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Immunology and Infection

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक संक्रमण पर प्रवाह साइटोमेट्री के साथ एम 1 और एम 2 मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं और विश्लेषण का ध्रुवीकरण

Published: September 18, 2020 doi: 10.3791/61807
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1, 1,4, 1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet, 2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh, 3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet, 4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

ERRATUM NOTICE

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव एम 1 में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है- या एम 2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज परिधीय-रक्त-मोनोसाइट्स के भेदभाव के आधार पर मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं के लिए जो जीएफपी-लेबल वाले उग्र तनाव एच37आरवी से संक्रमित हैं, और चयनित M1/M2 मार्कर की अभिव्यक्ति सहित 10-रंग पैनल का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया।

Abstract

मानव मैक्रोफेज इंट्रासेलुलर माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) संक्रमण की प्राथमिक मेजबान कोशिकाएं हैं और इस प्रकार तपेदिक (टीबी) के प्रतिरक्षा नियंत्रण में एक केंद्रीय भूमिका होती है। हमने एम 1 (शास्त्रीय रूप से सक्रिय) या एम 2 (वैकल्पिक रूप से सक्रिय) मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं में मायलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रतिरक्षा ध्रुवीकरण का पालन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्थापित किया है, जो 10-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल के साथ मूल्यांकन के माध्यम से मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं को देखता है जो विविध मैक्रोफेज में एमटीबी लेबल वाले दृश्य और गहरे लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। स्वस्थ रक्तदाताओं से प्राप्त मोनोसाइट्स को क्रमशः ग्रैनुलोसिट मैक्रोफेज-कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) या मैक्रोफेज-कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) के साथ भेदभाव का उपयोग करके एम 1 या एम 2 कोशिकाओं में ध्रुवीकृत किया गया था, जिसके बाद क्रमशः आईएफएन-γ और लिपोपॉलिसाकराइड (एलपीएस) या आईएल-4 के साथ ध्रुवीकरण हुआ। पूरी तरह से ध्रुवीकृत M1 और M2 कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए एमटीबी-GFP से संक्रमित थे इससे पहले कि अलग एमटीबी संक्रमित मैक्रोफेज 4 या 24 घंटे के बाद संक्रमण पर प्रवाह साइटोमेट्री के साथ दाग रहे थे । नमूना अधिग्रहण प्रवाह साइटोमेट्री के साथ किया गया था और डेटा का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया था। मैनुअल गेटिंग के साथ-साथ एक समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण (यूएपी) और फेनोग्राफ विश्लेषण के साथ आयामीता में कमी की गई थी। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप प्रभावी एम 1/एम 2 ध्रुवीकरण के परिणामस्वरूप CD64, CD86, TLR2, HLA-DR और CCR7 के असंक्रमित M1 कोशिकाओं पर ऊंचा स्तर की विशेषता है, जबकि असंक्रमित M2 कोशिकाओं ने M2 फेनोटाइप मार्कर CD163, CD200R, CD206 और CD80 के एक मजबूत अप-नियमन का प्रदर्शन किया । M1-ध्रुवीकृत कोशिकाओं में आम तौर पर M2-ध्रुवीकृत कोशिकाओं की तुलना में कम बैक्टीरिया होते थे। एमटीबी संक्रमण के बाद कई M1/M2 मार्कर को डाउनलेट किया गया था, जिससे पता चलता है कि एमटीबी मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को मिला सकता है । इसके अलावा, विभिन्न आकारों के 24 विभिन्न सेल समूहों को संक्रमण के बाद 24 घंटे में एम 1 और एम 2 असंक्रमित और एमटीबी संक्रमित कोशिकाओं के बीच विशिष्ट रूप से वितरित किया गया । इस M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल एमटीबी-मैक्रोफेज अनुसंधान में एक रीढ़ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में विशेष जरूरतों के लिए अपनाया जा सकता है ।

Introduction

मैक्रोफेज प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो ऊतक होमोस्टेसिस, सूजन और रोग विकृतियों के नियमन में महत्वपूर्ण योगदान देती हैं। जन्मजात प्रतिरक्षा का एक अनिवार्य घटक होने के नाते, कोशिकाओं का मोनोसाइट-मैक्रोफेज वंश परिवर्तित पर्यावरणीय संकेतों के जवाब में विषम फेनोटाइप व्यक्त करता है, जो विभिन्न शारीरिक और प्रतिरक्षाीय स्थानों के लिए उनकी प्लास्टिसिटी और अनुकूलन को प्रतिबिंबित करता है1। विकास कारकों के आधार पर, माइक्रोएनवायरमेंट में मौजूद साइटोकाइन और अन्य मध्यस्थों, मैक्रोफेज को दो प्रमुख रिवर्सिबल आबादी में वर्गीकृत किया गया है, प्रत्येक बैक्टीरियल नियंत्रण और निकासी में एक अलग भूमिका के साथ2:प्रो-भड़काऊ, शास्त्रीय रूप से सक्रिय M1-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज और विरोधी भड़काऊ, वैकल्पिक रूप से सक्रिय M2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज जो मूल रूप से टी हेल्पर (Th) सेलमेन नोक्चरल3की नकल करने के लिए नामित किए गए थे। प्रतिरक्षा ध्रुवीकृत मैक्रोफेज के इस समूह को अक्सर सरलीकृत माना जाता है, क्योंकि मैक्रोफेज सक्रियण और भेदभाव रैखिक नहीं होता है, लेकिन अधिक सटीक रूप से एक सातत्य के रूप में चित्रित किया जाता है जहां प्रत्येक जनसंख्या में रोग विकासऔर प्रगति4,5,6, 7के परिणाम में विभिन्न विशेषताएं और कार्यात्मक भूमिकाएं होती हैं। फिर भी, M1/M2 मैक्रोफेज मॉडल के साथ कई प्रयोगात्मक फायदे हैं जिनका उपयोग अनुसंधान के कई विभिन्न क्षेत्रों में किया जा सकता है।

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (एमटीबी) तपेदिक (टीबी) का कारक एजेंट है और हर सेकंड एक व्यक्ति को संक्रमित करने का अनुमान लगाया गया है और इसे दुनिया का सबसे घातक एकल संक्रामक एजेंट माना जाता है (ग्लोबल टीबी रिपोर्ट 2019)। चूंकि श्वसन तंत्र एमटीबी संक्रमण का मुख्य मार्ग है, इसलिए अल्वोलार मैक्रोफेज एमटीबी से संक्रमित होने वाली पसंदीदा मेजबान कोशिकाएं हैं और फेफड़ों में एमटीबी के लिए प्राथमिक बाधाओं और संक्रामक जलाशय दोनों का प्रतिनिधित्व करती हैं। विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में मैक्रोफेज ध्रुवीकरण का7 वर्षों में और अधिकांश प्रकाशित कार्य में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, विट्रो में मोनोसाइट संस्कृतियों का एम1 ध्रुवीकरण ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) द्वारा आईएफएन-γ और एलपीएस8, 9के साथ प्रेरित होता है, जबकि एम 2 ध्रुवीकरण मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और आईएल-410, 11के साथ प्रेरित होता है। एम1 मैक्रोफेज शक्तिशाली प्रभावक कोशिकाएं हैं जो इंट्रासेलर रोगजनकों के खिलाफ एंटीमाइक्रोबियल प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता करती हैं और एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा12में एक आवश्यक भूमिका निभाती हैं। दूसरी ओर, एम 2 मैक्रोफेज में एक विरोधी भड़काऊ कार्य, उच्च फैगोसाइटिक क्षमता होती है और मुख्य रूप से घाव भरने और ऊतक की मरम्मत के साथ-साथ परजीवी संक्रमण12में शामिल होते हैं। तदनुसार, एम 1 मैक्रोफेज को एम 2 मैक्रोफेज13की तुलना में एमटीबी के इंट्रासेलुलर नियंत्रण में अधिक प्रभावी माना जाता है। हालांकि , एमटीबी बैक्टीरिया में14 , 15 , 16,17को जन्मजात प्रतिरक्षा को विकृत करने के लिए मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को मिलानेकीक्षमता भी होती है ।

जबकि परिधीय रक्त18से प्राप्त मोनोसाइट्स के विभेदन से मैक्रोफेज उत्पन्न करना आम बात है, मैक्रोफेज भी प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)19 या चूहों से बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से20, 21से उत्पन्न हो सकते हैं। मोनोसाइट/मैक्रोफेज जनकों से प्राप्त प्राथमिक मैक्रोफेज कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए ये व्यवहार्य तकनीकें हैं जो परिपक्व मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं की समरूप आबादी में पैदा और अंतर करेंगी । हालांकि, ये प्रोटोकॉल शायद ही कभी प्राप्त कोशिकाओं के फेनोटाइप और कार्य पर गहरा ज्ञान प्रदान करते हैं और न ही वीवो में प्राप्त मैक्रोफेज के बीच देखी गई प्राकृतिक विषमता के लिए खाते हैं। चूंकि एमटीबी एक सख्त मानव रोगजनक है, इसलिए मानवीकृत मॉडल प्रणालियों में एमटीबी का अध्ययन करने का भी एक लाभ है। फ्लो साइटोमेट्री एक शक्तिशाली तकनीक है जो निलंबन22में एकल कोशिकाओं की कई फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विशेषताओं का आकलन करने की संभावना प्रदान करती है , जो 23,24, 24के रूप में स्थूल कोशिकाओं के साथ काफी चुनौतीपूर्ण हो सकती है । दृढ़ता से अनुयायी मैक्रोफेज की रासायनिक टुकड़ी के अलावा, एमटीबी संक्रमण कोशिकाओं के लिए एक महत्वपूर्ण तनाव कारक पैदा कर सकता है जो एमटीबी-संक्रमित मैक्रोफेज के प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण में जटिलता का एक और स्तर जोड़ता है।

