Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Resumen

La captura de los procesos dinámicos de replicación y ensamblaje de virus se ha visto obstaculizada por la falta de tecnologías robustas de hibridación in situ (ISH) que permitan el etiquetado sensible y simultáneo de ácidos nucleicos y proteínas virales. Los métodos convencionales de hibridación in situ por fluorescencia de ADN (FISH) a menudo no son compatibles con la inmunotinción. Por lo tanto, hemos desarrollado un enfoque de imagen, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein), que permite la visualización simultánea de ADN, ARN y proteína en una sola célula. En comparación con los peces de ADN convencionales, MICDDRP utiliza la tecnología ISH de ADN ramificado (ADNb), que mejora drásticamente la sensibilidad y detección de la sonda de oligonucleótidos. Pequeñas modificaciones de MICDDRP permiten obtener imágenes de proteínas virales concomitantemente con ácidos nucleicos (ARN o ADN) de diferentes cadenas. Hemos aplicado estos protocolos para estudiar los ciclos de vida de múltiples patógenos virales, incluido el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus del Zika (ZKV) y el virus de la influenza A (IAV). Demostramos que podemos etiquetar eficientemente los ácidos nucleicos y las proteínas virales en una amplia gama de virus. Estos estudios pueden proporcionarnos una mejor comprensión mecanicista de múltiples sistemas virales y, además, servir como plantilla para la aplicación de imágenes de fluorescencia multiplexada de ADN, ARN y proteínas en un amplio espectro de sistemas celulares.

Introducción

Si bien hay miles de anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar específicamente las proteínas a través de enfoques convencionales de inmunotinción, y mientras que las proteínas de fusión se pueden diseñar con etiquetas fluorescentes fotooptimizadas para rastrear múltiples proteínas en una muestra¹, la visualización microscópica de proteínas a menudo no es compatible con la hibridación in situ de fluorescencia de ADN convencional (FISH)² . Las limitaciones técnicas en la visualización simultánea de ADN, ARN y proteínas utilizando enfoques basados en fluorescencia han obstaculizado la comprensión profunda de la replicación del virus. El seguimiento tanto del ácido nucleico viral como de la proteína durante el curso de la infección permite a los virólogos visualizar los procesos fundamentales que subyacen a la replicación y ensamblaje del virus 3,4,5,6.

Hemos desarrollado un enfoque de imagen, la detección dbasada en ml ultiplex immunofluorescent cell-based de DNA, RNA y Protein (MICDDRP)³, que utiliza la tecnología in situ de ADN ramificado (ADNb) para mejorar la sensibilidad de ladetección de ácidos nucleicos 7,8,9 . Además, este método utiliza sondas pareadas para mejorar la especificidad. Las sondas específicas de secuencia de ADNb utilizan ADN de preamplificador ramificado y amplificador para producir una señal intensa y localizada, mejorando los métodos de hibridación anteriores que se basaban en apuntar a regiones repetidas en el ADN⁹. Las células infectadas en un contexto clínico a menudo no contienen abundante material genético viral, proporcionando un producto para un método sensible para la detección de ácidos nucleicos fluorescentes en entornos de diagnóstico. La comercialización de la tecnología bDNA a través de enfoques como RNAscope⁷ y ViewRNA¹⁰ han llenado este nicho. La sensibilidad de las imágenes de fluorescencia de ADNb también tiene una utilidad importante en biología celular, permitiendo la detección de especies escasas de ácidos nucleicos en modelos de cultivo celular. La gran mejora de la sensibilidad hace que los métodos de imagen basados en ADNb sean adecuados para estudiar virus. Una deficiencia potencial, sin embargo, es que estos métodos se centran en la visualización de ARN o ARN y proteína. Todas las células replicantes y muchos virus tienen genomas de ADN o forman ADN durante su ciclo de replicación, lo que hace que los métodos capaces de obtener imágenes tanto de ARN como de ADN, así como proteínas, sean altamente deseables.

