Uveítis autoinmune experimental: un modelo de ratón inflamatorio intraocular

Resumen

En este informe presentamos un protocolo que permite al investigador generar un modelo murino de uveítis intraocular. Más comúnmente conocida como uveítis autoinmune experimental (EAU), este modelo establecido captura muchos aspectos de la enfermedad humana. Aquí, describiremos cómo inducir y monitorear la progresión de la enfermedad utilizando varias lecturas.

Resumen

La uveítis autoinmune experimental (EAU) es impulsada por células inmunes que responden a los autoantígenos. Muchas características de este modelo de enfermedad inflamatoria intraocular no infecciosa recapitulan el fenotipo clínico de la uveítis posterior que afecta a los humanos. EAU se ha utilizado de manera confiable para estudiar la eficacia de nuevas terapias inflamatorias, su modo de acción y para investigar más a fondo los mecanismos que sustentan la progresión de la enfermedad de los trastornos intraoculares. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado sobre la inducción de EAU en el ratón C57BL / 6J, el organismo modelo más utilizado con susceptibilidad a esta enfermedad. La evaluación clínica de la gravedad y progresión de la enfermedad se demostrará mediante fundoscopia, examen histológico y angiografía con fluoresceína. El procedimiento de inducción consiste en la inyección subcutánea de una emulsión que contiene un péptido (IRBP_1-20) de la proteína ocular interfotorreceptora de la proteína de unión retinoide (también conocida como proteína de unión al retinol 3), adyuvante completo de Freund (CFA) y suplementado con Mycobacterium tuberculosis muerta. La inyección de esta emulsión viscosa en la parte posterior del cuello es seguida por una sola inyección intraperitoneal de toxina Bordetella pertussis . Al inicio de los síntomas (día 12-14) y bajo anestesia general, se toman imágenes fundoscópicas para evaluar la progresión de la enfermedad a través del examen clínico. Estos datos se pueden comparar directamente con los de los puntos temporales posteriores y el pico de la enfermedad (día 20-22) con las diferencias analizadas. Al mismo tiempo, este protocolo permite al investigador evaluar las posibles diferencias en la permeabilidad y el daño de los vasos mediante angiografía con fluoresceína. La EAU puede ser inducida en otras cepas de ratón, tanto de tipo salvaje como genéticamente modificadas, y combinada con nuevas terapias que ofrecen flexibilidad para estudiar la eficacia de los medicamentos y / o los mecanismos de la enfermedad.

Introducción

Este protocolo demostrará cómo inducir Uveítis Autoinmune Experimental (EAU) en el ratón C57BL / 6J mediante una sola inyección subcutánea de un antígeno retiniano en un adyuvante emulsionado. Los métodos para monitorear y evaluar la progresión de la enfermedad se detallarán a través de imágenes fundoscópicas y examen histológico, con parámetros de medición descritos dentro. Además, se discutirá la angiografía con fluoresceína, una técnica para examinar la estructura y permeabilidad de los vasos sanguíneos de la retina.

Este modelo EAU recapitula las características centrales de la uveítis posterior no infecciosa en humanos con respecto a las características clínico-patológicas y los mecanismos celulares y moleculares básicos que impulsan la enfermedad. La EAU está mediada por subconjuntos Th1 y/o Th17 de linfocitos T CD4⁺ autorreactivos, como se muestra en experimentos de transferencia adoptiva y con ratones sin IFNγ¹. Gran parte de nuestra comprensión de las funciones potenciales de estas células en la uveítis proviene del estudio de EAU², donde se detectan células Th1 y Th17 dentro de los tejidos de la retina³. A menudo, la EAU se utiliza como modelo preclínico para evaluar la utilidad de nuevas terapias para atenuar la enfermedad. Los enfoques terapéuticos que han modulado con éxito la enfermedad EAU han demostrado cierta eficacia en la clínica y han alcanzado el estado aprobado por la FDA. Ejemplos de estos son grupos de medicamentos inmunorreguladores como las terapias dirigidas a células T: ciclosporina, FK-506 y rapamicina ^4,5,6. Recientemente, las intervenciones dirigidas a nuevas vías también se han explorado en este modelo para investigar tanto el mecanismo como el efecto sobre el resultado de la enfermedad. Estos incluyen la regulación transcripcional dirigida a través del lector de cromatina Bromodomain Extra-Terminal (BET) proteínas e inhibidores de P-TEFb³. Además, enfoques más convencionales, como un inhibidor de VLA-4, han demostrado recientemente la supresión en EAU a través de la modulación de células T CD4 ⁺ efectoras⁷. Además, también se ha encontrado que dirigirse a las células Th17 con TMP778, un agonista inverso de RORγt, suprime significativamente EAU⁸. Además, este modelo ofrece la oportunidad de estudiar la inflamación autoinmune crónica en la retina y los mecanismos subyacentes que lo acompañan, como el cebado de linfocitos.