इस प्रायोगिक प्रोटोकॉल में, हमने प्राथमिक परिधीय-रक्त-मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रतिरक्षा ध्रुवीकरण के आधार पर पहले से स्थापित मानव मैक्रोफेज संक्रमण मॉडल का उपयोग किया है जो उग्र प्रयोगशाला एमटीबी स्ट्रेन एच37आरवी से संक्रमित हैं, और चयनित एम 1 और एम 2 मार्कर25की अभिव्यक्ति सहित 10-रंग पैनल का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण किया गया है। यह प्रोटोकॉल एम 1 या एम 2 ध्रुवीकृत मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में एमटीबी संक्रमण के जवाबों का अध्ययन करने के लिए एक कुशल और प्रजनन योग्य विधि प्रदान करता है। इसके अलावा, अनुयायी एमटीबी-संक्रमित मैक्रोफेज पर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग हमें पारंपरिक एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज और एमटीबी संक्रमण के लिए उनकी देशांतर प्रतिक्रिया से जुड़े सतह मार्कर की एक किस्म का अध्ययन करने की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रोटोकॉल को अन्य रोगजनकों के साथ संक्रमणों की जांच के लिए, ट्यूमर विरोधी अध्ययनों में या भड़काऊ स्थितियों के अध्ययन में, नशीली दवाओं की स्क्रीनिंग आदि के लिए आसानी से अपनाया जा सकता है और मानव नैदानिक नमूनों में M1/M2 मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के आकलन के लिए भी शोषण किया जा सकता है ।

Protocol

स्वस्थ गुमनाम रक्तदाताओं से मानव परिधीय रक्त कारोलिंस्का विश्वविद्यालय अस्पताल, Huddinge, स्वीडन (नैतिक अनुमोदन Dnr 2010/603-31/4) में रक्त बैंक से प्राप्त किया गया था । स्वीडन की सार्वजनिक स्वास्थ्य एजेंसी (FOHM), सोलना, स्वीडन में बायोसेफ्टी लेवल-3 (बीएसएल-3) प्रयोगशाला में लाइव उग्र एमटीबी से जुड़े सभी प्रायोगिक कदम किए गए।

1. मीडिया, बफ़र्स और बैक्टीरियल संस्कृतियों की तैयारी

नोट: सामग्री की तालिका में सभी अभिकर्दकों और उपभोग्य सामग्रियों के बारे में विवरण प्रदान किए जाते हैं।

  1. आरपीएमआई पूरा माध्यम: 1 एमएम सोडियम पाइरुवेट, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 10 एमएम एचईपीई, और 10% हीट-इनएक्टिवेटेड भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक आरपीएमआई 1640। एमटीबी संक्रमण के साथ काम करते समय सेल कल्चर माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं से बचें।
  2. सीरम मुक्त आरपीएमआई माध्यम: पूरक आरपीएमआई 1640 1 एमएम सोडियम पायरुवेट, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन और 10 एमएम एचईपी के साथ।
  3. वॉश बफर: 0.05% (v/v) ट्वीन-80 युक्त फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) तैयार करें।
  4. FACS बफर: 2.5% (v/v) एफबीएस और 0.5 एमएम ईडीटीए वाले पीबीएस तैयार करें।
  5. फिक्सेशन बफर: पीबीएस को 4% फॉर्मलडिहाइड युक्त पीबीएस तैयार करें। सुनिश्चित करें कि यह उपयोग से पहले हौसले से तैयार किया जाता है, उदाहरण के लिए, 37% फॉर्मलडिहाइड के स्टॉक समाधान से मिलाया जाता है।
  6. परिव्ययीकरण बफर: डियोनाइज्ड पानी में 0.1% सोडियम साइट्रेट और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 जोड़ें।
  7. बफर को धोएं (इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए): 0.1% बीएसए और 0.1% ट्वीन-20 वाले पीबीएस तैयार करें।
  8. बफर को अवरुद्ध करना: पीबीएस को 0.1% बीएसए और 10% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) वाले पीबीएस तैयार करें।
  9. धुंधला बफर (इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए): पीबीएस को 0.1% बीएसए युक्त पीबीएस तैयार करें।
  10. टीबी पूरा माध्यम: पूरक मध्य ब्रूक 7H9 शोरबा के साथ ०.०५% (v/v) ट्वीन-८०, ०.५% (v/v) ग्लाइसेरोल, कानामाइसिन (20 μg/mL), 10% (v/v) मिडलब्रुक ओलेक एसिड, एल्बुमिन, डेक्सट्रोस और कैटलैस एनरिचमेंट (मिडलब्रुक ओएडीसी संवर्धन) ।
  11. बैक्टीरियल संस्कृतियां: मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं के संक्रमण के लिए, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करने वाले मानक उग्र एमटीबी प्रयोगशाला तनाव, एच 37आरवी का उपयोग करें। इस एमटीबी स्ट्रेन में एक पीएफपीवी2 प्लाज्मिड होता है जिसमें जीन एन्कोडिंग जीएफपी होता है, साथ ही कानमाइसिन प्रतिरोध के लिए एक जीन होता है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध कानमाइसिन युक्त संस्कृतियों में प्लाज्मिड-व्यक्त बैक्टीरिया के निरंतर चयन में सक्षम बनाता है। टीबी पूर्ण माध्यम में बैक्टीरिया को स्टोर करें और 70% ग्लाइसरोल (1:1 कमजोर पड़ने) -80 डिग्री सेल्सियस पर।

2. बफी कोट से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल अलगाव

नोट: एक वर्ग द्वितीय जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर मानव रक्त (संभावित संक्रामक) के साथ सभी काम करते हैं । त्यागने से पहले 15 मिनट के लिए कीटाणुनाशक के साथ अवशिष्ट रक्त उत्पादों को निष्क्रिय करें। इस मामले में स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त प्राप्त किया गया था। इस इन विट्रो मैक्रोफेज विभेदन प्रोटोकॉल की स्थापना 10 x 106 अलग पीबीएमसी/डोनर/वेल को शामिल करने के लिए की गई थी । प्रत्येक दाता से, एक बफी कोट में पूरे रक्त से निकलने वाले एक केंद्रित ल्यूकोसाइट निलंबन का लगभग 50 एमएल होता है, जो सामान्य रूप से 500-800 x 106 पीबीएमसी प्रदान करता है जिसमें से लगभग 10% या 50-80 x 106 मोनोसाइट्स प्राप्त किए जा सकते हैं।

  1. 50 एमएल ट्यूब में तैयार डेंसिटी ग्रेडिएंट मीडियम के 15 एमएल के ऊपर बफी कोट ब्लड का 15 एमएल लोड करें। धीरे-धीरे ट्यूब की दीवार पर पिपेट टिप झुकाव द्वारा घनत्व ढाल परत के शीर्ष पर रक्त को ओवरले करें।
  2. 0 त्वरण और 0 मंदी के साथ कमरे में अस्थायी (आरटी) पर 25 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर ट्यूबों स्पिन।
    नोट: अपकेंद्रण से पहले ध्यान से ढक्कन बंद करें और हमेशा अपकेंद्रित्र के बाद संभावित रिसाव के लिए ट्यूब धारकों की जांच करें।
  3. एक बाँझ पाश्चर पिपेट के साथ शीर्ष प्लाज्मा परत को हटा दें और उसके बाद ध्यान से एक बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके एक नए 50 एमएल ट्यूब में मोनोन्यूक्लियर सेल परत को इकट्ठा करें। 50 मिलीएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए पीबीएमसी गोली में सीरम-मुक्त आरपीएमआई माध्यम जोड़ें। आरटी में 5 मिनट के लिए 500 x g पर अपकेंद्रित्रण से कुछ समय पहले ट्यूब को उलटा करके ध्यान से मिलाएं।
  4. सुपरनेट को ध्यान से त्यागें और उंगलियों के भीतर ट्यूब के नीचे को फ्लिप करके सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  5. पीबीएमसी से घनत्व ढाल मध्यम संदूषण को दूर करने के लिए, 50 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए सीरम-मुक्त आरपीएमआई के साथ कोशिकाओं को 2-3 बार धोएं। आरटी में 5 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रलाइज करें। सेल सुपरनेटेंट पारदर्शी होने तक धोएं।
  6. सुपरनेट को त्यागें और सीरम मुक्त आरपीएमआई माध्यम के 20 एमएल में कोशिकाओं को फिर से रीसस्ट करें।
  7. ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग द्वारा कोशिकाओं की गणना करें, मैन्युअल रूप से हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके। 1:2 या 1:10 कमजोर पड़ने में ट्राइपैन ब्लू में सेल निलंबन को पतला करें 96 वेल प्लेट में सेल-ट्राइपैन ब्लू सैंपल को मिलाकर उदाहरण के लिए, 50 माइक्रोन + 50 माइक्रोन (हीमोसाइटोमीटर काउंटिंग के लिए) या 10 माइक्रोल + 10 माइक्रोन (स्वचालित सेल काउंटिंग के लिए) और लाइव सेल/एमएनएल का नंबर प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की गिनती करें।
    सावधानी: ट्राइपैन नीला जहरीला है और इसे एक अलग रासायनिक कचरे में छोड़ दिया जाना चाहिए।

3. मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं का भेदभाव और ध्रुवीकरण

नोट: मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं के भेदभाव और ध्रुवीकरण के लिए, एक प्रोटोकॉल जिसे हमने पहले एम0, एम 1-जैसी और एम 2 जैसी कोशिकाओं के साथ-साथ पूरी तरह से एम 1 और एम 2 ध्रुवीकृत कोशिकाओं के लिए स्थापित कियाथा, 25का पालन किया गया था। सादगी के लिए, यहां केवल पूरी तरह से ध्रुवीकृत M1 और M2 मैक्रोफेज वर्णित हैं।

  1. मोनोसाइट्स के अलगाव के लिए प्लास्टिक पालन का उपयोग करें। संक्षेप में, बीज हौसले से एक उपयुक्त एकाग्रता पर एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में PBMCs अलग, उदाहरण के लिए, 10 x 106 पीबीएमसी/अच्छी तरह से 2 मिलील सीरम मुक्त RPMI माध्यम में और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर इनक्यूबेट ।
  2. 2-3 घंटे के बाद, एक पिपेट के साथ गैर-अनुयायी कोशिकाओं को हटा दें और 1 एमएल सीरम-मुक्त माध्यम से 3 बार कुओं को धोएं। संलग्न कोशिकाएं मोनोसाइट्स हैं और इसमें कुएं में जोड़े गए कुल पीबीएमसी का लगभग 10% शामिल है, यानी, 10 x10 6 पीबीएमसी से प्राप्त10 6 मोनोसाइट्स को अच्छी तरह से जोड़ा गया है।
  3. मैक्रोफेज भेदभाव के लिए, एम 1 और एम 2 मैक्रोफेज ध्रुवीकरण के लिए क्रमशः 50 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ या एम-सीएसएफ युक्त एक कार्य समाधान तैयार करें, जो आरपीएमआई के 2 एमएल में शामिल किया गया है। संस्कृति 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% सह2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं।
  4. दिन 3 पर, सेल संस्कृति माध्यम के 1 एमएल को ध्यान से प्रत्येक कुएं की शीर्ष परत से हटा दें और कोशिका संस्कृतियों को ताजा आरपीएमआई पूर्ण माध्यम के 1 एमएल के साथ पूरक करें जिसमें एम-सीएसएफ या जीएम-सीएसएफ की दोहरी एकाग्रता शामिल है ताकि कुओं में ५० एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता प्राप्त की जा सके । 100 एनजी/एमएल/वेल के पूर्व-निर्मित कार्य समाधान में विकास कारकों को जोड़ें।
  5. 6 दिन, पूरी तरह से ध्रुवीकृत और परिपक्व एम 1 (इंटरफेरॉन-γ) प्राप्त करने के लिए सेल भेदभाव के अंतिम 18-20 घंटे के लिए विभिन्न उत्तेजनाओं को जोड़ें; IFN-γ, और लिपोपोलिनासैकराइड; एलपीएस (ई. कोलाई O55:B5)) या M2 (interleukin 4; आईएल-4) मैक्रोफेज। एम 1 ध्रुवीकरण के लिए, आरपीएमआई पूर्ण माध्यम में IFN-γ और एलपीएस तैयार करें और सेल संस्कृतियों में ५० एनजी/एमएल आईएफएन-γ और 10 एनजी/एमएलबी एलपीएस की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रति अच्छी तरह ५० माइक्रोन जोड़ें । M2 ध्रुवीकरण के लिए, RPMI पूर्ण माध्यम में आईएल-4 तैयार करें और सेल संस्कृतियों में 20 एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रति अच्छी तरह 50 माइक्रोन जोड़ें।
  6. एम0 ध्रुवीकृत मैक्रोफेज के भेदभाव के लिए, केवल एम-सीएसएफ के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें, बिना किसी अतिरिक्त साइटोकिन्स (एम 2-जैसे फेनोटाइप प्रदान करना)25।
  7. मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिका संस्कृतियों की आकृति विज्ञान को नियमित रूप से हल्के माइक्रोस्कोपी के साथ देखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि छोटे मोनोसाइट्स को बड़े मैक्रोफेज जैसी कोशिकाओं में विभेदित किया जाए। इसके अलावा, M1 और M2 ध्रुवीकरण के बीच संभावित रूपात्मक मतभेदों की निगरानी करें, यानी, अधिक गोल आकार25के साथ एम 2 कोशिकाओं की तुलना में विस्तारित और फैला एम 1 कोशिकाएं।
  8. 7 दिन, एकासिट-व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ प्लेटों को उग्र एमटीबी के साथ संक्रमण के लिए बीएसएल-3 प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें।

4. एमटीबी संस्कृतियों की तैयारी

नोट: निम्नलिखित चरण बीएसएल-3 सुविधा में किए जाने चाहिए। उग्र एमटीबी के साथ सभी काम के लिए, सुरक्षात्मक कपड़े, श्वसन सुरक्षा, और इथेनॉल प्रतिरोधी दस्ताने का उपयोग करें।

  1. बैक्टीरियल एलिकोट के 1 एमएल के साथ एक शीशी को पिघलाएं और 50 एमएल फ़िल्टर कैप ट्यूब में टीबी कंप्लीट मीडियम (1:10 कमजोर पड़ने) के 9 एमएल के साथ मिलाएं। संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर एक इनक्यूबेटर में निलंबन ।
  2. 24 घंटे के बाद, 10 मिनट के लिए 2,300 x ग्राम पर बैक्टीरियल सस्पेंशन स्पिन करें और ध्यान से माध्यम से डालना। एक नए 50 मिलीएल फ़िल्टर कैप कल्चर ट्यूब में ताजा टीबी पूर्ण माध्यम के 15-20 मिलील के साथ बैक्टीरियल गोली को फिर से खर्च करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें। सभी जीवाणु कोशिकाओं के लिए एक समरूप पोषक तत्वों की आपूर्ति बनाए रखने के लिए हर 2-3 दिनों में ट्यूब में बसे-नीचे बैक्टीरिया मिलाएं।
  3. 7-10 दिनों के बाद, 50 एमएल स्क्रू कैप ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले ऊपर और नीचे पाइपिंग करके बैक्टीरियल सस्पेंशन को ठीक से मिलाएं।
  4. 50 एमएल ट्यूब में बाँझ धोने बफर के 35-40 एमएल जोड़ें और 10 मिनट के लिए 2,300 x ग्राम पर बैक्टीरियल सस्पेंशन स्पिन करें। धुलाई के कदम एक बार दोहराएं। माइक्रोपिपेट के साथ पाइपिंग करके सीरम-मुक्त आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल में बैक्टीरियल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  5. सीरम-मुक्त आरपीएमआई माध्यम का एक और 9 एमएल जोड़ें और बैक्टीरियल झुरमुट को बाधित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए द्वितीय श्रेणी के जैवसेफ्टी कैबिनेट के अंदर बैक्टीरियल सस्पेंशन को सोनिकेट करें। बैक्टीरियल झुरमुटों के अधिकतम व्यवधान को सुनिश्चित करने के लिए पानी के स्नान सोनिकेटर में ट्यूब को बार-बार (3-4 बार) डुबोएं। बायोसेफ्टी कैबिनेट के अंदर रखे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर बैक्टीरियल सस्पेंशन के 1 मिलियन के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें। संदर्भ निर्धारित करने के लिए सीरम-मुक्त आरपीएमआई माध्यम का उपयोग करें।
  6. सूत्र का उपयोग कर कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की संख्या की गणना करें: (OD +0.155) /0.161 = Y, और वाई एक्स 107= वाई एक्स 106 सीएलयू/एमएल, उदाहरण के लिए, एक ओडी मूल्य 0.32 (0.32 + 0.155) /0.161 = 2.95, 2.95 x 107= 29.5 x10 6 6 सीएलयू/एमएमएल की बैक्टीरियल एकाग्रता प्रदान करता है।

5. मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं का एमटीबी संक्रमण

नोट: निम्नलिखित चरण बीएसएल-3 सुविधा में किए जाने चाहिए।

  1. एक नई बाँझ 50 एमएल ट्यूब में सीरम मुक्त आरपीएमआई माध्यम में बैक्टीरियल गोली को फिर से बढ़ाएं और अंतिम बैक्टीरियल एकाग्रता को लगभग 5 x 106 सीएलयू/एमएल में समायोजित करें।
  2. मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं वाले 6 अच्छी प्लेट (ओं) से कोशिका संस्कृति माध्यम को हटा दें। प्रत्येक कुएं में सीरम-मुक्त आरपीएमआई माध्यम का 1 एमएल जोड़ें। संक्रमण की बहुलता प्राप्त करने के लिए प्रति अच्छी तरह से बैक्टीरियल सस्पेंशन का 1 मिलीएल जोड़ें (एमओआई) 5:1, यानी, 5 x 106 सीएलयू प्रति 106 मैक्रोफेज 2 मिलील/वेल में और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2में 4 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  3. संक्रमण के बाद, कोशिकाओं को 3 बार बाँझ धोने बफर के 1 एमएल के साथ धोने के लिए बाह्य बैक्टीरिया को दूर करने के लिए। प्लेट को झुकाएं और ध्यान से कोनों से पूरे वॉश बफर को हटा दें। आरपीएमआई के 2 मिलील में एमटीबी संक्रमित मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं को एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पुनः खर्च करें और प्रवाह साइटोमेट्री से पहले एक और 24 घंटे (या अन्य समय-अंक) के लिए कोशिकाओं को प्रवाहित या प्रवाहित करने के लिए आगे बढ़ें।

6. एमटीबी संक्रमित मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला

नोट: निम्नलिखित चरण बीएसएल-3 सुविधा में किए जाने चाहिए। प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला ट्यूबों के बजाय एक ९६ अच्छी तरह से थाली में प्रदर्शन किया जा सकता है ।

  1. एमटीबी संक्रमित कोशिकाओं (और असंक्रमित नियंत्रण) को 6 अच्छी तरह से प्लेट (ओं) में कुओं से कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2के लिए 1 मिली लीटर के साथ इनक्यूबेशन द्वारा 1 मिलियन एफएस बफर के साथ अलग करें।
  2. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे कई बार यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं। हो सके तो माइक्रोस्कोपी से सेल टुकड़ी की पुष्टि करें। सेल निलंबन को प्रत्येक कुएं से एक स्क्रू कैप्ड माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 200 x g पर स्पिन करें। सुपरनेट को पिपिंग करके सावधानी से त्यागें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में सेल पेलेट को दो बार FACS बफर के साथ धोएं और 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें।
  4. कोशिकाओं को दाग (के बारे में 0.5 x10 6 से 1 x10 6 कोशिकाओं/ट्यूब) फ्लोरोक्रोम के लगभग 50μL कॉकटेल के साथ-TLR2 (AF647), CD206 (एपीसी-Cy7), CD163 (BV605), CD8 सहित मानव एंटीबॉडी संयुग्मित 0 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (पीई), सीडी 64 (पीई-चकाचौंध 594), एचएलए-डीआर (पीई-Cy5)(तालिका 1)के संयोजन में व्यवहार्यता डाई ज़ोंबी-यूवी के संयोजन में 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (रेफ्रिजरेटर) अंधेरे में।
  5. दाग कोशिकाओं को दो बार FACS बफर के 400 माइक्रोन के साथ धोएं और 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें।
  6. माइकोबैक्टीरिया की पूरी निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए अंधेरे में आरटी में 30 मिनट के लिए फिक्सेशन बफर (हौसले से तैयार) के 200 माइक्रोन के साथ दाग कोशिकाओं को ठीक करें।
  7. कोशिकाओं को दो बार 400 माइक्रोन के साथ धोएं FACS बफर और अतिरिक्त फिक्स बफर को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर स्पिन करें।
  8. एचएएस बफर के 400 माइक्रोल में फिक्स्ड सेल्स को रीसेल रीस्ट करें और नमूनों को बीएसएल-2 में फ्लो साइटोमेट्री के लिए बीएसएल-3 प्रयोगशाला से बाहर निकालने से पहले नए 1 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में ट्रांसफर करें। नमूना अधिग्रहण तक दाग कोशिकाओं को +4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।
    नोट: उन्हें बीएसएल-3 प्रयोगशाला से बाहर ले जाने से पहले 70% इथेनॉल के साथ ट्यूबों स्प्रे। फॉर्मलडिहाइड विषाक्त (कैंसरजनक) है और इसे द्वितीय श्रेणी के जैवसेफ्टी कैबिनेट में संभाला जाना चाहिए। फॉर्मलडिहाइड कचरे को एक अलग रासायनिक कचरे में छोड़ें।

7. फ्लो साइटोमेट्रिक डेटा अधिग्रहण और एमटीबी-संक्रमित मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं का विश्लेषण

नोट: चरण 7.1-7.2 ऊपर वर्णित प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला के अग्रिम में किया जाना चाहिए। सेल निर्धारण के बाद सेल झुरमुट और मिलकर रंगों के वियोजन के साथ समस्याओं से बचने के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला होने के बाद एमटीबी संक्रमित और असंक्रमित कोशिकाओं दोनों का नमूना अधिग्रहण 4-10 घंटे के भीतर किया जाता है।

  1. ऊपर वर्णित प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला होने से पहले, क्षतिपूर्ति मोतियों (सकारात्मक और नकारात्मक दोनों) का उपयोग करके स्टेनिंग पैनल(टेबल 1)में सूचीबद्ध प्रत्येक फ्लोरोक्रोम-कंजूगेटेड एंटीबॉडी के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल की भरपाई करें।
  2. प्रत्येक फ्लोरोक्रोम के लिए इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए मानव मैक्रोफेज के धुंधला करने के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को कम करता है।
  3. अन दाग कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए नकारात्मक कोशिकाओं की कल्पना की जा करने के लिए अनुमति देने के लिए गेट सेट करने के लिए आवश्यक पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस के स्तर का निर्धारण (मैक्रोफेज अत्यधिक ऑटो फ्लोरोसेंट हैं)।
  4. डेटा अधिग्रहण के लिए अनुशंसित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रवाह साइटोमीटर में न्यूनतम 50,000 कोशिकाओं/नमूना प्राप्त करें।
  5. फ्लो साइटोमेट्री स्टैंडर्ड (एफसीएस) फॉर्मेट 3.1 में फ्लो साइटोमीटर से अधिग्रहण फाइल्स का निर्यात करें।
  6. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एफसीएस फाइलों का विश्लेषण करें।
  7. गेट मैक्रोफेज उनके फॉरवर्ड-एंड साइड स्कैटर (एफएससी और एसएससी) विशेषताओं के अनुसार और ज़ोंबी-यूवी व्यवहार्यता डाई का उपयोग करके लाइव/डेड सेल गेटिंग द्वारा मृत कोशिकाओं को बाहर करें।
  8. फिटीसी चैनल में एच37आरवी-जीएफपी संक्रमित मैक्रोफेज की कल्पना करें।
  9. सभी मार्कर(तालिका 1)के लिए सकारात्मक रूप से दाग कोशिकाओं और ज्यामितीय मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) की आवृत्ति की पहचान करें।

8. एमटीबी संक्रमित मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

नोट: एमटीबी संक्रमण बीएसएल-3 सुविधा में किया जाना चाहिए।

  1. इम्यूनोस्टेपिंग के लिए, बीज 2 x 105 पीबीएमसी/अच्छी तरह से सीरम मुक्त RPMI माध्यम के ५०० μL में 8 अच्छी तरह से चैंबर स्लाइड में प्राप्त करने के लिए 2 x 10 4 मोनोसाइट्स/अच्छीतरह से । मोनोसाइट्स के भेदभाव और एम 1/एम 2 ध्रुवीकरण के बाद, ऊपर वर्णित एमटीबी संक्रमण के साथ आगे बढ़ें। 30 मिनट के लिए फिक्सेशन बफर के साथ एमटीबी संक्रमण के 24 घंटे के बाद स्लाइड फिक्स । फिक्स्ड स्लाइड्स को आगे के विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में स्टोर किया जाता है।
  2. मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं को 10 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं।
  3. आर टी में 5 मिनट के लिए 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को पार करने के लिए पेर्मेबिलाइजेशन बफर।
  4. कोशिकाओं को 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के 200 माइक्रोन के साथ 3 बार धोएं।
  5. कोशिकाओं को 5 मिनट प्रत्येक के लिए वॉश बफर के 200 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं।
  6. आरटी में 30 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध करने के 200 माइक्रोन के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करें।
  7. धुंधला बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी 1:100 पतला और एक अविविजित CD64 एंटीबॉडी (क्लोन: १०.१) और एक अविविजित CD163 एंटीबॉडी (पॉलीक्लोनल) के साथ M2 कोशिकाओं के साथ M1 कोशिकाओं को कमजोर आरटी में 2 घंटे के लिए ।
  8. इसके बाद, कोशिकाओं को 3 बार 10 मिनट के लिए वॉश बफर के 200 माइक्रोल के साथ धोएं।
  9. फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी 1:1,000 धुंधला बफर में और एक विरोधी माउस IgG-Alexa फ्लोर ५९४ और एक विरोधी खरगोश IgG-Alexa Fluor ५९४ के साथ M2 कोशिकाओं के साथ आर टी में 1 एच के लिए एम 1 कोशिकाओं को पतला ।
  10. कोशिकाओं को 10 मिनट प्रत्येक के लिए 200 माइक्रोल वॉश बफर के साथ 3 बार धोएं।
  11. चैंबर ग्रिड को हटा दें और प्रत्येक कुएं में डीएपीआई माउंटिंग मीडियम के ~ 20 माइक्रोन जोड़ें और प्रत्येक स्लाइड पर 1.5 मिमी कवरलिप डालें।
  12. नेल पॉलिश की एक परत के साथ कवरस्लिप सील।
  13. जीएफपी (ग्रीन चैनल), डीएपीआई (नीला) के लिए 402 एनएम और माध्यमिक एंटीबॉडी (लाल) के लिए क्रमशः 402 एनएम पर उत्सर्जित लेजर के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों का अधिग्रहण करें।

