Summary
Здесь представлен протокол для подхода флуоресцентной визуализации, multiplex immunofluorescent cell-based detection DNA, RNA и protein (MICDDRP), метод, способный одновременно флуоресцентной одноклеточной визуализации вирусного белка и нуклеиновых кислот различного типа и цепкости. Этот подход может быть применен к широкому спектру систем.
Abstract
Захват динамических процессов репликации и сборки вирусов был затруднен отсутствием надежных технологий гибридизации in situ (ISH), которые позволяют чувствительную и одновременную маркировку вирусных нуклеиновых кислот и белков. Обычные методы флуоресценции ДНК in situ гибридизации (FISH) часто не совместимы с иммуноокрашиванием. Поэтому мы разработали подход к визуализации , MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based d etection of DNA, RNA и protein), который позволяет одновременно проводить одноклеточную визуализацию ДНК, РНК и белка. По сравнению с обычной ДНК FISH, MICDDRP использует технологию разветвленной ДНК (bDNA) ISH, которая значительно улучшает чувствительность и обнаружение олигонуклеотидного зонда. Небольшие модификации MICDDRP позволяют визуализировать вирусные белки одновременно с нуклеиновыми кислотами (РНК или ДНК) различной нити. Мы применили эти протоколы для изучения жизненных циклов нескольких вирусных патогенов, включая вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)-1, человеческий Т-лимфотропный вирус (HTLV)-1, вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус Зика (ZKV) и вирус гриппа A (IAV). Мы продемонстрировали, что можем эффективно маркировать вирусные нуклеиновые кислоты и белки в различных спектрах вирусов. Эти исследования могут предоставить нам улучшенное механистическое понимание множественных вирусных систем и, кроме того, служить шаблоном для применения мультиплексированной флуоресцентной визуализации ДНК, РНК и белка в широком спектре клеточных систем.
Introduction
В то время как тысячи коммерческих антител доступны для специфической маркировки белков с помощью обычных иммуноокрашающих подходов, и хотя слитые белки могут быть спроектированы с помощью фотооптимизированных флуоресцентных меток для отслеживания нескольких белков в образце1, микроскопическая визуализация белка часто не совместима с обычной флуоресцентной гибридизацией ДНК in situ (FISH)2 . Технические ограничения в одновременной визуализации ДНК, РНК и белка с использованием флуоресцентных подходов препятствовали глубокому пониманию репликации вируса. Отслеживание как вирусной нуклеиновой кислоты, так и белка во время течения инфекции позволяет вирусологам визуализировать фундаментальные процессы, которые лежат в основе репликации и сборки вируса 3,4,5,6.
Мы разработали подход к визуализации, multiplex immunofluorescent cell-based detection DNA, RNA и Protein (MICDDRP)3, который использует технологию разветвленной ДНК (bDNA) in situ для повышения чувствительности обнаружения нуклеиновых кислот 7,8,9 . Кроме того, этот метод использует парные зонды для повышения специфичности. Зонды, специфичные для последовательности bDNA, используют ветвящиеся предусилители и усилители ДНК для получения интенсивного и локализованного сигнала, улучшая предыдущие методы гибридизации, которые основывались на нацеливании на повторяющиеся области в ДНК9. Инфицированные клетки в клиническом контексте часто не содержат обильного вирусного генетического материала, обеспечивая товар для чувствительного метода обнаружения флуоресцентных нуклеиновых кислот в диагностических условиях. Коммерциализация технологии бДНК с помощью таких подходов, как RNAscope7 и ViewRNA10, заполнила эту нишу. Чувствительность флуоресцентной визуализации бДНК также имеет важное значение в клеточной биологии, позволяя обнаруживать редкие виды нуклеиновых кислот в моделях клеточных культур. Значительное улучшение чувствительности делает методы визуализации на основе бДНК подходящими для изучения вирусов. Потенциальный недостаток, однако, заключается в том, что эти методы сосредоточены на визуализации РНК или РНК и белка. Все реплицирующиеся клетки и многие вирусы имеют геном ДНК или образуют ДНК во время цикла репликации, что делает методы, способные визуализировать как РНК, так и ДНК, а также белок, очень желательными.
