar la adherencia del keratinocyte. La formación de proteínas estructurales epidérmicas (es decir, involucrin, loricrin, y filaggrin) fue evaluada y detectada con SI. Estas proteínas están implicadas en la formación de la envoltura proteica altamente reticenlada que rodea a los corneocitos SC y como resultado son marcadores importantes para la diferenciación epidérmica en estadio tardío^56,57. Además, if fue utilizado para analizar la queratina 10, una proteína inducida en células diferenciadas en etapa temprana en los SS⁵⁸ y encontrada dentro de todas las capas diferenciadas. Finalmente, el RhE' la respuesta de s a los estímulos proinflammatory (es decir, alfa del factor de necrosis del lipopolysaccharide y de tumor) fue investigada. Los niveles de interleucina 1 alfa (IL-1α) e interleucina 8 (IL-8) se midieron en los medios de cultivo celular, utilizando ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA).

Revisar y adherirse a las consideraciones y condiciones éticas nacionales e internacionales relacionadas con el uso de células o tejidos humanos antes de planificar y ejecutar cualquier actividad de investigación que involucre este protocolo.
NOTA: Todos los pasos de este protocolo deben llevarse a cabo en condiciones asépticas. Las prácticas de nivel 2 de bioseguridad son el requisito mínimo para el cultivo de rhEs. Se deben tomar todas las precauciones de seguridad necesarias al manipular los productos químicos/reactivos descritos en este protocolo.

1. Preparación de medios de cultivo celular

NOTA: Existen tres tipos diferentes de medios de cultivo sin suero utilizados para el cultivo de RhEs (Tabla 1): (i) el medio basal con bajo nivel de calcio (60 μM Ca²⁺⁾utilizado para el cultivo 2D de NHEKs; (ii) el medio sumergido con alto nivel de calcio (1,5 mM Ca²⁺⁾utilizado para la siembra de NHEKs en el sistema de inserción de cultivos celulares; y (iii) el medio de la interfaz aire-líquido (ALI) con el alto nivel del calcio (1,5 milímetros Ca^2+),el ácido ascórbico, y el factor de crecimiento del keratinocyte (KGF).

Tabla 1. Tabla sinóptico de los diferentes medios de cultivo utilizados para cultivar RhEs. Lista de diversos medios de la cultura con los suplementos.

1. Preparar el medio basal.
   1. Complemente la botella de 500 ml de medio de crecimiento de queratinocitos(Tabla de materiales)con 5 ml de suplementos de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS) para alcanzar concentraciones finales de 0,2% [v/v] de extracto de hipófisis bovina (BPE), 0,2 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (EGF), 0,18 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de transferrina bovina y 0,01 μg/mL de factor de crecimiento similar a la insulina humana recombinante I (IGF-I).
   2. Añadir 5 mL de solución antibiótico-antimicótica de 100x que contenga 10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina y 25 μg/mL de anfotericina B.
2. Prepare el medio sumergido.
   1. Complementar el frasco de 500 mL de medio de crecimiento de queratinocitos(Tabla de Materiales)con 5 mL de HKGS para alcanzar concentraciones finales de 0,2% [v/v] de BPE, 0,2 ng/mL de EGF recombinante humano, 0,18 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de transferrina bovina y 0,01 μg/mL de IGF-I recombinante humano.
   2. Añadir 5 mL de solución antibiótico-antimicótica 100x.
   3. Añadir 5 mL de una solución común de CaCl 2 (cloruro de calcio) de_0,144 M para alcanzar una concentración final de 1,5 mM^ca2+.
      NOTA: La concentración de calcio ya está aumentada durante la fase sumergida para estimular la diferenciación de los queratinocitos e iniciar el proceso de estratificación^49.
3. Prepare el medio de interfaz aire-líquido (ALI).
   1. Complemente una botella de 500 mL de medio de crecimiento de queratinocitos(Tabla de Materiales)con 5 mL de HKGS para alcanzar concentraciones finales de 0,2% [v/v] de BPE, 0,2 ng/mL de EGF recombinante humano, 0,18 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de transferrina bovina y 0,01 μg/mL de IGF-I recombinante humano.
   2. Añadir 5 mL de solución antibiótico-antimicótica 100x.
   3. Añadir 5 mL de una solución de culata de CaCl_{2 de 0,144} M para alcanzar una concentración final de 1,5 mM Ca^2+.
   4. Añadir 1 mL de una solución de 25 mg/mL de ácido ascórbico para alcanzar una concentración final de 50 μg/mL de ácido ascórbico.
   5. Añadir 50 μL de un KGF de 100 μg/mL en albúmina sérica bovina al 1% [p/v] en solución de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para alcanzar una concentración final de 10 ng/mL kgf.
      NOTA: Dado que el ácido ascórbico es sensible a la oxidación, se recomienda utilizar un derivado estable del ácido ascórbico, como el magnesio l-ascorbilal-2-fosfato⁵⁹ o el ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio^60. Si se usa ácido ascórbico, se recomienda complementar recientemente el medio ALI con ácido ascórbico antes de cada refresco.