En el protocolo MICDDRP, realizamos bDNA FISH para la detección de ácido nucleico viral utilizando el método RNAscope, con modificaciones⁷. Una de las principales modificaciones de este protocolo es la optimización del tratamiento con proteasa después de la fijación química. El tratamiento con proteasa facilita la eliminación de proteínas unidas al ácido nucleico para mejorar la eficiencia de la hibridación de la sonda. El tratamiento con proteasa es seguido por la incubación con sondas de oligonucleótidos ramificados. Después de la aplicación de las sondas de ADNb, las muestras se lavan y posteriormente se incuban con ADN de preamplificador de señal y amplificador. La hibridación in situ multiplexada (ISH), el etiquetado de múltiples dianas génicas requiere sondas diana con diferentes canales de color para la diferenciación espectral⁷. La incubación con amplificadores de ADN es seguida por inmunofluorescencia (IF).

bDNA ISH imparte mejoras en la relación señal-ruido mediante la amplificación de señales específicas del objetivo, con una reducción del ruido de fondo de eventos de hibridación no específicos ^7,11. Las sondas objetivo se diseñan utilizando programas de software disponibles públicamente que predicen la probabilidad de eventos de hibridación no específicos, así como calculan la temperatura de fusión (T_m) del híbrido sonda-objetivo ^7,11. Las sondas objetivo contienen una región de 18 a 25 bases complementaria a la secuencia de ADN/ARN objetivo, una secuencia de espaciador y una secuencia de cola de 14 bases. Un par de sondas objetivo, cada una con una secuencia de cola distinta, se hibridan a una región objetivo (que abarca ~ 50 bases). Las dos secuencias de cola forman un sitio de hibridación para las sondas del preamplificador, que contienen 20 sitios de unión para las sondas del amplificador, que, además, contienen 20 sitios de unión para la sonda de etiqueta. Como ejemplo, una región de un kilobase (kb) en la molécula de ácido nucleico es objetivo de 20 pares de sondas, creando un andamio molecular para la hibridación secuencial con el preamplificador, el amplificador y la sonda de etiqueta. Por lo tanto, esto puede conducir a un rendimiento teórico de 8000 etiquetas fluorescentes por molécula de ácido nucleico, lo que permite la detección de moléculas individuales y grandes mejoras sobre los enfoques convencionales de FISH⁷ (Ver Figura 1A para el esquema de amplificación de señales de ADNb). Para configurar sondas para ISH multiplexado, cada sonda de destino debe estar en un canal de color diferente (C1, C2 o C3). Estas sondas objetivo con diferentes canales de color poseen distintas secuencias de cola de 14 bases. Estas secuencias de cola se unirán a distintos amplificadores de señal con diferentes sondas fluorescentes, lo que permitirá una fácil diferenciación espectral a través de múltiples objetivos. En el Protocolo presentado, la Tabla 4 en el Paso 9, proporciona más información sobre el etiquetado fluorescente de las sondas objetivo. Además, la Figura 2 y la Figura 3 proporcionan ejemplos de cómo elegimos el amplificador 4-FL (A, B o C) apropiado (sonda fluorescente y el paso final de hibridación) para lograr un etiquetado fluorescente específico de múltiples objetivos de ácido nucleico viral después de las infecciones por VIH-1 y HTLV-1.