В протоколе MICDDRP мы выполняем bDNA FISH для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот с использованием метода RNAscope, с модификациями7. Одной из основных модификаций этого протокола является оптимизация обработки протеазой после химической фиксации. Лечение протеазой облегчает удаление белков, связанных с нуклеиновой кислотой, для повышения эффективности гибридизации зонда. Лечение протеазой сопровождается инкубацией с разветвленным олигонуклеотидным зондом (зонами). После применения зонда (зондов) бДНК образцы промывают и впоследствии инкубируют с предварительным усилителем сигнала и усилителем ДНК. Мультиплексированная гибридизация in situ (ISH), маркировка нескольких генных мишеней, требует целевых зондов с различными цветовыми каналами для спектральной дифференцировки7. Инкубация с усилителями ДНК сопровождается иммунофлуоресценцией (ИФ).
bDNA ISH обеспечивает улучшение сигнал-шум путем усиления сигналов, специфичных для цели, с уменьшением фонового шума от неспецифических событий гибридизации 7,11. Целевые зонды разрабатываются с использованием общедоступных программ, которые предсказывают вероятность неспецифических событий гибридизации, а также вычисляют температуру плавления (Т-м) гибрида зонд-мишень 7,11. Целевые зонды содержат 18-25-базовую область, комплементарную целевой последовательности ДНК / РНК, спейсерную последовательность и 14-базовую хвостовую последовательность. Пара целевых зондов, каждый с отдельной хвостовой последовательностью, гибридизируется с целевой областью (охватывающей ~ 50 оснований). Две хвостовые последовательности образуют сайт гибридизации для датчиков предварительного усилителя, которые содержат 20 сайтов связывания для датчиков усилителя, которые, кроме того, содержат 20 сайтов связывания для зонда метки. Например, область одного килобаза (кб) на молекуле нуклеиновой кислоты нацелена на 20 зондовых пар, создавая молекулярный каркас для последовательной гибридизации с предусилителем, усилителем и зондом метки. Таким образом, это может привести к теоретическому выходу 8000 флуоресцентных меток на молекулу нуклеиновой кислоты, что позволяет обнаруживать отдельные молекулы и значительно улучшать по сравнению с обычными подходамиFISH 7 (см. Рисунок 1A для схемы усиления сигнала бДНК). Чтобы настроить зонды для мультиплексированного ISH, каждый целевой зонд должен находиться в другом цветовом канале (C1, C2 или C3). Эти целевые зонды с различными цветовыми каналами имеют различные 14-базовые хвостовые последовательности. Эти хвостовые последовательности будут связывать различные усилители сигнала с различными флуоресцентными зондами, что позволит легкой спектральной дифференциации по нескольким мишеням. В представленном Протоколе, таблица 4 на этапе 9, содержит дополнительную информацию о флуоресцентной маркировке целевых зондов. Кроме того, на рисунках 2 и 3 приведены примеры того, как мы выбрали соответствующий усилитель 4-FL (A, B или C) (флуоресцентный зонд и заключительная стадия гибридизации) для достижения специфической флуоресцентной маркировки нескольких мишеней вирусных нуклеиновых кислот после инфекций ВИЧ-1 и HTLV-1.