2. Cultura de nheks

NOTA: Dado que los queratinocitos humanos primarios siguen siendo proliferativos en su cuarto o quinto paso^61,NHEKs en su tercer paso se utilizan para el cultivo de RhEs. Los queratinocitos primarios deben manipularse con mucho cuidado debido a su alta sensibilidad. El pipeteo cuidadoso y lento de las suspensiones celulares en cualquier momento es muy importante, para no perturbar la condición de las células.

1. Descongelar un vial con 1 x^{10 6} NHEKs criopreservados en un baño de agua a 37 °C, sumergiendo parte del vial en el agua. Incubar el vial durante 1-2 minutos en el baño de agua, hasta que sólo una pequeña astilla de hielo es visible.
   PRECAUCIÓN: No sumerja todo el vial en el baño de agua para evitar contaminaciones. No descongele las células más de 2 minutos; esto puede reducir la viabilidad celular. Limpie el vial con una solución de etanol al 70% antes de transferir el tubo a la campana laminar.
2. Resuspend las células con mucho cuidado, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Transferir la suspensión celular a dos matraces T75 que contengan un total de 15 mL de medio de descongelación precalentado, lo que da como resultado una densidad de siembra de 6,7 x 10⁴ células/cm².
   NOTA: Para los dos primeros pasajes y el descongelamiento de los NHEKs criopreservados, el medio de cultivo celular se utiliza de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
3. Coloque los frascos en la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% de_CO2y 95% de humedad relativa (RH)).
4. Después de aproximadamente 24 horas, reemplace el medio de descongelación por el medio basal para eliminar el sulfóxido de dimetilo (DMSO) de la solución de congelación de queratinocitos.
5. Refrescar el medio basal cada dos días.
6. Después de 4-6 días de cultivo, las células deben estar alrededor del 80% confluentes y listas para la siembra en inserciones para el cultivo de RhEs.
   NOTA: Los queratinocitos deben cultivarse hasta un máximo del 80% de confluencia para preservar su capacidad proliferativa^62. El número de células a descongelar debe tener en cuenta varios parámetros, como el número de paso de la célula, la viabilidad de la célula al descongelarse, la eficiencia de siembra, así como el tiempo de duplicación.

3. Siembra de NHEKs

NOTA: Este protocolo está diseñado para su uso dentro de un formato de placa portadora de 24 pozos. Si se requieren otros formatos de placa (por ejemplo, formato de 12 o 6 pozos), se deben considerar optimizaciones en la densidad de siembra y el volumen medio. La Figura 1 resume una línea de tiempo propuesta para el cultivo de RhE y muestra las condiciones de cultivo.

Figura 1:Línea de tiempo esquemática del protocolo de reconstitución. Presentación del modelo rhE preparación, proceso de cultivo y aplicación (exposición a sustancia química). El esquema incluye los tipos de medios de cultivo celular apropiados para cada paso. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