Las lecturas primarias para los estudios preclínicos de EAU son la evaluación clínica mediante la realización de imágenes de fundoscopia de retina y, con menos frecuencia, mediante la evaluación de la integridad de la retina mediante tomografía de coherencia óptica (OCT). La evaluación histopatológica de la retina y el inmunofenotipado de las células de la retina mediante citometría de flujo se llevan a cabo al finalizar. La fundoscopia es un sistema de imágenes en vivo fácil de usar que permite una evaluación clínica rápida y reproducible de toda la retina. Para las evaluaciones inmunohistoquímicas, las técnicas se basan en la preparación de secciones retinianas que nos permiten estudiar la arquitectura tisular para el grado de inflamación y daño estructural⁹. Los criterios de evaluación y los sistemas de puntuación convencionales, para todas las técnicas utilizadas, se perfilarán dentro de este protocolo. La extensión del daño registrado mediante imágenes fundoscópicas a menudo se correlaciona estrechamente con los cambios histológicos. Este enfoque dual para monitorear y evaluar la gravedad de la enfermedad ofrece una mayor sensibilidad y resultados de medición más confiables.

EAU es un modelo bien establecido y comúnmente utilizado para pruebas preclínicas e investigación de enfermedades oculares inmunomediadas. Este modelo es confiable y reproducible con una incidencia de enfermedad del >95% y genera datos completos que pueden usarse para validar o repudiar nuevas terapias para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intraocular que representa una causa importante de ceguera en edad laboral en todo el mundo¹⁰.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986 y las directrices institucionales del Organismo de Revisión Ética y de Bienestar Animal (AWERB).

1. Carcasa de ratones C57BL/6J

1. Alojar ratones en un ambiente específico libre de patógenos, en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y alimentos y agua disponibles ad libitum.
2. Realizar todos los experimentos en mujeres adultas C57BL / 6J (las mujeres son elegidas preferentemente ya que hay una incidencia de mujeres a hombres de 1.4 a 1 en pacientes con uveítis). Aleatorizar ratones hembra C57BL/6J entre 6-8 semanas de edad por peso y edad. Aloje a los ratones en jaulas ventiladas individualmente (IVC) en grupos de 5-6 ratones por jaula.