Hemos demostrado varias aplicaciones de visualización simultánea de fluorescencia de ARN, ADN y proteínas, observando etapas críticas de replicación del virus con alta resolución espaciotemporal ^3,4,5. Por ejemplo, la visualización simultánea de una sola célula de ARN viral, ADN citoplasmático y nuclear y proteínas nos ha permitido visualizar eventos clave durante la infección por VIH-1, incluido el seguimiento de núcleos que contienen ARN en el citoplasma antes de la entrada nuclear y la integración del ADN proviral³. Además, hemos aplicado MICDDRP para caracterizar los efectos de los factores del huésped y el tratamiento farmacológico sobre la infección viral y la replicación ^4,5. En Ukah et al., rastreamos la reactivación de la transcripción del VIH-1 en modelos de células de latencia tratados con diferentes agentes de reversión de latencia para visualizar la transcripción del VIH y la reversión de la latencia⁴. Además, MICDDRP puede permitirnos visualizar cambios fenotípicos asociados con la inhibición antiviral atribuida al tratamiento de moléculas pequeñas o la restricción del factor huésped. Como prueba de concepto de la solidez y amplia aplicabilidad de nuestro enfoque, hemos demostrado que podemos utilizar modificaciones de nuestro protocolo para etiquetar eficientemente el ácido nucleico viral para seguir la infección no solo en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, sino también en el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), Virus del Zika (ZIKV) y virus de la influenza A (IAV). Como el ciclo de vida del VIH-1 consiste en especies de ADN y ARN virales, hemos realizado la mayor parte de nuestra optimización de MICDDRP siguiendo la cinética de replicación del VIH-1. Sin embargo, además, hemos demostrado que podemos rastrear la síntesis de diferentes transcripciones de ARN viral de uno o ambos nervios de sentido (+) y antisentido (-) en virus como ZIKV, IAV, HBV y VHC para monitorear la transcripción y replicación viral 3,4,5,6. Los estudios tienen como objetivo mejorar la comprensión mecanicista de varios procesos virales y servir como guía para implementar esta tecnología de imágenes de fluorescencia en una amplia gama de modelos celulares.

Protocolo

1. Células semilla (Suspensión vs. Células Adherentes) en cubreobjetos o portaobjetos de cámara (el protocolo presentado utiliza cubreobjetos).

1. Siembra de células de suspensión
   1. Prepare cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) (facilita la adherencia de las células de suspensión al cubreobjetos) incubando primero los cubobjetos en etanol (EtOH) durante 5 minutos (esteriliza los cubreobjetos y elimina cualquier residuo). Luego lavar 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de incubar los cubobjetos en PDL (20 μg/ml) durante 30 minutos (min) a temperatura ambiente (RT).
   2. Retire PDL y lave 2x en PBS. Células granulares (previamente infectadas/tratadas en función de las condiciones de imagen deseadas) y resuspender 10⁶células en 50 μL de PBS. Detectar 50 μL de células en vidrio (recubierto de PDL) e incubar a RT durante 30 min.
2. Siembra de células adherentes
   1. Cultive células en un cubreobjetos estéril colocado en un plato de 6 pocillos e infecte las células con partículas virales o trate con un compuesto de interés. Permitir que las células alcancen una confluencia del 50-70% antes de la preparación de la muestra para los experimentos de imágenes.

2. Fijación celular: Para preservar la morfología celular para estudios de imágenes de fluorescencia

NOTA: Mantenga el 4% de PFA y PBS en RT durante al menos 30 minutos antes de la fijación celular.

1. Aspire los medios celulares, lave las células en cubreobjetos 3x en PBS y fije las células en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 minutos. Aspirar PFA y lavar las células en PBS 2x.
   NOTA: Las células ahora pueden ser deshidratadas y almacenadas, si el experimentador desea reanudar el experimento en otra fecha. Las células fijas se pueden deshidratar en EtOH antes del almacenamiento.
   1. Eliminar el PBS después del lavado después de la fijación celular y reemplazar con 500 μL de EtOH al 50% (v/v en agua). Incubar a RT durante 5 min.
   2. Retire el 50% de EtOH y reemplácelo con 500 μL de EtOH al 70%. Incubar a RT durante 5 min.
   3. Eliminar el 70% de EtOH y reemplazarlo con 500 μL de 100% de EtOH. Incubar a RT durante 5 min.
   4. Retire 100% EtOH y reemplácelo con 100% EtOH fresco.
      NOTA: Las células deshidratadas se pueden almacenar a -20 °C durante 6 meses. Selle las placas con cinta o parafilm antes del almacenamiento para evitar la evaporación de EtOH.
   5. Rehidratar las células para pasar al etiquetado de fluorescencia multiplexada de células / virus.
   6. Retire el 100% de EtOH y reemplácelo con 500 μL de EtOH al 70%. Incubar en RT durante 2 min.
      NOTA: No deje que las células se sequen en ningún momento. Siempre use suficiente solución para sumergir todas las células.
   7. Eliminar el 70% de EtOH y reemplazarlo con 500 μL de 50% de EtOH. Incubar en RT durante 2 min.
   8. Elimine el 50% de EtOH y reemplácelo con 1x PBS.
      NOTA: Prepare la dilución de proteasa, las sondas de hibridación y el tampón de lavado antes del tratamiento con proteasa (Paso 4) y la aplicación de la sonda objetivo (Paso 5). Las instrucciones específicas sobre la preparación del reactivo se presentan al comienzo de cada paso respectivo.