1. Prellene las placas de 24 pocillos con 1,5 mL de medio sumergido, idealmente utilizando una pipeta dispensadora.
2. Retirar el medio basal de los matraces T75 utilizados para el cultivo de los NHEKs.
3. Enjuague las células añadiendo 5 ml de PBS precalentado a cada matraz T75.
4. Retire el PBS de los matraces.
   NOTA: Este paso es crucial, ya que el medio contiene proteínas y calcio que inhibirán la actividad de la tripsina.
5. Añadir 2-3 ml de tripsina/ácido tetra acético (EDTA) precalentado al 0,05% [v/v] de tripsina/diamina de etileno (EDTA) a cada matraz T75. Asegúrese de que la solución de tripsina esté igualmente distribuida en el área de cultivo celular del matraz.
   PRECAUCIÓN: El volumen de 2 mL se basa en la confluencia del 80% mencionada anteriormente. Utilizar 3 mL para matraces con una mayor confluencia.
6. Colocar los matraces durante 4 minutos en la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% de_CO2y 95% de RH). Compruebe si las células se desprenden con el microscopio a un aumento de 10x. Rap el matraz contra la palma de la mano para ayudar a las células a liberarse de la superficie del matraz. Las células separadas se pueden observar como células redondeadas que flotan en la solución de tripsina.
   PRECAUCIÓN: No incube las células en tripsina durante más de 6 minutos. La sobre-tripsinización puede dañar las células y disminuir su adherencia⁶³.
7. Una vez que todas las células estén separadas, agregue un volumen igual (es decir, 2-3 mL) de inhibidor de tripsina precalentado a cada matraz T75.
8. Transfiera la suspensión de la célula de los matraces a un tubo de centrífuga.
9. Enjuague los frascos con 5 ml de PBS precalentado y transfiéralo al tubo centrífugo que contiene la suspensión celular.
   NOTA: Asegúrese de que la mayoría de las células se recogen comprobando el número de células residuales en los frascos bajo el microscopio. La superficie del matraz debe estar vacía en un 95%. Si este no es el caso, es posible repetir el paso de tripsinización (3.3-3.9). Sin embargo, tenga en cuenta que se debe evitar la re-tripsinización.
10. Centrifugar las células cosechadas a 400 x g durante 5 min.
11. Deseche cuidadosamente la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente 100-200 μL en el tubo.
    PRECAUCIÓN: No aspire el pellet durante esteprocedimiento. 
12. Resuspend suavemente el pellet de células en un volumen bajo de medio sumergido, pipeta hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces para asegurar una suspensión celular uniforme. Comience con un volumen bajo (es decir, 500 μL) para evitar la formación de agregados celulares y agregue hasta 1 mL de medio sumergido en total por matraz T75 inicial.
    NOTA: Mueva suavemente el tubo con los dedos para disolver cuidadosamente una parte del pellet celular en el sobrenadante.
13. Cuente las celdas de la suspensión utilizando el método de exclusión de tripano azul.
    1. Diluya la tinción azul tripano al 0,4% [v/v] y la suspensión celular en una proporción de 1:1, añadiendo 10 μL de mancha azul tripano al 0,4% [v/v] a 10 μL de suspensión celular. Agregue 10 μL de la solución a una diapositiva de conteo. Mida el recuento celular inmediatamente después de mezclar la suspensión celular con azul tripano, ya que el azul tripano comienza a disminuir la viabilidad celular después de la exposición más de 1 min^65.
       PRECAUCIÓN: El azul de Trypan fue mostrado para ser un mutágeno potencial, un agente carcinógeno, y un teratógeno^64. Maneje el tinte con cuidado y deseche los desechos de manera segura de acuerdo con las regulaciones locales del laboratorio.
       NOTA: Un enfoque alternativo al uso de azul tripano es el colorante no peligroso Erythrosin B⁶⁶.
14. Diluir la suspensión celular con medio sumergido adicional para alcanzar una concentración de 3,525 x 10⁵ células/mL en medio sumergido añadiendo el volumen V₂ como se muestra en la ecuación 1:
    
    _C1 = concentración celular contada en la suspensión celular obtenida en 3,12 (células/mL)
    V₁ = volumen utilizado para resuspend el pellet de células en 3,12 (mL)
    _C2 = concentración celular objetivo en la suspensión (es decir, 3,525 x 10⁵ células/mL)
    V₂ = volumen a añadir para alcanzar la concentración celular objetivo (mL)
    NOTA: La superficie del inserto de cultivo recomendado es de 0,47 cm^2; por lo tanto, la densidad de siembra correspondiente es de 3,75 x 10⁵ células/cm^2.
15. Realizar un segundo recuento celular (C₃) de la solución diluida obtenida en el paso 3.14. Utilice la ecuación 2 para calcular el volumen de suspensión celular (V₄₎que se sembrará en el inserto de cultivo:
    