Representative Results

एम0 (एम 2-जैसी कोशिकाओं), एम 1 (पूरी तरह से ध्रुवीकृत एम 1 कोशिकाओं) और एम 2 (पूरी तरह से ध्रुवीकृत एम 2 कोशिकाओं) के ध्रुवीकरण के लिए उपयोग की जाने वाली साइटोकिन उत्तेजनाओं का एक योजनाबद्ध चित्रण चित्र 1 एमें प्रस्तुत किया गया है, जबकि एम0, एम 1 और एम 2 सेल संस्कृतियों के प्रतिनिधि चित्रों के साथ-साथ एम 1 संस्कृतियों को दिन 0, 3 और 7 में दिखायागया है। बुनियादी गेटिंग रणनीति(चित्रा 2 ए)प्रदर्शित करने के लिए असंक्रमित एम0 कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। प्रारंभ में, माइलॉयड कोशिकाएं (~ 85%) उनके आगे तितर बितर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) संपत्तियों के अनुसार गेटेड थे जिनमें उच्च दानेदारता वाली बड़ी कोशिकाएं शामिल हैं और छोटे आकार के मलबे को कम एसएससी और एफएससी के साथ छोड़कर जो डॉट प्लॉट के नीचे बाएं कोने में पाए जाते हैं । दूसरे भूखंड में, डबल्स (यानी, सेल झुरमुट) को एक बढ़े हुए क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया था लेकिन एकल कोशिकाओं की तुलना में समान ऊंचाई और आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया था। इसलिए, केवल एफएससी-एरिया और एफएससी-हाइट (एकल कोशिकाओं) के बीच आनुपातिक कोशिकाओं को तिरछा आकार गेट के अंदर शामिल किया गया था। इसके बाद, ज़ोंबी-यूवी व्यवहार्यता डाई जो मृत कोशिकाओं के अंदर साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन को दाग देती है, का उपयोग बाद के विश्लेषण से मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए किया जाता था। जैसा कि अपेक्षित था, एमटीबी-जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए व्यवहार्य असंक्रमित एम0 कोशिकाएं फिटसी-चैनल में कल्पना की गई थीं।

इसके बाद, हमने असंक्रमित के साथ-साथ एमटीबी-संक्रमित एम 1 और एम2 मैक्रोफेज को संक्रमण के बाद 4 घंटे(चित्रा 2बी, सी)पर एक ही गेटिंग रणनीति लागू की। एफसीएस/एसएससी गेट में असंक्रमित एम1 ध्रुवीकृत मैक्रोफेज के दो उप-आबादी का पता चला; एक छोटे आकार (एफसीएस) और उच्च दानेदारता (एसएससी) और अन्य आबादी के साथ एक बड़े आकार और कम दानेदारता(चित्रा 2B)के साथ एक आबादी, जबकि असंक्रमित M2 कोशिकाओं का मुख्य द्वार अधिक समरूप(चित्रा 2C)दिखाई दिया। एम 1 और एम 2 मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं दोनों ने एमटीबी संक्रमण पर उच्च दानेदारता और कम कोशिका आकार में ऊर्ध्वाधर बदलाव प्रदर्शित किया, जो इंट्रासेलुलर एमटीबी बैक्टीरिया(चित्रा 2बी, सी)के तेज के कारण कोशिकाओं के अंदर एक बढ़ी हुई जटिलता को प्रतिबिंबित कर सकता है। इसके अलावा, व्यवहार्यता दाग एक बढ़ाया सेल मौत का पता चला (17-22%) एमटीबी संक्रमित M1 और M2 कोशिकाओं में 5 के एक एमओआई पर, असंक्रमित M0 कोशिकाओं की तुलना में (९९%) (चित्रा 2ए-सी)या असंक्रमित M1 और M2 कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया गया) । प्रतिनिधि आंकड़ों से पता चला है कि एमटीबी-जीएफपी अभिव्यक्ति (यानी, एमटीबी संक्रमण) एम 2 (77% जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं) में एम 1 (19% जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं) कोशिकाओं की तुलना में संक्रमण के 4 घंटे(चित्रा 2बी, सी)के बाद काफी अधिक था। संक्रमण के 24 घंटे बाद, एम 1 और एम 2 कोशिकाओं में क्रमशः एमटीबी-जीएफपी अभिव्यक्ति 43% और 85% थी, जिसमें सुझाव दिया गया था कि एम 1 कोशिकाओं में एम 2 कोशिकाओं की तुलना में एमटीबी संक्रमण के बाद 4-24 घंटे से GFP-अभिव्यक्ति में अपेक्षाकृत अधिक वृद्धि हुई, एम 12 में जीएफपी-अभिव्यक्ति में 10.4% की वृद्धि और एम 1-24 घंटे से एम 200000

असंक्रमित मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं में M1/M2 ध्रुवीकरण की प्रभावकारिता की विशेषता के लिए, डॉट भूखंडों का उपयोग M1 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था जो सीडी 64 और सीडी 86 (सीडी 64+सीडी 86+ +)और एम 2 कोशिकाओं के लिए डबल-पॉजिटिव थे जो सीडी 163 और CD200R (CD163+CD200R+के लिए डबल-पॉजिटिव थे; चित्रा 3ए, बी)। एम1 /एम 2 मार्कर का चयन मुख्य रूप से हमारे पिछले कार्य25 से परिणामों के आधार पर किया गया था, लेकिन अन्य अध्ययनों से भी26,27 ,28,29। दाग कोशिकाओं के लिए चतुर्भुज, दाग M1/M2 कोशिकाओं(चित्रा 3A)के लिए इसी फाटकों का उपयोग कर सेट किया गया । इन मार्कर में से कोई भी विशेष रूप से M1 या M2 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है, लेकिन सकारात्मक कोशिकाओं के अनुपात के साथ-साथ सतह अभिव्यक्ति की तीव्रता अलग है। यह विशेष रूप से एम1 दाग से स्पष्ट था जहां एम 1 कोशिकाओं का लगभग 95% और एम 2 कोशिकाओं का 79% सीडी 64+सीडी 86+था, लेकिन एम 1 सबसेट(चित्रा 3 ए)में धुंधला तीव्रता काफी अधिक थी। जबकि M1 कोशिकाओं के 27% M2-मार्कर CD200R के लिए सकारात्मक थे, केवल 1% CD163 के लिए सकारात्मक थे, 0.5% CD163+CD200R+ M1 कोशिकाओं की तुलना में 63% CD163+CD200R+ M2 कोशिकाओं(चित्रा 3A)प्रदान करते हैं । एमटीबी संक्रमण के 4 घंटे के बाद, एमटीबी-जीएफपी-पॉजिटिव एम1 ध्रुवीकृत कोशिकाओं (16%) में CD200R+ कोशिकाओं की आवृत्ति में वृद्धि देखी गई, जबकि सीडी 163-अभिव्यक्ति M2 कोशिकाओं(चित्रा 3B)में कम हो गई थी। हीट-मैप CD163+CD200R + M2 कोशिकाओं में GFP-अभिव्यक्ति की उच्च तीव्रता को दर्शाता है, लेकिन इसी M1 कोशिकाओं के सबसेट(चित्रा 3B)की तुलना में सीडी 64+सीडी 86+ एम 2 सबसेट में भी। कुल मिलाकर, संबंधित एम 1 और एम 2 मार्कर की अभिव्यक्ति में बदलाव की कल्पना चित्रा 3 सीमें हिस्टोग्राम में भी की गई है। इसके अलावा, एमटीबी-जीएफपी बैक्टीरिया को CD64+ M1 कोशिकाओं में और CD163+ M2 कोशिकाओं में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की गई थी, जिसने एम 1 कोशिकाओं(चित्रा 3 डी)की तुलना में एम 2 के अंदर एक बढ़ाया इंट्रासेलुलर तेज और/या एमटीबी के विकास का समर्थन किया ।