Reactivos	Otras notas
Solución de proteasa	Prepárese en 1X PBS
Sonda(s) de oligonucletodie diana	Diluir en tampón de hibridación
Tampón de lavado	Lavados siguiendo los pasos de hibridación objetivo
Tampón de hibridación	Receta presentada en la Tabla 3

Tabla 1: Reactivos clave en el protocolo MICDDRP.

3. Permebilización celular: Aumenta el acceso a la célula y a los orgánulos celulares para la entrada de moléculas grandes (anticuerpos, sondas de hibridación de ácidos nucleicos)

1. Retire 1x PBS después de la fijación celular o rehidratación y reemplácelo con 500 μL de 0.1% (v/v) Tween-20 en 1x PBS. Incubar en RT durante 10 min. Reemplace uno por uno. Lavar una vez con 500 μL de 1x PBS y añadir 1x PBS fresco.

4. Inmovilización de cubreobjetos en portaobjetos de vidrio y tratamiento con proteasa para eliminar las proteínas de unión al ácido nucleico del ácido nucleico viral / celular fijo para mejorar la eficiencia de la hibridación

NOTA: Prepare la solución diluida de proteasa III (ver detalles del reactivo en la Tabla de materiales) durante la permeabilización celular. Deje que la proteasa alcance la RT durante 10 minutos antes de la permeabilización.

1. Coloque una pequeña gota de esmalte de uñas en un portaobjetos de vidrio esterilizado. Seque la espalda (lado sin capa celular) y coloque el borde del cubreobjetos sobre la gota de esmalte de uñas, con el lado con las células adheridas hacia arriba. Agregue unas gotas de PBS en el cubreobjetos inmovilizado para evitar que se seque.
   1. Dibuje un círculo (a unos 3 mm de distancia del cubreobjetos) alrededor del perímetro del cubreobjetos ahora adherido a la diapositiva con un bolígrafo de barrera hidrófobo (bolígrafo repelente al agua que mantiene los reactivos localizados en las células).
2. Proteasa III diluida en 1x PBS (100 μL/cubreobjetos).
   NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la concentración de proteasa dependiendo de las diferencias en los tipos de células, sondas o ácidos nucleicos diana a través de la optimización empírica (Ver Discusión). Para un etiquetado de ARN/ADN más eficiente en diferentes sistemas virales, tuvimos éxito con las siguientes diluciones presentadas en la Tabla 2 a continuación con diluciones que van desde (1 a 2 )-(1 a 15) (proteasa a 1x PBS).

Objetivos de sondeo	Dilución de proteasa en PBS 1X (proteasa III a 1X PBS)
ADN/ARN del VIH-1	1 a 5
HTLV-1 ADN/ARN	1 a 5
PGRNA del VHB y ARN total del VHB	1 a 15
ARN IAV	1 a 15
ARN ZIKV	1 a 2

Tabla 2: Diluciones de proteasa III en PBS para hibridación de ácidos nucleicos virales.