    C₃ = concentración celular objetivo en la suspensión (es decir, 3,525 x 10⁵ células/mL)
    V₃ = volumen objetivo de la suspensión celular que se va a sembrar en el inserto de cultivo (es decir, 0,5 mL)
    C₄ = concentración celular contada en la suspensión diluida obtenida en 3,14 (células/mL)
    V₄ = volumen real de la suspensión celular que se va a sembrar en el inserto de cultivo (mL)
16. Cuelgue los 24 insertos de cultivo celular en la posición más alta de la placa portadora recomendada y transfiera la placa portadora a la placa de 24 pocillos precargada con medio sumergido (cf. 3.1).
    PRECAUCIÓN: Al transferir la placa portadora a la placa de múltiples pozos, asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre la membrana de inserción y el medio sumergido desde el compartimiento basal, ya que esto afectará la alimentación de las células y, en última instancia, comprometerá la viabilidad y morfología de RhE.
17. Agregue el volumen determinado V₄ (de la ecuación 2) de la suspensión de la celda a cada inserto.
    NOTA: Se recomienda utilizar la técnica de pipeteo inverso para dispensar con precisión la suspensión celular a los insertos de cultivo.
    PRECAUCIÓN: Asegúrese de no dañar la membrana al dispensar la suspensión celular en el inserto de cultivo. Una precaución es dispensar la suspensión celular a lo largo de la pared del sistema de inserción sin tocar la superficie de la membrana.
18. Después de la siembra, incube las placas de 24 pocillos durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, para superar un efecto de borde (es decir, distribución de temperatura no uniforme entre todos los pozos^67). No mueva las placas durante este tiempo.
19. Transferir las placas a la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% de_CO2y 95% de RH). Las células se mantienen en condiciones sumergidas durante tres días.
    NOTA: Para evitar la variabilidad del tejido, no apile las placas en la incubadora después de la siembra para asegurarse de que cada inserto reciba la misma cantidad de calor. Después de tres días (es decir, durante el cultivo de ALI), es posible apilar las placas.

4. Cultivo en la interfaz aire-líquido

1. Después de una incubación de tres días en la incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% de_CO2y 95% de RH), exponga las células que se han adherido a la superficie de la membrana a la LPA eliminando el medio sumergido del compartimento apical preferiblemente utilizando un sistema de aspiración y una pipeta Pasteur de vidrio.
   NOTA: Alternativamente, el medio sumergido del compartimento apical se puede quitar con una micropipeta manual.
2. Llene las nuevas placas de 24 pocillos con 1,5 mL de medio ALI precalentado fresco y transfiera las placas portadoras con las inserciones de cultivo a las nuevas placas de múltiples pozos.
3. Transfiera las placas de múltiples pozos de vuelta a la incubadora de cultivos celulares (37 °C, 5% de_CO2y 95% de RH).
4. Actualice el medio ALI cada 2-3 días durante 14 días.
5. Realice la actualización en dos pasos: 1) prepare una placa nueva que contenga 1.5 mL/pozo de medio ALI precalentado fresco y 2) transfiera la placa portadora a la nueva placa.
   PRECAUCIÓN: Durante todo el procedimiento de reconstitución, es mejor no quitar la tapa que cubre la placa portadora para mantener los RhEs protegidos de la contaminación potencial.
   NOTA: El paso ali es crucial para el desarrollo de un modelo epidérmico estratificado, ya que permite la diferenciación terminal de los queratinocitos⁶⁸. Después de ir a ALI, se requiere un control visual de las inserciones, para comprobar si hay 'tejidos permeados': gotitas medianas en la superficie del tejido procedentes del compartimento basolateral. Si la fuga ocurre en ali día 3, retire suavemente el medio de la inserción de cultivo sin tocar la superficie del tejido. Si la fuga persiste, se recomienda descartar los tejidos con fugas, ya que es una indicación de que no hay una formación de barrera correcta en el modelo rhE.
6. Al final del proceso de reconstitución, los tejidos pueden ser expuestos a varios factores de estrés para inducir, por ejemplo, estrés oxidativo o inflamación. En paralelo, se pueden tratar con compuestos químicos o ingredientes cosméticos. NOTA: Durante la exposición/tratamiento, los tejidos generalmente se mantienen en medio sumergido a partir de ALI D14. Cuando se espera que los tejidos estén expuestos/tratados durante un largo período de tiempo (es decir, 48-72 horas), se recomienda (i) iniciar la exposición/tratamiento antes en el proceso de cultivo de la ALÍ, como D7-D9, para evitar el adelgazamiento de las capas viables y el engrosamiento del SC, y (ii) incubar los tejidos en medio ali, para seguir estimulando la proliferación celular.
7. Para la recolección de RhE, recoja los tejidos y el medio de cultivo celular en el punto de interés para el análisis histológico, los ensayos de viabilidad, la extracción de proteínas / ARN y los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISAs).