मैनुअल गेटिंग के परिणामों को सत्यापित करने के लिए, हमने समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण (यूएमपी) का उपयोग करके आयामीता में कमी लागू की। UMAP विश्लेषण से पता चला है कि 4 घंटे के लिए एमटीबी संक्रमण संक्रमण के 24 घंटे के विपरीत, मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण को प्रभावित करने के लिए पर्याप्त नहीं था, जिसके परिणामस्वरूप एम 1 और एम 2 असंक्रमित और संक्रमित कोशिकाओं(चित्रा 4A)के स्पष्ट रूप से अलग समूहों में शामिल हुआ। असंक्रमित एम 1 मैक्रोफेज ने M2 मैक्रोफेज की तुलना में CD64, CD86, TLR2, HLA-DR और CCR7 की उच्च अभिव्यक्ति प्रदर्शित की, जबकि असंक्रमित एम 2 कोशिकाओं ने M2 फेनोटाइप मार्कर CD163, सीडी 200R, CD206 और CD80(चित्रा 4बी, सी)के एक मजबूत अप-नियमन का प्रदर्शन किया। मैनुअल गेटिंग के लिए समझौते में, 24 घंटे के बाद एमटीबी संक्रमण M2 कोशिकाओं पर CD163, CD200R और CD206 और सीडी 86 और एचएलए-DR के अपरिनियमन M1 कोशिकाओं(चित्रा 4बी, सी)के एक स्पष्ट डाउनरेगुलेशन का कारण बना, जो पता चलता है कि एमटीबी मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को मिला सकता है । बाद में फेनोग्राफ विश्लेषण(चित्रा 4डी-एफ)ने विभिन्न आकारों के 24 विभिन्न समूहों की पहचान की जो विशिष्ट रूप से एम 1 और एम 2 असंक्रमित और एमटीबी-संक्रमित कोशिकाओं के बीच वितरित किए गए थे जैसा कि उमाप रेखांकन(चित्रा 4D),पाई चार्ट(चित्रा 4E)और हीट-मैप्स(चित्रा 4F)में दर्शाया गया था। कुल मिलाकर, ये परिणाम विट्रो में फेनोटायिक रूप से और कार्यात्मक रूप से विविध एम 1 और एम 2 ध्रुवीकृत कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल की आशाजनक दक्षता दिखाते हैं जो एमटीबी संक्रमण द्वारा आगे संग्राहक होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: इन विट्रो भेदभाव और मानव माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं के ध्रुवीकरण का योजनाबद्ध चित्रण। (A)M0 (M2-like), M1 (शास्त्रीय रूप से सक्रिय) और एम 2 (वैकल्पिक रूप से सक्रिय) कोशिकाओं को चित्रित किया गया है । स्वस्थ रक्तदाताओं से प्राप्त मोनोसाइट्स को प्रोटोकॉल में वर्णित विभिन्न साइटोकिन्स के साथ ध्रुवीकृत किया गया था और 10-रंग प्रवाह साइटोमेट्री के साथ विश्लेषण से पहले 4 घंटे के लिए जीएफपी-लेबल एमटीबी तनाव, एच 37आरवी से संक्रमित थे। M1-ध्रुवीकृत कोशिकाओं में आम तौर पर M2-ध्रुवीकृत कोशिकाओं की तुलना में कम बैक्टीरिया होते हैं । (ख)7 दिन में 6-अच्छी प्लेटों में पूरी तरह से ध्रुवीकृत, असंक्रमित एम0, एम 1 और एम 2 कोशिकाओं की सूक्ष्म छवियां, और दिन 0, 3 और 7 पर मोनोसाइट्स से एम 1 सेल भेदभाव की प्रतिनिधि छवियां । आवर्धन 20x (ऊपरी पैनल) और 10x (निचला पैनल) है। ध्यान दें कि M1 कोशिकाओं को अधिक गोलाकरने वाले एम0 और एम 2 कोशिकाओं (ऊपरी पैनल) की तुलना में अधिक विस्तारित और फैलाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अलग-अलग ध्रुवीकृत माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति। प्रतिनिधि डॉट प्लॉट दिखा रहा है(ए)फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) असंक्रमित M0 मैक्रोफेज के गुण। एफएससी-ए/एफएससी-एच प्लॉट क्षेत्र और ऊंचाई के अनुपात में एकल कोशिकाओं की मैनुअल गेटिंग दिखाता है । लाइव सेल गेट ने उन कोशिकाओं को बाहर रखा जो ज़ोंबी-यूवी (व्यवहार्यता डाई) के लिए सकारात्मक थे। फिटसी चैनल में देखी गई लाइव कोशिकाओं में जीएफपी-अभिव्यक्ति द्वारा इंट्रासेलुलर एमटीबी का पता लगाया गया था। (ख)एम1 की गेटिंग और(सी)एम2 मैक्रोफेज जो असंक्रमित कोशिकाओं और एमटीबी संक्रमित कोशिकाओं 4 एच और 24 एच पोस्ट-इंफेक्शन दोनों के एफसीएस/एसएससी डॉट प्लॉट दिखाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो M1/M2 ध्रुवीकरण प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता । प्रतिनिधि डॉट भूखंडों और चतुर्भुज गेटिंग में CD64 और CD86 (M1) या CD163 और CD200R (M2) का उपयोग करके M1-और M2-polarized कोशिकाओं की सबसेट आवृत्तियों को दिखाया गया है(ए)अन दाग और दागदार अनिक्रमित कोशिकाएं और(बी)एमटीबी-संक्रमित दाग कोशिकाएं 4 एच-संक्रमण के बाद । (बी)में डॉट भूखंड एम 1-और विभिन्न उप-द्वारों से प्राप्त एम 2-ध्रुवीकृत मैक्रोफेज में जीएफपी-अभिव्यक्ति (हीट मैप) की फ्लोरेसेंस तीव्रता को दर्शाता है। (ग)फ्लोरेसेंस तीव्रता का ज्यामितीय मतलब (एमएफआई) एमटीबी संक्रमण के 4 घंटे के बाद एक प्रतिनिधि दाता से हिस्टोग्राम में दिखाया गया है । असंक्रमित एम 1 (हल्के नीले) और एम 2 कोशिकाओं (हल्के बैंगनी) में एमएफआई मानों को ऊपरी पैनल में प्रस्तुत किया जाता है और एमटीबी-संक्रमित एम 1 (डीप ब्लू) और एम2 कोशिकाएं (डीप पर्पल) निचले पैनल में प्रस्तुत की जाती हैं। (घ)असंक्रमित और एमटीबी संक्रमित एम1-और एम 2-ध्रुवीकृत कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां दिखाई गई हैं । एम 1 और एम 2 कोशिकाओं को क्रमशः सीडी 64 और सीडी 163 अभिव्यक्ति के लिए दाग दिया गया था, इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके। लाल और जीएफपी-व्यक्त इंट्रासेलर बैक्टीरिया में सकारात्मक सतह धुंधला दिखाया गया है हरे रंग में दिखाया गया है। दापी-दाग नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है। स्केल - 10 माइक्रोन। दाईं ओर छवियों का आवर्धन 350x है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक समान कई गुना सन्निकटन और प्रक्षेपण (UMAP) और असंक्रमित और एमटीबी संक्रमित M1 और M2 कोशिकाओं के फिनोग्राफ विश्लेषण के साथ आयामीता में कमी । (A)उमाप, दो प्रतिनिधि रक्तदाताओं, 4 एच (बाएं रेखांकन) या 24 एच (दाएं रेखांकन) के बाद संक्रमण से असंक्रमित और एमटीबी संक्रमित एम 1 और एम 2 सेल संस्कृतियों से 11000 जीवित कोशिकाओं को मनगढ़ंत तरीके से बनाया गया। जीएफपी-एक्सप्रेशन (लोअर पैनल) के लिए हीटमैप असंक्रमित और एमटीबी-संक्रमित कोशिकाओं को इंगित करता है। (बी-सी) असंक्रमित और एमटीबी संक्रमित एम1 और एम2 कोशिकाओं में व्यक्त किए गए मार्कर का एमएफआई 24 एच पोस्ट-इंफेक्शन,(बी)हीटमैप या(सी)बार भूखंडों के रूप में दिखाया गया है। (D-F) फिनोग्राफ विश्लेषण ने 24 समूहों की पहचान की जो असंक्रमित और एमटीबी-संक्रमित एम 1 और एम 2 संस्कृतियों के बीच अलग-अलग वितरित किए जाते हैं। क्लस्टर 8-13 असंक्रमित एम 1 कोशिकाओं में अद्वितीय हैं, क्लस्टर 1-7 एमटीबी-संक्रमित एम 1 कोशिकाओं में अद्वितीय हैं, क्लस्टर 20-24 असंक्रमित एम2 कोशिकाओं में अद्वितीय हैं और क्लस्टर 14-19 एमटीबी-संक्रमित एम 2 कोशिकाओं में अद्वितीय हैं। प्रत्येक फेनोग्राफ क्लस्टर में प्रत्येक मार्कर का एमएफआई(एफ)में दिखाया गया है। डेटा असंक्रमित M1 (हल्के नीले) और M2 कोशिकाओं (हल्के बैंगनी) और एमटीबी संक्रमित M1 (गहरे नीले) और M2 कोशिकाओं (गहरे बैंगनी) के रूप में प्रस्तुत किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: प्रवाह साइटोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की सूची।