Мы продемонстрировали несколько применений одновременной флуоресцентной визуализации РНК, ДНК и белков, наблюдая критические стадии репликации вируса с высоким пространственно-временным разрешением 3,4,5. Например, одновременная одноклеточная визуализация вирусной РНК, цитоплазматической и ядерной ДНК и белка позволила нам визуализировать ключевые события во время заражения ВИЧ-1, в том числе следование РНК, содержащей ядра в цитоплазме, до входа в ядер и интеграции провирусной ДНК3. Кроме того, мы применили MICDDRP для характеристики влияния факторов хозяина и медикаментозного лечения на вирусную инфекцию и репликацию 4,5. В Ukah et al. мы отслеживали реактивацию транскрипции ВИЧ-1 в моделях латентных клеток, обработанных различными агентами, реверсирующими латентность, для визуализации транскрипции ВИЧ и обращения латентности4. Кроме того, MICDDRP может позволить нам визуализировать фенотипические изменения, связанные с противовирусным ингибированием, приписываемые лечению малыми молекулами или ограничению фактора хозяина. В качестве доказательства концепции надежности и широкой применимости нашего подхода мы продемонстрировали, что мы можем использовать модификации нашего протокола для эффективной маркировки вирусной нуклеиновой кислоты для отслеживания инфекции не только вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)-1, но и человеческим Т-лимфотропным вирусом (HTLV)-1, вирусом гепатита В (HBV), вирусом гепатита С (HCV), Вирус Зика (ZIKV) и вирус гриппа А (IAV). Поскольку жизненный цикл ВИЧ-1 состоит как из вирусной ДНК, так и из видов РНК, мы выполнили большую часть нашей оптимизации MICDDRP после кинетики репликации ВИЧ-1. Однако, кроме того, мы продемонстрировали, что мы можем отслеживать синтез различных вирусных транскриптов РНК одной или обеих чувств (+) и антисмысловой (-) нити у вирусов, таких как ZIKV, IAV, HBV и HCV, для мониторинга вирусной транскрипции и репликации 3,4,5,6. Исследования направлены на улучшение механистического понимания нескольких вирусных процессов и служат руководством для реализации этой технологии флуоресцентной визуализации в широком спектре клеточных моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Семенные клетки (суспензия против адгезивных клеток) на обтекателях или слайдах камеры (в представленном протоколе используются чехлы).
- Посев суспензионных клеток
- Приготовьте покрытые поли-D-лизином (PDL) покровные листы (облегчает прилипание клеток суспензии к крышке), сначала инкубируя покровные листы в этаноле (EtOH) в течение 5 минут (стерилизует покровы и удаляет любые остатки). Затем промыть 2 раза в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) перед инкубацией крышки в PDL (20 мкг/мл) в течение 30 минут (мин) при комнатной температуре (RT).
- Удалите PDL и помойте 2x в PBS. Пеллетные клетки (ранее инфицированные/обработанные на основе желаемых условий визуализации) и повторное суспендирование 106клеток в 50 мкл PBS. Поместите 50 мкл клеток на стекло (с PDL-покрытием) и инкубируйте на RT в течение 30 мин.
- Посев адгезивных клеток
- Культивирование клеток на стерильном покрове помещают в 6-луночную посуду и заражают клетки вирусными частицами или обрабатывают интересующим соединением. Позвольте клеткам достичь 50-70% слияния до подготовки образца к экспериментам по визуализации.
2. Клеточная фиксация: сохранение клеточной морфологии для флуоресцентных исследований визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите 4% PFA и PBS на RT в течение не менее 30 минут до клеточной фиксации.
- Аспирируйте клеточную среду, промывайте клетки на покровных листах 3x в PBS и фиксируйте клетки в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 30 мин. Аспирировать PFA и промывные ячейки в PBS 2x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки теперь можно обезвоживать и хранить, если экспериментатор желает возобновить эксперимент в другую дату. Фиксированные клетки могут быть обезвожены в EtOH перед хранением.- Удалите PBS после промывки после клеточной фиксации и замените 500 мкл 50% EtOH (v/v в воде). Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Удалите 50% EtOH и замените 500 мкл 70% EtOH. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Удалите 70% EtOH и замените 500 мкл 100% EtOH. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Удалите 100% EtOH и замените свежим 100% EtOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоженные клетки могут храниться при -20 °C в течение 6 месяцев. Запечатывают пластины лентой или парапленкой перед хранением для предотвращения испарения EtOH. - Регидратировать клетки для перехода на мультиплексированную флуоресцентную маркировку клеток/вируса.