Los NHEKs cultivados en 2D muestran una morfología tradicional con una forma poligonal consistente (Figura 2A). Como se describió anteriormente, los NHEKs se siembran en inserciones de cultivo después de alcanzar una confluencia de aproximadamente el 80%. La morfología de los RhEs era analizada usando la coloración de H&E y TEM. Después de 15 días en la LPA, se obtiene un tejido completamente estratificado según lo indicado por sus cuatro capas epidérmicas principales: la SB, la SS, la SG y la SC(Figura 2B). En la capa SB, las celdas tienen una forma de columna. A partir de la segunda capa hacia las capas superiores del RhE, los NHEKs se diferencian según lo observado por los cambios en la morfología celular (desde una forma columnar en la capa SB, hacia una forma espinosa en la capa SS). En la capa SG, las células tienen una forma más aplanada y muestran gránulos de queratohyalina (KG) que se representan como puntos púrpuras en el citoplasma. Su característica forma redonda y estelar está resaltada por flechas blancas en la imagen H&E (Figura 2C). Las células en el SC, se diferencian terminalmente y se aplanan totalmente y carecen de un núcleo de la célula. Los RhEs estratificados tienen un espesor total de 84,3 ± 2,4 μm y su SC tiene un espesor de 19,6 ± 3,2 μm(Figura 2D). Estos valores son comparables a los notificados para la piel humana nativa, es decir, 60-120 μm y 10-20 μm, respectivamente69. El número de capas viables es de 6-7, que es menor en comparación con el de la piel humana nativa, siendo aproximadamente 7-1470. El análisis ultraestructural de rhes en diferentes puntos de tiempo en el protocolo de reconstitución (es decir, 7, 10, 13 y 15 días) revela el proceso de cornificación de los RhEs con un mayor número de capas de corneocitos a lo largo del tiempo (Figura 2E). Después de 15 días en el ALI, el SC del tejido RhE está hecho de aproximadamente 15-25 capas, que es comparable al valor reportado para la piel humana nativa (es decir, 15-20 capas)69.

Figura 2:Queratinocitos primarios y epidermis humana reconstruida. (A) Imagen de microscopía de contraste de fase de queratinocitos primarios antes de sembrar en insertos. La barra de escala es de 50 μm.(B-C)H&E imagen de microscopía de campo brillante de RhE. La barra de escala es de 50 μm(B)y 25 μm(C). (D) Cuantificación del espesor de RhE y SC (media ± SEM, n=3). (E)Imágenes de microscopía electrónica de transmisión de secciones transversales de RhE después de 7, 10, 13 y 15 días en ALI. La barra de escala es de 4 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Según su etapa de diferenciación, los NHEKs que crecen en 3D muestran diferentes perfiles de expresión de proteínas según su etapa de diferenciación. La expresión de las proteínas específicas para la diferenciación del keratinocyte de la temprano-etapa (es decir, queratina 10), la diferenciación del keratinocyte de la tarde-etapa (es decir, involucrin, loricrin, y filaggrin), y la adherencia del keratinocyte (es decir, desmoglein 1) en RhEs fue determinada usando SI la coloración. La expresión de la involucrina aparece más predominantemente localizada en la capa SG ya que su expresión se inicia antes durante el proceso de diferenciación(Figura 3D),mientras que la filaggrina y la loricrina se expresan en las capas superiores(Figura 3B-C). La expresión de queratina 10 se encontró en todas las capas viables, excepto en la capa SB (Figura 3E). Las RhEs muestran uniones desmosómicas funcionales, como lo indica la expresión de desmogleina 1 en el espacio intercelular de las capas epidérmicas viables(Figura 3F). Para concluir, los cinco marcadores se expresan y localizan en las capas epidérmicas apropiadas y se traducen en un proceso de diferenciación epidérmica saludable.