2. Inmunización de ratones C57BL/6

1. IRBP_{1-20 -} Preparación de emulsión CFA
   NOTA: La preparación de emulsiones es esencial para la reproducibilidad e incidencia de enfermedades; Como tal, se debe hacer todo lo posible para mantener la coherencia durante todo el proceso de preparación y entre los experimentos. Al preparar la emulsión, la pérdida debe tenerse en cuenta en los cálculos de todos los reactivos de antemano. Esta pérdida puede ser aproximadamente 1.5x (o 50% adicional del volumen preparado), según el número de ratones planeados para la inmunización. Consulte el siguiente ejemplo a continuación. Para inmunizar a 10 ratones, prepare 15 ratones y use 400 μg (péptido por ratón de 20 g) x 15 ratones = 6 mg. Cada ratón debe recibir 200 μL para la inmunización (3 ml en total). El volumen final comprende una proporción de 1:1 de solución peptídica y CFA, por lo tanto, 1,5 ml de solución peptídica y 1,5 ml de CFA.
   1. Preparar todas las soluciones estériles en una cabina de flujo laminar utilizando técnicas asépticas.
   2. Pesar la cantidad deseada (400 μg por ratón de 20 g) de péptido liofilizado IRBP_1-20 (LAQGAYRTAVDLESLASQLT) humano. Disolver péptido en DMSO 100%. Almacenar el stock en forma liofilizada a -20 °C.
      NOTA: Para garantizar que el polvo esté completamente disuelto, cada escama debe hacer contacto primero con el DMSO y no mostrar signos de sólido residual. Agregue PBS en pequeñas porciones para alcanzar el volumen final. No mezcle con un vórtice, en su lugar use una agitación suave con una pipeta. La concentración final de DMSO no debe exceder el 1% del volumen total de preparación peptídica. La preparación de la emulsión en un tubo de plástico de 20 ml con un fondo cónico debería permitir una mejor accesibilidad del DMSO al polvo liofilizado.
   3. Añadir solución peptídica DMSO-PBS a 1:1 v/v a CFA que ya ha sido suplementada con 1,5 mg/ml muertos Mycobacterium tuberculosis , para dar una concentración final de 2,5 mg/ml. Añadir gota a gota, pipeteando suave y frecuentemente para formar una emulsión viscosa y uniformemente distribuida.
   4. Airear la solución peptídica y CFA utilizando una pipeta de 1000 μL (ajustada a 700 μL para evitar pérdidas mayores) y pipeta para generar una consistencia espesa cremosa. Esta técnica consiste en utilizar la pipeta para aspirar repetidamente hacia arriba y hacia abajo hasta alcanzar el grosor deseado. Para obtener resultados óptimos, asegúrese de que la solución de antígeno y el adyuvante se mezclen bien antes de inyectar.
2. Inyección intraperitoneal de toxina pertussis
   1. Suspender 1,5 μg de toxina Bordetella pertussis en 100 μL de RPMI 1640 medio suplementado con 1% de suero de ratón¹¹.
   2. Realice la inyección i.p. con una jeringa estéril y una aguja 23G.
      NOTA: Para evitar alteraciones en el lugar de la inyección, se debe administrar la toxina pertussis antes de inyectar el antígeno.
   3. Transfiera temporalmente cada ratón a una jaula separada para recibir una sola inyección i.p. de 100 μL de toxina Bordetella pertussis .
3. Inyección subcutánea de emulsión IRBP
   1. A continuación, inyecte la emulsión IRBP por vía subcutánea. Este proceso requiere dos cuidadores de animales debidamente vestidos con protección de acuerdo con las normas de salud y seguridad.
   2. Haga que una persona entrenada sujete ligeramente al ratón en la parte superior de la jaula en una posición desaliñada, con el estómago hacia abajo mientras la otra persona entrenada pellizca la piel para formar una estructura similar a una tienda de campaña en la parte posterior del cuello donde se puede insertar la aguja para encajar entre el dedo y el pulgar.
      PRECAUCIÓN: Existe el peligro de lesiones por pinchazo de aguja.
   3. Una vez colocada la aguja, inyecte 200 μL de la emulsión IRBP. Al retirar la aguja, gire la cabeza de la aguja para cerrar la piel antes de retirarla y aplique presión después en el lugar de la inyección para evitar el reflujo de la emulsión.
      PRECAUCIÓN: La emulsión no debe hacer contacto con la piel o el pelaje del ratón, ya que esto puede causar irritación y, en casos más graves, desarrollar una lesión. Si esto ocurre, el área debe limpiarse inmediatamente y completamente con etanol al 70% y luego secarse.
      NOTA: Si se necesitan los ganglios linfáticos de drenaje para el examen al final del estudio, el sitio de inyección será diferente. En este caso, inyecte 100 μL a ambos lados del flanco por vía subcutánea. Esto generará una respuesta más fuerte en los ganglios linfáticos inguinales drenantes, que pueden extirparse en el momento de la recolección. Sin embargo, si el resultado previsto es únicamente desarrollar EAU, es preferible una sola inyección de 200 μL en la parte posterior del cuello para evitar molestias de múltiples sitios de inyección.