3. Decantar el 1x PBS en el cubreobjetos después de la inmovilización y aplicar la proteasa III diluida.
4. Incubar en un horno humidificado a 40 °C durante 15 min.
5. Decantar la solución de proteasa y sumergir los portaobjetos en 1x PBS. Agitar con un plato mecedor durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo PBS 1x.
   1. Solo para la detección de ADN, lavar las muestras tres veces con agua libre de nucleasas durante 2 minutos cada una, seguido de la incubación con 5 mg/ml de RNasa A diluida en PBS durante 30 min a 37 °C.
   2. Decantar la solución de RNasa A y lavar 3 veces durante 2 minutos con agua ultrapura. Continúe con ISH de las sondas objetivo.
      NOTA: El tampón de hibridación mejora la detección de vDNA sin afectar la eficiencia de tinción de vRNA para los resultados presentados (Resultados representativos). Sondas diluidas del canal de ADN 1 (C1) 1:1 con sonda de hibridación. Sondas de ARN C2 y C3 diluidas en tampón de hibridación. Las sondas C2 y C3 utilizadas en nuestros estudios de imagen están en soluciones 50X (1:50; sonda de destino a tampón de hibridación).
6. Prepare el tampón de hibridación en agua libre de nucleasas siguiendo el procedimiento paso a paso a continuación:
   1. En un tubo de 15 ml, añadir 700 μL de agua libre de nucleasa, 300 μL de sulfato de dextrano al 50% (peso/volumen (p/v)], 300 μL de NaCl 5M, 125 μL de citrato de sodio de 200 mM (pH 6,2) y 375 mg (polvo) de carbonato de etileno.
   2. Mezcle bien usando un vórtice para disolver el carbonato de etileno (asegúrese de que todo el polvo esté disuelto y la solución clara).
   3. Añadir 25 μL de Tween-20 al 10% (volumen/volumen (v/v)) y suficiente agua libre de nucleasas para completar 2,5 ml (solución 2x).
      NOTA: La receta para el tampón de hibridación presentado se puede encontrar en la Tabla 3 a continuación. La solución es estable durante una semana. Asegúrese de mezclar suficiente detergente Tween-20, teniendo cuidado de evitar el burbujeo de la solución.

Reactivo	Concentración de existencias	Notas adicionales
Agua libre de nucleasas	NA
Sulfato de dextrano	50% (p/v)	Muy viscoso
Cloruro de sodio	5 M
Citrato de sodio (pH 6.2)	200 mM	Conservar a 4 °C
Carbonato de etileno	NA	Polvo
Preadolescente-20	10% (v/v)

Tabla 3: Lista de reactivos tampón de hibridación.

5. Incubación con sondas de hibridación diana de ADN/ARN: Las sondas de oligonucleótidos diana se unen a la(s) región(es) de interés, creando un andamio molecular para que se unan preamplificadores, amplificadores y sondas fluorescentes.

NOTA: Calentar las sondas de ADN/ARN a 40 °C durante 10 min (durante la permeabilización celular) y enfriar a RT durante al menos 10 min, si no se incluye tratamiento con RNasa. Si se necesita tratamiento con RNasa o tratamiento adicional con la muestra antes de la hibridación de la sonda objetivo, caliente las sondas en consecuencia. Girar las sondas C2 y C3 después del calentamiento y diluir en tampón de hibridación. Después de la dilución, las sondas C2 y C3 se pueden calentar brevemente. Calentar el tampón de lavado 50x (ver Tabla de materiales para más detalles) a 40 °C durante 10-20 min y diluir hasta 1x en agua de grado de biología molecular.

1. Incubar 200 μL del tampón de hibridación a 67 °C durante 10 min antes de añadir la(s) sonda(s) de hibridación. Sonda diluida en tampón de hibridación (receta indicada en la Tabla 2). Añadir 50 μL/cubreobjetos.
2. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 2 horas (h). Decantar sondas y sumergir diapositivas en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.

6. Hibridación 1-FL del amplificador (amp): Adición de un preamplificador que es complementario a la secuencia de cola de las sondas de ADN/ARN objetivo (Paso 5)

NOTA: Los amplificadores deben estar en RT antes de su uso. Saque cada amplificador individual de la nevera 30 minutos antes de usarlo y déjelo en el banco en RT.

1. Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
2. Agregue 1 gota de Amp 1-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 30 min.
3. Decantar Amp 1-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.

7. Hibridación Amp 2-FL: Incubación con amplificador de señal con secuencia de reconocimiento afín a preamplificadores (Amp 1-FL)

1. Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
2. Agregue 1 gota de Amp 2-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 15 min.
3. Decantar Amp 2-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.