- Удалите 100% EtOH и замените 500 мкл 70% EtOH. Инкубировать на RT в течение 2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клеткам высыхать в любое время. Всегда используйте достаточное количество раствора, чтобы погрузить все клетки. - Удалите 70% EtOH и замените 500 мкл 50% EtOH. Инкубировать на RT в течение 2 мин.
- Удалите 50% EtOH и замените на 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте разбавление протеазы, зонды гибридизации и промывочный буфер до обработки протеазой (этап 4) и применения целевого зонда (этап 5). Конкретные инструкции по подготовке реагентов представлены в начале каждого соответствующего этапа.
| Реагентов | Другие примечания |
| Раствор протеазы | Подготовка в 1X PBS |
| Мишень олигонуклетодных зондов | Разбавление в буфере гибридизации |
| Буфер для стирки | Промывка после целевых этапов гибридизации |
| Буфер гибридизации | Рецепт представлен в таблице 3 |
Таблица 1: Ключевые реагенты в протоколе MICDDRP.
3. Пермеабилизация клеток: увеличивает доступ к клеткам и клеточным органеллам для проникновения крупных молекул (антител, зонды гибридизации нуклеиновых кислот)
- Удалите 1x PBS после клеточной фиксации или регидратации и замените 500 мкл 0,1% (v/v) Tween-20 в 1x PBS. Инкубировать в RT в течение 10 мин. Заменяйте один за другим. Вымойте один раз с 500 мкл 1x PBS и добавьте свежий 1x PBS.
4. Покровная иммобилизация на стеклянном слайде и лечение протеазой для удаления белков, связывающих нуклеиновые кислоты, из фиксированной вирусной / клеточной нуклеиновой кислоты для повышения эффективности гибридизации
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время клеточной пермеабилизации готовят раствор разбавленной протеазы III (см. особенности реагента в таблице материалов). Дайте протеазе достичь RT за 10 мин до пермеабилизации.
- Поместите небольшую каплю лака для ногтей на стерилизованную стеклянную горку. Высушите спину (сторону без клеточного слоя) и поместите край обшивки на каплю лака для ногтей, стороной с прилипшими клетками вверх. Добавьте несколько капель PBS на иммобилизованный покров, чтобы предотвратить высыхание.
- Нарисуйте круг (на расстоянии около 3 мм от крышки) по периметру крышки, теперь приклеенное к слайду с помощью гидрофобной барьерной ручки (водоотталкивающей ручки, которая удерживает реагенты локализованными на клетках).
- Разбавляют протеазу III в 1x PBS (100 мкл/крышка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию протеазы может потребоваться скорректировать в зависимости от различий в типах клеток, зондов или целевых нуклеиновых кислот с помощью эмпирической оптимизации (см. Обсуждение). Для наиболее эффективной маркировки РНК/ДНК в различных вирусных системах мы добились успеха со следующими разведениями, представленными в таблице 2 ниже, с разведениями в диапазоне от (1 до 2)-(от 1 до 15) (протеаза до 1x PBS).
| Зондовые мишени | Разведение протеазы в 1X PBS (от Protease III до 1X PBS) |
| ДНК/РНК ВИЧ-1 | от 1 до 5 |
| HTLV-1 ДНК/РНК | от 1 до 5 |
| HBV pgRNA и общая HBV РНК | от 1 до 15 |
| РНК IAV | от 1 до 15 |
| ЗИКВ РНК | 1 до 2 |
Таблица 2: Разведения протеазы III в PBS для гибридизации вирусных нуклеиновых кислот.
- Нанесите 1x PBS на крышку после иммобилизации и нанесите разбавленную протеазу III.
- Инкубировать в увлажненной духовке при 40 °C в течение 15 мин.
- Декант протеазного раствора и погружные слайды в 1x PBS. Перемешивать с помощью качающейся посуды в течение 2 мин на RT. Повторите мытье с новым 1x PBS.
- Только для обнаружения ДНК промывайте образцы три раза водой без нуклеазы в течение 2 мин каждая, а затем инкубируйте с 5 мг/мл РНКазы А, разведенной в PBS в течение 30 мин при 37 °C.