3. Evaluación clínica - Examen del fondo de ojo del ratón

NOTA: La enfermedad clínica debe calificarse mediante el examen del fondo de ojo, a través de imágenes en vivo de campo brillante utilizando un fundoscopio y el software Discover utilizado para la visualización.

1. Al inicio de la enfermedad (día 12-14), sedar a los ratones bajo anestesia general usando una combinación de ketamina (50 mg / ml) y domitor (medetomidina; 1 mg / ml). Diluir 1 parte de Domitor; 1.5 partes de ketamina y 2.5 partes de agua inyectable estéril, luego inyecte 100 μL por 30 g por vía intraperitoneal. Use jeringas estériles de 1 ml y agujas 23G para la combinación de anestesia anterior.
2. Después de esto, monitoree el mouse para asegurarse de que se pierdan todos los reflejos y que no responda a los estímulos.
3. Inmediatamente después de recibir la inyección i.p. y mientras el ratón todavía se mantiene en un desaliño, aplique tropicamida al 1% y fenilefrina al 2,5% tópicamente en cada ojo para la dilatación de la pupila. Trate de cubrir completamente la córnea con ambas soluciones dilatadoras. Pueden pasar unos minutos antes de que la pupila esté completamente dilatada.
4. Después, aplique generosamente al ojo ungüento viscotears y manténgalo durante todo el proceso de imagen para mantener el ojo completamente lubricado e hidratado.
5. Mientras tanto, abra el software (por ejemplo, Discover) y configure el fundoscopio (por ejemplo, Micron) para capturar imágenes en campo claro. Asigne a cada ratón individual una carpeta y etiquete las imágenes con R o L de acuerdo con cada ojo fotografiado.
6. Monte el ratón en un escenario especialmente diseñado para la visualización en vivo y coloque el microscopio para un acceso completo a la retina.
7. Para obtener una representación precisa de la enfermedad, tome imágenes de toda el área de la retina, cubriendo todos los rincones de la periferia además del disco óptico. Para lograr esto, ajuste el ocular en todo momento. Es crucial que el ojo permanezca completamente lubricado en todo momento durante todo el proceso de obtención de imágenes; Asegúrese de esto rellenando el ungüento para los ojos a una velocidad constante.
8. Consulte la sección 4 (a continuación) en esta etapa para realizar la angiografía con fluoresceína.
9. Una vez que se hayan completado todas las imágenes, diluir la reversión anestésica antisedante (5 mg/ml Antisedán) en agua inyectable y administrar a 0,1 mg/kg i.p. Devuelva el ratón a una jaula y colóquelo en una estera precalentada con acceso a una dieta empapada en húmedo hasta la recuperación. La recuperación completa se caracteriza por el movimiento de todo el cuerpo y caminar alrededor de la jaula con marcha constante, por lo general toma unas pocas horas.
10. En el punto final experimental designado (por ejemplo, día 21-23), repita los pasos 4.1-4.5 y tome fotografías de toda el área de la retina nuevamente, cubriendo el disco óptico y todos los rincones de la periferia para capturar una representación precisa de la enfermedad.

4. Angiografía con fluoresceína

1. Para medir la fuga de vasos en estos animales, mientras están bajo anestesia, administre a cada ratón una inyección de fluoresceína al 2% por vía subcutánea en la parte posterior del cuello y coloque de tal manera que la retina esté centralizada en el centro de la imagen en vivo.
2. Ajuste el fundoscopio a un filtro de excitación de luz azul a 465-490 nm. La luz capturada de la fluoresceína excitada está entre 520-530 nm.
3. Después de 1,5 minutos después de la inyección de fluoresceína, tome una fotografía de cada retina y repita de nuevo a los 7 minutos.
   NOTA: El tiempo es crítico para estos eventos, si no puede capturar ambos, solo imagine un ojo.