8. Hibridación Amp 3-FL: Incubación con segundo amplificador de señal

1. Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
2. Añade 1 gota de Amp 3-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 30 min.
3. Decantar Amp 3-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.

9. Hibridación Amp 4-FL: etiqueta fluorescente y paso final de hibridación

NOTA: En primer lugar, consulte la Tabla 4 para elegir el Amp 4 (A, B o C)- FL adecuado en función de los canales de las sondas objetivo. Evalúe qué Amp 4-FL se necesita para etiquetar el ADN/ARN de interés. En la siguiente tabla se proporciona un ejemplo:

	Un	B	C
Canal de ADN 1 (C1)	488	550	550
Canal 2 (C2) de ADN/ARN	550	488	647
Canal de ARN 3 (C3)	647	647	488

Tabla 4: Selección de la sonda fluorescente Amp 4 (A, B o C)-FL para ISH multiplexada.

NOTA: Para FISH multiplexados (múltiples objetivos), elegir el Amp 4 (A, B o C)- FL correcto es fundamental para etiquetar correctamente su (s) objetivo (s) de interés. Las sondas de destino (Paso 5) tienen diferentes canales de color (C1, C2 o C3), que dictan su respectiva etiqueta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 o Alexa 647), según el Amp 4-FL elegido. Los ejemplos de elección de combinaciones de fluoróforos para imágenes multiplexadas se proporcionan en las leyendas de la Figura 2 y la Figura 3. Como ejemplo adicional, la selección de Amp 4B-FL marcará selectivamente las sondas de ADN C1 con Atto 550 y las sondas de ARN C3 con Alexa 647.

1. Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
2. Añade 1 gota de Amp 4-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 15 min.
   NOTA: Siguiendo el paso 9.2, mantenga las muestras cubiertas, protegidas de la luz.
3. Decantar Amp 4-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x. Lavar con 1x PBS (2 min) y almacenar en PBS.

10. Inmunotinción de proteínas: Para etiquetar la(s) proteína(s) de interés

1. Decantar PBS y agregar 200 μL de tampón de bloqueo (1% p/v BSA, 10% v/v FBS en PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) al cubreobjetos. Incubar 1 h en RT.
2. Decantar el tampón de bloqueo y aplicar 200 μL de anticuerpo primario diluido en PBST + 1% p/v BSA. Incubar 1 h en RT.
3. Lave el portaobjetos dos veces con PBST durante 10 minutos en RT con agitación.
4. Aplicar el anticuerpo secundario de elección durante 1 h en RT en PBST + 1% p/v BSA.
5. Lave el portaobjetos con PBST durante 10 minutos en RT con agitación.

11. Tinción nuclear: Núcleos contra tinción después de la inmunotinción

1. Decantar PBST y aplicar DAPI o tinción nuclear de elección durante 1 min en RT.
2. Lave el portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos en RT con agitación.

12. Montaje

1. Coloque 1 gota de solución antidecoloración (por ejemplo, Prolong Gold) en un nuevo portaobjetos de vidrio estéril (primero, limpie el portaobjetos con EtOH y deje secar para asegurarse de que no haya residuos en el vidrio). Con la misma punta, extienda la gota de la solución antidecoloración para cubrir un área aproximadamente del tamaño del cubreobjetos.
   NOTA: La solución antidecoloración es muy viscosa y puede ser difícil de pipetear. Cortar la punta de una punta de 200 μL antes del pipeteo puede mitigar estos problemas.
2. Retire el cubreobjetos con muestra de celda del portaobjetos y sumérjalo en PBS para eliminar el esmalte de uñas residual en la parte posterior utilizando los fórceps y PBS. Fórceps secos y parte posterior del cubreobjetos con un Kimwipe.
3. Incruste suavemente el cubreobjetos en la gota de solución antidecoloración, colocando el lado de la muestra (lado con la capa celular) del cubreobjetos sobre la gota).
4. Deje que las muestras se sequen durante la noche.