- Декантируйте раствор РНКазы А и промывайте 3 раза в течение 2 мин сверхчистой водой. Продолжайте использовать ISH целевого зонда (зондов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер гибридизации улучшает обнаружение vDNA, не влияя на эффективность окрашивания вРНК для представленных результатов (репрезентативные результаты). Разбавляйте зонды КАНАЛА ДНК 1 (C1) 1:1 с помощью гибридизационного зонда. Разбавляют РНК-зонды C2 и C3 в буфере гибридизации. Зонды C2 и C3, используемые в наших исследованиях визуализации, находятся в решениях 50X (1:50; целевой зонд для буфера гибридизации).
- Подготовьте буфер гибридизации в воде без нуклеазы, следуя приведенной ниже пошаговой процедуре:
- В пробирку объемом 15 мл добавляют 700 мкл нуклеазной свободной воды, 300 мкл 50% (масса/объем (мас./об.)) декстрана сульфата, 300 мкл 5 М NaCl, 125 мкл 200 мМ цитрата натрия (рН 6,2) и 375 мг (порошок) этиленкарбоната.
- Хорошо перемешайте, используя вихрь, чтобы растворить этиленкарбонат (убедитесь, что весь порошок растворен и прозрачный раствор).
- Добавьте 25 мкл 10% (объем/объем (v/v)) Tween-20 и достаточное количество воды без нуклеазы для получения 2,5 мл (2x раствора).
ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный рецепт буфера гибридизации можно найти в таблице 3 ниже. Раствор стабилен в течение недели. Обеспечьте достаточное перемешивание моющего средства Tween-20, соблюдая при этом осторожность, чтобы предотвратить пузырьки раствора.
| Реагент | Концентрация запасов | Дополнительные примечания |
| Вода без нуклеаз | Н.А. | |
| Декстран сульфат | 50% (с об.) | Очень вязкий |
| Хлорид натрия | 5 М | |
| Цитрат натрия (рН 6,2) | 200 мМ | Хранить при температуре 4 °C |
| Этиленкарбонат | Н.А. | Порошок |
| Анимация движения-20 | 10% (об/об) |
Таблица 3: Буферный перечень реагентов гибридизации.
5. Инкубация с помощью зондов гибридизации мишеней ДНК/РНК: целевые олигонуклеотидные зонды связываются с областью (областями) интереса, создавая молекулярный каркас для связывания предварительных усилителей, усилителей и флуоресцентных зондов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теплые днк/РНК-зонды при 40 °C в течение 10 мин (во время клеточной пермеабилизации) и охлаждаются до RT в течение не менее 10 мин, если лечение РНКазой не включено. Если обработка РНКазой или дальнейшая обработка образца необходима до гибридизации целевого зонда, нагревайте зонды соответственно. Спинные зонды C2 и C3 после нагревания и разбавляются в буфере гибридизации. После разбавления зонды C2 и C3 можно ненадолго нагревать. Нагревайте 50-кратный буфер для промывки (см. Таблицу материалов для более подробной информации) при 40 °C в течение 10-20 мин и разбавляйте до 1 раза в воде класса молекулярной биологии.
- Инкубировать 200 мкл буфера гибридизации при 67 °C в течение 10 мин перед добавлением гибридизационного зонда (зондов). Разбавление зонда в буфере гибридизации (рецепт приведен в таблице 2). Добавьте 50 мкл/крышку.
- Инкубировать в увлажненной печи при 40 °C в течение 2 часов (ч). Зонды деканта и погружные слайды в 1-кратный буфер промывки. Перемешивать, качая посуду в течение 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.
6. Гибридизация усилителя (Amp) 1-FL: добавление предварительного усилителя, который комплементарен хвостовой последовательности целевых днк/РНК-зондов (Шаг 5)
ПРИМЕЧАНИЕ: Усилители должны быть на RT перед использованием. Достаньте каждый отдельный усилитель из холодильника за 30 минут до использования и оставьте на скамейке в RT.
- Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Добавьте 1 каплю Amp 1-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной духовке при 40 °C в течение 30 мин.