5. Puntuación de la enfermedad clínica

1. Basar la evaluación clínica en la gravedad de los siguientes criterios: inflamación del disco óptico, manguito de los vasos retinianos, infiltrado de tejido retiniano y daño estructural.
2. Otorgar a cada uno de estos parámetros una puntuación en una escala de 0 a 5 y el total colectivo es representativo de la enfermedad clínica para todo el ojo, con una puntuación máxima de 20 que se puede obtener por ojo. La Tabla 1 se puede utilizar como guía para los criterios de puntuación.

6. Histología y puntuación histológica

1. Después de sacrificar a los ratones por dislocación cervical, enuclee los ojos separando los párpados para facilitar el acceso a todo el ojo.
2. A continuación, coloque pinzas curvas detrás del globo con la intención de agarrar el tejido conectivo orbital y el nervio óptico. Tenga cuidado de evitar exprimir el mundo.
3. Para la fijación, coloque el ojo en glutaraldehído al 4% durante un mínimo de 15 minutos para minimizar el desprendimiento de retina, y luego transfiera a formaldehído al 10% durante al menos 24 h. 1-2 ml de fijador daría suficiente volumen para cubrir dos ojos.
4. Realizar incrustación en parafina, seccionamiento en un micrótomo y tinción de acuerdo con los protocolos estándar. Se recomienda un espesor de sección de 3-4 μm para cualquier tipo de tinción.
5. Realizar un examen histológico de los ojos utilizando protocolos estándar para la tinción de hematoxilina y eosina (H&E).
6. Asigne puntuaciones en una escala de 0-4, de acuerdo con los criterios para la puntuación EAU, basado en el grado de infiltración de células inmunes dentro de la retina y la coroides, la interrupción de las capas retinianas, el grado de formación de granuloma y la extensión del desprendimiento de retina, lo que indica daño retiniano, como se describió anteriormente (Agarwal 2013) y se resume en la Tabla 2¹¹.

Resultados

En este protocolo, describimos un método paso a paso para inducir un modelo de uveítis autoinmune experimental (EAU) mediante la inmunización de ratones con un péptido retiniano uveitogénico derivado del IRBP. La evaluación de la enfermedad empleando enfoques ampliamente utilizados y de fácil acceso están cubiertos, aunque estos no son exclusivos y pueden ser añadidos o reemplazados parcialmente por otras técnicas de imagen. Los primeros signos de EAU en ratones C57BL / 6J se pueden detectar dos semanas después de la inm...

Discusión

Los modelos animales experimentales son herramientas necesarias para estudiar la patogénesis de la enfermedad y las pruebas preclínicas de nuevos paradigmas terapéuticos. En el protocolo actual, hemos discutido una metodología para inducir, monitorear y puntuar EAU, un modelo experimental de uveítis inflamatoria intraocular. Este modelo EAU tiene más del 95% de incidencia de enfermedad cuando todos los procedimientos se realizan de acuerdo con el protocolo descrito en este documento, y da como resultado el desarrollo de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
antisedan	ZOETIS, EE.UU		para despertar
Complete Freund' s Coadyuvante; CFA	Sigma, Reino Unido	F5881	para inmunización
Domitor	Orion Pharma, Finlandia		para anestesia
Flourescein	Sigma, Reino Unido	F2456	para angiografía
IRBP1-20	Chamberidge péptido, péptido del Reino Unido		; antígeno
Ketamina	Orion Pharma, Finlandia		para anestesia
Micron III	Phoenix Research, EE. UU		para fundoscopia
Suero de ratón	Sigma, Reino Unido	M5905	para inmunización
Mycobacterium terberculosis	Sigma, Reino Unido	344289	para la inmunización
Toxina	Sigma para	P2980	para inmunización
clorhidrato de fenilefrina 2.5%	Bausch & Lomb Reino Unido	PHEN25	para la dilatación
Tropicamida 1%	SANDOZ		para la dilatación
Viscotears	WELDRICKS Pharmacy, Reino Unido	2082642	para la lubricación ocular