13. Imágenes

1. Imagen con un microscopio epifluorescente.

Resultados

Un esquema de MICDDRP se representa en la Figura 1. El etiquetado del ADN y el ARN es seguido por la inmunotinción. El uso de amplificadores de ramificación aumenta la señal, lo que permite la detección de moléculas individuales de ácido nucleico.

Figura 1: Esquema de MICDDRP y flujo de trabajo paso a paso. (A) La señal...

Discusión

La visualización simultánea de ARN, ADN y proteína a menudo requiere una optimización extensa. Dos métodos comúnmente utilizados son el etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina (EdU) y DNA FISH. El etiquetado de EdU se ha aplicado para visualizar el ADN viral y la proteína simultáneamente, ya que EdU se incorpora en el ADN naciente y posteriormente se marca con colorantes fluorescentes que contienen azida a través de la química de clic. Por lo tanto, el etiquetado EdU se puede utilizar para monitorear la cinética ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4% PFA
50% sulfato de dextrano	Amreso	198	Para tampón de hibridación de ADN
Tampón de lavado 50X	ACD Bio 320058
Placas de 6 pocillos
Amplificador 1-FL	ACD Bio
Amplificador 2-FL	ACD Bio
Amplificador 3-FL	ACD
Bio Amplificador 4-FL	ACD Bio		Consultar Tabla Amp-4 en el protocolo
Anticuerpo anti-VHC NS5a	Abcam	ab13833	Monoclonal de ratón; funciona con los genotipos 1a, 1b, 3 y 4 del VHC
Anticuerpo monoclonal p24 contra el VIH-1 Programa de	reactivos para el SIDA de los NIH	3537
Anticuerpo anti-Mov10	Abcam	ab80613	Policlonal
de conejoAnticuerpo anti-PB1	GeneTex	GTX125923	Anticuerpo contra la proteína de la gripe
Albúmina			Reactivo bloqueante para la inmunotinción
Medios celulares con suplementos Medios			apropiados para el modelo de célula
Cubreobjetos
DAPI	ACD Bio		Tinción nuclear (kit de ARNscope de ACD Bio)
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X PBS)	Gibco	14190250	Sin calcio y magnesio
Carbonato de etileno	Sigma	E26258
Suero fetal bovino (FBS)	Utilice FBS específico en función del anticuerpo secundario sérico en el que se crió (por ejemplo,
Portaobjetos de microscopio colorfrost plus de	Fisherbrand Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Prelimpiado
Sonda HCV-GT2a-sense-C2	ACD Bio	441371	Sonda de ARN con sensor de VHC(+)
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	sonda de ADNc para el VIH-1
	ACD Bio	317711-C	Sonda de ARN HIV-1
Horno de hibridación HybEZ	ACD Bio	321710/321720
Bolígrafo barrera hidrofóbico ImmEdge	Vector Laboratories	H-4000
Esmalte			Para inmobolizar el cubreobjetos para deslizarlo antes del tratamiento con proteasa
Agua libre de nucleasa	Ambion	AM9937
Poly-d-lisina (PDL)			Cubrecubrecubreobjetos en 20 µ g/mL de PDL durante 30 minutos
Diluyente de sonda	ACD Bio 300041		Para diluir sondas de ARN C2 o C3
Prolong, gold antifade	Invitrogen	P36930
Proteasa III	ACD Bio	322337
RNAscope®   Sonda- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNasa A	Qiagen
Anticuerpos
Portaobjetos Cloruro
de sodio	Para tampón de hibridación
Citrato de sodio, pH 6.2			Para tampón de hibridación
de ADN Tween-20			Para tampón de hibridación de ADN y PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV Sonda de ARNpg
V-HCV-GT2a	ACD Bio	441361	VHC (-) sonda de ARN de sentido
	ACD Bio	495071-C3	HTLV-1 (-) sonda de ARN de detección dirigida a HBZ
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	Sonda de ADN HTLV-1
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+) sonda de ARN
de detección V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221 Sonda	de ARN IAV
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	Sonda de ARN con sensor de Zika(+)
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	ARN con sensor de Zika(-) sonda