- Декантный усилитель 1-FL и погружение в 1x буфер промывки. Перемешивать, качая посуду 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.
7. Amp 2-FL Гибридизация: инкубация с усилителем сигнала с родственной последовательностью распознавания с предварительными усилителями (Amp 1-FL)
- Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Добавьте 1 каплю Amp 2-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной печи при 40 °C в течение 15 мин.
- Декантный усилитель 2-FL и погружение в 1-кратный буфер промывки. Перемешивать, качая посуду 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.
8. Amp 3-FL гибридизация: инкубация со вторым усилителем сигнала
- Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Добавьте 1 каплю Amp 3-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной духовке при 40 °C в течение 30 мин.
- Декантный усилитель 3-FL и погружение в 1-кратный буфер промывки. Перемешивать, качая посуду 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья.
9. Гибридизация Amp 4-FL: флуоресцентная этикетка и конечная стадия гибридизации
ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, см. Таблицу 4, чтобы выбрать подходящий Amp 4 (A, B или C) - FL на основе каналов целевого зонда (зондов). Оцените, какой Amp 4-FL необходим для маркировки ДНК/ РНК, представляющей интерес. Пример приведен в таблице ниже:
| A | B | C | |
| Канал ДНК 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| Канал ДНК/РНК 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| Канал РНК 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Таблица 4: Выбор флуоресцентного зонда Amp 4 (A, B или C)-FL для мультиплексированного ISH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мультиплексированных FISH (несколько целей) выбор правильного усилителя 4 (A, B или C) - FL имеет решающее значение для правильной маркировки интересующей вас цели. Целевые зонды (шаг 5) имеют различные цветовые каналы (C1, C2 или C3), которые диктуют свою соответствующую флуоресцентную метку (Alexa 488, Atto 550 или Alexa 647) в зависимости от выбранного Amp 4-FL. Примеры выбора комбинаций флуорофоров для мультиплексированной визуализации приведены в условных обозначениях рисунков 2 и 3. В качестве дополнительного примера, выбор Amp 4B-FL будет избирательно маркировать зонды ДНК C1 с помощью Зондов Atto 550 и зондов РНК C3 с Alexa 647.
- Извлеките слайды из 1-кратного буфера для стирки и постучите/впитайте, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Добавьте 1 каплю Amp 4-FL на крышку. Инкубировать в увлажненной печи при 40 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: После шага 9.2 держите образцы закрытыми, защищенными от света. - Декантный усилитель 4-FL и погружение в 1x буфер промывки. Перемешивать, качая посуду в течение 2 мин на RT. Повторите промывку с новым 1x буфером для мытья. Вымойте с 1x PBS (2 мин) и храните в PBS.
10. Иммуноокрашивание белка: для маркировки белка (белков), представляющих интерес
- Декантируйте PBS и добавьте 200 мкл блокирующего буфера (1% мас./об BSA, 10% v/v FBS в PBS с 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) к крышке. Инкубировать 1 ч на РТ.
- Декант блокирует буфер и применяют 200 мкл первичного антитела, разведенного в ПБСТ + 1% мас./об.БСА. Инкубировать 1 ч на РТ.
- Дважды промыть горку ПБСТ в течение 10 мин при РТ с встряхиванием.
- Применяют вторичные антитела по выбору в течение 1 ч при РТ в ПБСТ + 1% мас./об.БСА.
- Промыть горку с ПБСТ в течение 10 мин при РТ с встряхиванием.
11. Ядерное окрашивание: ядра против окрашивания после иммуноокрашивания
- Декантировать PBST и наносить DAPI или ядерное пятно на выбор в течение 1 мин на RT.
- Дважды промойте горку PBS в течение 10 мин на RT с встряхиванием.