Figura 3:Diferenciación epidérmica, adhesión tisular e integridad tisular de la epidermis humana reconstruida. (A)H&E imagen de microscopía de campo brillante de RhE. Imágenes de microscopía de fluorescencia confocal de(B)filaggrina (FLG),(C)loricrina (LOR),(D)involucrina (INV),(E)queratina 10 (K10), y (F) desmogleina 1 (DSG-1) representada en magenta. La tinción de núcleos (DAPI) se representa en azul. La barra de escala es de 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las propiedades de barrera del modelo RhE se investigaron mediante la evaluación de la viabilidad del tejido y la integridad. La integridad tisular se determinó después de 15 días midiendo el TEER utilizando un volthmímetro. Los valores de 2567 ± 415 Ω,cm2 registrados para los RhEs traducen la formación de una barrera continua (Figura 4A). Esos valores están en rango con los reportados para los modelos RhE71,72,73,74. Además, el tiempo de exposición requerido para un producto químico de referencia citotóxico (es decir, Triton X-100) para reducir la viabilidad del tejido en un 50% (ET50)se determinó con un ensayo de bromuro de tetrazolio azul tiazolilo (MTT). El valor de ET50 medido para el RhE fue de 2,1 horas. Este valor se encuentra dentro del rango de aceptación de otros modelos epidérmicos 3D que están calificados para una predicción fiable de la clasificación de la irritación (Directriz 439 de la OCDE)19.

Figura 4: Propiedades de barrera de la epidermis humana reconstruida. (A) Integridad tisular medida con resistencia eléctrica transepitelial (media ± SEM, n= 6). (B)ET50 determinado midiendo la viabilidad tisular (es decir, ensayo MTT) tras la exposición tópica a 78,3 μL de Tritón X-100 al 1% (media ± SEM, n=3).

La sensibilidad de RhEs fue investigada sobre estímulos proinflammatory sabidos. Los RhEs fueron tratados sistémicamente, es decir, adición de estímulos en el medio del compartimiento basolateral, usando el lipopolisacárido de Escherichia coli de 100 μg/mL (LPS) y el alfa del factor de necrosis de tumor de 40 ng/mL (TNF-α). Después de 24 horas de estímulos, el medio de cultivo celular fue recogido. La citotoxicidad se midió mediante un ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) y se comparó con los valores de un disruptor de membrana conocido, el detergente Triton X-100(Figura 5). Un aumento significativo (p < 0,05, ANOVA unidireccional, prueba de comparación múltiple de Dunnett) fue mostrado en actividad de LDH en los RhEs tratados con Triton X-100. Los tratamientos de los LPS y de TNF-α ambos demostraron no ser citotóxicos.

Figura 5: La citotoxicidad medida a través del ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH). Los datos se presentan como valores relativos al control, tejidos no tratados (CTRL); media ± SEM, n=9 (Tritón X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). La significación se probó con ANOVA unidireccional, la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Asterisco denota diferencia estadísticamente significativa en comparación con CTRL, ****p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

La liberación de interleucina 1 alfa (IL-1α) e interleucina 8 (IL-8) en el medio RhE se cuantificó mediante ELISAs. La Figura 6 muestra tanto la liberación cuantificada y relativa de IL-1α como de IL-8 por parte de los RhEs tras el desafío con LPS y TNF-α. El tratamiento con LPS dio lugar a una liberación inducida estadísticamente significativa (p < 0,05, prueba T de Student no emparejada) de IL-8 (9,6 ± aumento de 1,0 veces) e IL-1α (2,7 ± aumento de 1,3 veces). TNF-α no indujo perceptiblemente el lanzamiento IL-8, aunque una tendencia de los niveles crecientes IL-8 fue observada (aumento 2,3 ± 0,8 dobleces). Sin embargo, TNF-α perceptiblemente (p < 0,05, T-prueba de estudiante desapareada) accionaron el lanzamiento de IL-1α (aumento 1,8 ± 0,5 dobleces).

Figura 6: Respuestas proinflamatorias en la epidermis humana reconstruida. Concentraciones de liberación de IL-8 por el RhE sobre un desafío de 24 horas con LPS(A)y TNF-α (B). Los datos se representan como media ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C)Los datos se representan como la media del valor relativo en comparación con el control, los tejidos no tratados (CTRL) ± SEM, n = 8 (LPS), n = 3 (TNF-α). La concentración de IL-1α liberación de la RhE en un desafío de 24 horas con LPS(D)y TNF-α(E). Los datos se representan como media ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Los datos se representan como la media del valor relativo en comparación con CTRL ± SEM, n = 4 (LPS), n = 3 (TNF-α). La significación fue probada por una T-prueba de Student despareada. El asterisco denota diferencias estadísticamente significativas en comparación con CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Marc Eeman y Benedetta Petracca son empleados de Dow Silicones Belgium. Todos los demás autores no tienen nada que revelar.