लेज़र फ़िल्टर फ्लोरोक्रोम फेनोटाइप समारोह क्लोन सूची संख्या अतिथि
639 670/30 एएफ647 टीएलआर2 रोगजनक मान्यता रिसेप्टर टीएल2.1 309714 बायोलेगेंड
639 780/60 एपीसी-Cy7 सीडी206 मन्नोस रिसेप्टर 15-2 321120 बायोलेगेंड
405 610/20 बीवी605 सीडी163 मेहतर रिसेप्टर जीएचआई/61 333616 बायोलेगेंड
405 670/30 बीवी650 सीडी80 सह-उत्तेजक अणु 2D10 305227 बायोलेगेंड
405 710/50 BV711 सीसीआर7 केमोकीन रिसेप्टर G043H7 353228 बायोलेगेंड
405 780/60 बीवी785 सीडी86 सह-उत्तेजक अणु आईटी2.2 305442 बायोलेगेंड
488 530/30 जीएफपी एमटीबी इंट्रासेलर बैक्टीरिया
561 586/15 शारीरिक शिक्षा सीडी200आर निरोधात्मक रिसेप्टर ऑक्स-108 329306 बायोलेगेंड
561 620/14 पीई/चकाचौंध 594 सीडी64 एफसी गामा रिसेप्टर-आइजी के प्रथम 10.1 305032 बायोलेगेंड
561 661/20 पीई-Cy5 (PC5) एचएलए-डीआर एमएचसी वर्ग द्वितीय अणु L243 307608 बायोलेगेंड
355 450/50 BUV395 व्यवहार्यता डाई लाइव/डेड सेल मार्कर ज़ोंबी यूवी 423108 इनविटरोजन

Discussion

यह प्रायोगिक प्रोटोकॉल एम 1 या एम 2 फेनोटाइप में माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रभावी ध्रुवीकरण का वर्णन करता है जिसमें 10-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल के साथ मूल्यांकन शामिल है जो विविध मैक्रोफेज सबसेट में जीएफपी-लेबल एमटीबी के दृश्य और गहरे लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। हालांकि टीबी एक प्राचीन मानव रोग है, वर्तमान में एमटीबी-मैक्रोफेज इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कोई सुनहरा मानक मॉडल नहीं है, और लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं के विश्लेषणों की तुलना में मैक्रोफेज का बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री जटिल हो सकता है। मानव मोनोसाइट्स के इन विट्रो भेदभाव के लिए मैक्रोफेज के लिए कुछ उपलब्ध प्रोटोकॉल उत्पन्न मैक्रोफेज के प्रकार का गहन ज्ञान प्रस्तुत करते हैं। मार्कर के ठोस पैनल का उपयोग करके मैक्रोफेज ध्रुवीकरण और मैक्रोफेज सक्रियण के प्रवाह साइटोमेट्रिक मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल संभवतः इस तरह के लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान कर सकता है और विभिन्न परिस्थितियों में इलाज की गई ध्रुवीकृत कोशिकाओं की अतिरिक्त सुविधाओं का पता लगाने के अवसर प्रदान कर सकता है। इसमें विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं के विश्लेषण के साथ-साथ नैदानिक नमूनों में वीवो में कोशिकाओं के विश्लेषण, यानी पीबीएमसी और शरीर के तरल पदार्थ (यानी ब्रोंकोएलवेलर लावगे) या समरूप ऊतक से एकल कोशिका निलंबन दोनों शामिल हैं । तदनुसार, रोगियों से प्राप्त मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज की भेदभाव और/या सक्रियण स्थिति रोग परिणाम से संबंधित हो सकती है । फेफड़े के टीबी रोगियों में परिधीय रक्त में CD16+CD163+ मोनोसाइट्स का विस्तार सूचित किया गया है । एटोपिक डर्मेटाइटिसरोगियोंकी सूजन वाली त्वचा में CD163+ कोशिकाओं की बढ़ी हुई आवृत्ति का भी पता चला . इसी प्रकार, CD206+ M2-जैसे मैक्रोफेज को एडीपोसाइट ऊतक32 के माइक्रोएनवायरनमेंट में कोशिकाओं के प्रसार और भेदभाव को रोकने और तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)29के रोगियों से अस्थि मज्जा के नमूनों में समृद्ध होने के लिए दिखाया गया है। ऑस्टियोआर्थराइटिस के रोगियों के पूरे रक्त में CD163 (M2) कोशिकाओं के लिए CD64 (M1) का एक ऊंचा अनुपात रोग गंभीरता३३से जुड़ा हुआ पाया गया । एक अन्य अध्ययन में CD86 (M1) और CD163 (M2) का उपयोग किया गया ताकि ऊतक में उच्च एम1 अभिव्यक्ति को घातक ब्रेन ट्यूमर34के एक उपसमूह में बदतर परिणाम से सहसंबद्ध किया जा सके।

इस प्रायोगिक M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण फायदे हैं। यह मॉडल उग्र एमटीबी संक्रमण के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है और मिश्रित-लिम्फोसाइट प्रतिक्रियाओं (एमएलआर) में एम 1 या एम 2 मैक्रोफेज के साथ ऑटोलॉगस टी कोशिकाओं को जोड़कर अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल दवा स्क्रीनिंग और विभिन्न इम्यूनोमोडिलिएटरी और रोगाणुरोधी यौगिकों के परीक्षण के लिए भी उपयुक्त है। यहां, हमने पहले एमटीबी संक्रमण25,35के बाद माइलॉयड-व्युत्पन्न कोशिकाओं पर विटामिन डी और हिस्टोन डेसिटाइलीज अवरोधक फिनेलब्यूटिरेट के प्रभावों का अध्ययन किया है। M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री भी सेल संस्कृति supernatants या रोगी प्लाज्मा के साथ कंडीशनिंग के बाद मैक्रोफेज सक्रियण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जबकि एचआईवी या हेल्मिंथ या टीबी-मधुमेह सह-रुग्णता के साथ टीबी सह-संक्रमण के वीवो अध्ययन में चुनौतीपूर्ण हो सकता है, कम जटिल M1/M2 मॉडल विट्रो में सह-रुग्णताओं के अध्ययन की सुविधा प्रदान कर सकता है । इसी तरह, कोशिकाओं की एमटीबी संक्रमितता की जांच करने या फागोसिटिक के साथ-साथ व्यक्तिगत एम 1/एम2 कोशिकाओं की एंटीजन प्रस्तुति क्षमता की जांच करने के लिए संचरण अध्ययनों के लिए प्रोटोकॉल का दोहन किया जा सकता है । M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री भी बायोमार्कर और वैक्सीन अध्ययन में उपयोग के लिए आकर्षक है, उपचार के दौरान रोग पूर्वानुमान का पालन करने के लिए और myeloid-व्युत्पन्न कोशिकाओं को लक्षित उपचारों का परीक्षण करने के लिए । महत्वपूर्ण बात यह है कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3 डी),वास्तविक समय पीसीआर, का उपयोग करके मैक्रोफेज ध्रुवीकरण फेनोटाइप और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के एक साथ मूल्यांकन के लिए साइटोमेट्री प्रवाह के समानांतर कई विभिन्न तरीकों को लागू किया जा सकता है। पश्चिमी दाग, मल्टीप्लेक्स परख और संस्कृति सुपरनेक्टेंट में घुलनशील कारकों के एलिसा के साथ-साथ जीएफपी-अभिव्यक्ति (प्रवाह साइटोमेट्री और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी) और कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीआईएफयू) का उपयोग करके इंट्रासेलर बैक्टीरियल संक्रमितता और विकास का आकलन। एमटीबी-जीएफपी बैक्टीरिया के साथ एम 1 या एम 2 कोशिकाओं का संक्रमण भी एकल सेल-आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण के लिए एक ही नमूने से असंक्रमित और एमटीबी-संक्रमित कोशिकाओं को छांटने में सक्षम बनाता है।

वर्णित प्रोटोकॉल में तकनीकी और वैज्ञानिक दोनों नुकसान सहित कुछ सीमाएं भी हैं । मानव रक्तदाताओं से मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग करने वाली कमी यह है कि दाता परिवर्तनशीलता अक्सर अधिक होती है और तथ्य यह है कि कोशिकाओं को मानव ऊतकों के शारीरिक वातावरण में ध्रुवीकृत नहीं किया जाता है। M1/M2 ध्रुवीकरण प्रभावकारिता या एमटीबी-दाताओं के बीच संक्रामकता में बड़ी परिवर्तनशीलता के परिणामस्वरूप अंतर-और अंतरअधिग्रहीय विविधताओं, कम सांख्यिकीय शक्ति, और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए कई दानदाताओं को शामिल करने की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, पीबीएमसी से मोनोसाइट्स के प्लास्टिक पालन के परिणामस्वरूप मोनोसाइट्स/वेल की दाता-निर्भर संख्या होती है जो अंततः एक मनमाना एमओआई प्रदान कर सकती है जो एमटीबी संक्रमण के बाद मैक्रोफेज ध्रुवीकरण और कोशिका व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती है । प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में कोशिका संस्कृतियों को दूषित करने के लिए अन्य कोशिकाओं के प्रकारों को रोकने के लिए उचित धोने शामिल हैं जो मैक्रोफेज ध्रुवीकरण को भी प्रभावित कर सकते हैं। जबकि एक बहुत कम MOI अव्यक्त टीबी संक्रमण की नकल कर सकते हैं, एक बहुत अधिक MOI कोशिकाओं को मार डालेगा, एक उपयुक्त MOI का उपयोग करने के महत्व पर प्रकाश डाला । इसके अलावा, टुकड़ी पर दृढ़ता से अनुयायी कोशिकाओं को पुनः प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले कुछ मैक्रोफेज सबसेट का पक्षपातपूर्ण प्रतिनिधित्व हो सकता है। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण कदम में मोतियों के क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स और नकारात्मक नियंत्रण जैसे अन दागदार कोशिकाओं या एफएमओ (फ्लोरेसेंस माइनस वन) नियंत्रणों का उचित उपयोग शामिल है ताकि सही मैनुअल गेटिंग सुनिश्चित की जा सके।

एक अन्य सीमा में रक्त से प्राप्त मोनोसाइट्स का ध्रुवीकरण शामिल है न कि स्थानीय ऊतक वातावरण से। मानव टीबी की पहचान एमटीबी संक्रमित ऊतकों में ग्रेनुलोमा का गठन है और इस प्रकार टीबी में इम्यूनोपैथोलॉजी का स्थानीय ऊतक स्थल पर अधिमानत अध्ययन किया जाना चाहिए । हालांकि, मोनोसाइट्स को सूजन/संक्रमण पर परिधीय रक्त से फेफड़ों में भर्ती किया जाता है, जहां कोशिकाएं जीएम-सीएसएफ12जैसे भड़काऊ साइटोकिन्स की उपस्थिति में मैक्रोफेज में अंतर कर सकती हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि वीवो में ऊतक के शारीरिक परिवेश में, मैक्रोफेज ध्रुवीकरण की एक बड़ी विषमता की संभावना है जिसमें एक मिश्रण और विविध एम 1-और एम 2-जैसे मैक्रोफेज आबादी का विभिन्न अनुपात शामिल है जो टीबी संक्रमण36के भाग्य में योगदान देते हैं। हमने पहले एक मानव ऑर्गेनोटिपिक फेफड़ों के ऊतक मॉडल विकसित किए हैं जो टीबी 37 में मैक्रोफेज-मध्यस्थता ग्रैनुलोमागठनके 3डी-अध्ययन को सक्षम बनाता है। यह फेफड़ों के ऊतकों मॉडल के साथ संयोजन में वर्तमान M1/M2 ध्रुवीकरण प्रोटोकॉल का फायदा उठाने के लिए आगे टीबी ग्रैनुलोमा गठन, प्रभावकार कार्यों और प्रयोगात्मक ऊतक में M1/M2 अनुपात का अध्ययन दिलचस्प हो सकता है ।

इस M1/M2 प्रवाहकंत्रक को आसानी से निरोधात्मक और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं से जुड़ी सुविधाओं के आकलन के लिए उपयोगी माइलॉयड मार्कर के एक विस्तारित पैनल को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । पीडी-1, एसआईआरपी-α, IDO और arginases जैसे निरोधात्मक प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अणुओं में एक महान शोध रुचि है जो मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओंको 38से मिला सकता है। इस संदर्भ में, माइलॉयड कोशिकाओं के ध्रुवीकरण में अन्य उत्तेजनाएं भी शामिल हो सकती हैं जो इम्यूनोरेगुलेटरी मैक्रोफेज (एमआरईजी) या माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं (एमडीएससी) को बढ़ावा देती हैं जिन्हें टीबी38सहित कई बीमारियों में शामिल दिखाया गया है। एम1/एम 2/एमआरईजी मैक्रोफेज सबसेट के अधिक उन्नत प्रवाह साइटोमेट्री पैनलों में साइटोकिन्स/केमोकिंस आईएल-1, टीएनएफ-α, आईएल-10 और एमसीपी-1 या अन्य घुलनशील कारकों या प्रभावक अणुओं जैसे प्रेरक नाइट्रिक ऑक्साइड (आईओएस) और एंटीमिक्रोबिल पेप्टाइड्स के इंट्रासेलुलर स्टेनिंग भी शामिल हो सकते हैं । यह पॉलीफंक्शनल मैक्रोफेज प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने की संभावनाओं को बढ़ा सकता है, जो टी कोशिकाओं39के लिए बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है।

वर्तमान में, फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग पैनलों में 30-40 रंग शामिल हो सकते हैं, जो इम्यूनोफेनोटाइप मल्टीपल सेल सबसेट और अणुओं को एक साथ करने की क्षमता प्रदान करता है। इस M1/M2 प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल की बुनियादी प्रायोगिक स्थापना का उपयोग एक रीढ़ के रूप में किया जा सकता है जो अधिकांश पुराने और नए प्रवाह साइटोमीटर के साथ संगत है और बीएसएल-3 पर्यावरण में उग्र एमटीबी के साथ काम से उत्पन्न चुनौतियों सहित व्यक्तिगत जरूरतों के अनुसार बनाया और सिलवाया जा सकता है। आजकल, उमापी जैसी आयामीता कटौती तकनीक प्रवाह साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर के नए संस्करणों में उपलब्ध हैं, जो एकल-कोशिका अध्ययनों में उत्पन्न बड़ी संख्या में मापदंडों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है जो बेहतर दृश्य और उच्च आयामी डेटा40की व्याख्या के लिए आवश्यक है। प्रवाह साइटोमेट्री में निरंतर तकनीकी सुधार आने वाले वर्षों में जारी रहेगा जिसमें आधुनिक सेल छंटाई क्षमताओं के साथ बहु-पैरामेट्रिक फेनोटाइपिंग का संयोजन शामिल है, जहां यह प्रोटोकॉल कई मैक्रोफेज आधारित एमटीबी संक्रमण परख में उपयोगी साबित हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम बीएसएल-3 प्रयोगशाला में सहायता के लिए स्वीडन की सार्वजनिक स्वास्थ्य एजेंसी, माटिल्डा स्वेनसन और सोलोमन घेब्रेमाइकल में अपने सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं ।

इस काम को स्वीडिश हार्ट एंड लंग फाउंडेशन (एचएलएफ) (2019-0299 और 2019-0302 से एसबी), स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (वीआर) (2014-02592, से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था 2019-01744 और एसबी के लिए 2019-04720), फाउंडेशन एंटीबायोटिक प्रतिरोध (विरोध), कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट फाउंडेशन और किड टू एसबी (मार्को लोरेटी के लिए डॉक्टरेट शिक्षा का आंशिक वित्तपोषण) को रोकने के लिए कारोलिंस्का इंस्टीट्यूट से । एमएल स्वीडिश बच्चों के कैंसर फाउंडेशन (TJ2018-0128 और PR2019-0100) से समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well chamber slides Lab-Tek 154534
BD Comp bead plus BD 560497
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906
DAPI Mounting media Vector Laboratories H-1200-10
EDTA (0.5 M) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Falcon 6-well Flat Bottom plates Corning Life Sciences 353046
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Glycerol (70%) Karolinska University hospital, Huddinge N/A
GM-CSF Peprotech 300-03
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen R37121 Secondary antibody for CD64
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594 secondary antibody Invitrogen A-11037 Secondary antibody for CD163
HEPES GE Healthcare Life Sciences SH30237.01
IFN-γ Peprotech 300-02
IL-4 Peprotech 200-04
L-Glutamine GE Healthcare Life Sciences SH30034.01
LPS (Escherichia coli O55:B5) Sigma-Aldrich L6529
Lymphoprep Alere Technologies AS 11508545
M-CSF Peprotech 300-25
Middle Brook 7H10 agar plates Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Middle Brook 7H9 media Karolinska University hospital, Huddinge N/A
Mouse anti-human CD64 primary antibody Bio-Rad MCA756G Clone: 10.1
Na-pyruvate GE Healthcare Life Sciences SH300239.01
Normal goat serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Rabbit anti-human CD163 primary antibody GeneTex GTX81526 Polyclonal
RPMI 1640 Life Technologies Corporation SH30096.01
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
TubeSpin bioreactor tubes TPP Techno Plastic Products AG 87050
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Tween-80 Sigma-Aldrich P4780

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References

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JoVE में इस महीने अंक १६३ मैक्रोफेज मानव ध्रुवीकरण M1/M2 Mycobacterium तपेदिक,संक्रमण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रवाह साइटोमेट्री

Erratum

Formal Correction: Erratum: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection
Posted by JoVE Editors on 10/14/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection. Author and affiliation information was updated.

The author and affiliation information was updated from:

Akhirunnesa Mily1, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha2, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,3, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
3Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

to:

Akhirunnesa Mily1,2, Sadaf Kalsum1, Marco Giulio Loreti1, Rokeya Sultana Rekha3, Jagadeeswara Rao Muvva1, Magda Lourda1,4, Susanna Brighenti1
1Center for Infectious Medicine (CIM), Department of Medicine Huddinge, ANA Futura, Karolinska Institutet 
2Infectious Diseases Division, International Centre for Diarrhoeal Disease Research, Bangladesh
3Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine (Labmed), ANA Futura, Karolinska Institutet 
4Childhood Cancer Research Unit, Department of Women's and Children's Health, Karolinska Institutet

<em>माइकोबैक्टीरियम तपेदिक</em> संक्रमण पर प्रवाह साइटोमेट्री के साथ एम 1 और एम 2 मानव मोनोसाइट-व्युत्पन्न कोशिकाओं और विश्लेषण का ध्रुवीकरण
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