12. Монтаж
- Поместите 1 каплю антизатухретого раствора (например, Prolong Gold) на новый стерильный стеклянный слайд (сначала очистите слайд с EtOH и дайте высохнуть, чтобы убедиться, что на стекле нет остатков). С помощью этого же наконечника нанесите каплю антитеплевидного раствора, чтобы покрыть область размером примерно с крышку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антизатухающий раствор очень вязкий и может быть трудным для пипетки. Отрезание наконечника от наконечника объемом 200 мкл перед пипеткой может смягчить эти проблемы. - Снимите крышку с образцом клетки с слайда и погрузитесь в PBS, чтобы удалить остаточный лак для ногтей сзади с помощью щипцов и PBS. Сухие щипцы и задняя часть крышки с помощью Kimwipe.
- Аккуратно втирают крышку в каплю антизатухретого раствора, помещая образец сбоку (сторону с клеточным слоем) покровного слипа на каплю).
- Дайте образцам высохнуть в течение ночи.
13. Визуализация
- Изображение с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема MICDDRP изображена на рисунке 1. Маркировка ДНК и РНК сопровождается иммуноокрашиванием. Использование разветвленных усилителей увеличивает сигнал, позволяя обнаруживать молекулы одиночных нуклеиновых кислот.
Рисунок 1: Схема MICDDRP и пошаговый рабочий процесс. (A) сигнал бДНК усиливается с помощью разветвленных предусилителей и усилителей ДНК для улучшения обнаружения вирусной ДНК (1) и видов РНК (2). Олигонуклеотидные зонды гибридизуются парами (ZZ в схеме) с целью (целями), представляющей интерес, создавая каркас для предварительного усилителя (Amp 1-FL, шаг 6 в протоколе), усилителя (Amp 2- и 3-FL) и флуоресцентных зондов (Amp 4, Шаг 9 в протоколе). Обратитесь к таблице 4 для выбора подходящего усилителя 4 (A, B или C)-FL для мультиплексированного ISH. Маркировка нуклеиновой кислоты сопровождается иммуноокрашивающими белками, представляющими интерес (3). (B) Тринадцать основных шагов в протоколе MICDDRP с оценкой продолжительности времени для каждого соответствующего этапа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Применение MICDDRP для изучения течения инфекции ВИЧ-1 было полезным инструментом в отслеживании кинетики репликации вируса в первичных клетках. В качестве доказательства концепции этой процедуры ДНК, РНК и белок ВИЧ-1 одновременно маркируются и визуализируются микроскопически на уровне одной клетки (рисунок 2). Два генома ДНК ВИЧ-1 визуализируются в одной клетке, так как они активно транскрибируют вирусную РНК (вРНК). vRNA экспортируется через ядерный поровый комплекс, и вирусный белок синтезируется в цитоплазме.
Рисунок 2: MICDDRP первичных мононуклеарных клеток крови (PMBC), инфицированных ВИЧ-1. PMBC, инфицированные ВИЧ-1 (NL4.3) при множественности инфекции (MOI) 2. Клетки были зафиксированы через 48 часов после заражения (hpi). (A) Зонд FISH для ВИЧ-1 бДНК (обозначен ATTO 550; красный на рисунке). Этот зонд гибридизуется с шаблонной (3'<-5') цепью vDNA, чтобы предотвратить перекрестные помехи с смысловой (+) vRNA. (B) Нерасщепленная РНК ВИЧ-1 (помечена Alexa 647; зеленый цвет на рисунке). Зонд вРНК ВИЧ-1 гибридизуется с вирусными транскриптами, транскрибируемыми в ориентации 5'->3'. (C) Иммуноокрашивание белка капсида ВИЧ-1 (р24) (вторичное антитело, конъюгированное с Alexa 488; белое на рисунке). (D) Объединенное изображение. Шкала представляет собой 5 мкм. Ядра были окрашены DAPI (синий). Чтобы маркировать ДНК ВИЧ-1 (днк-зонд C1) с ATTO 550 и РНК ВИЧ-1 (зонд РНК C3) с Alexa 647 соответственно, образцы инкубировали с Amp 4-FL 'B' (см. Таблицу 4 в протоколе для выбора подходящих цветов каналов для зондов гибридизации). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Кроме того, мы выполнили двойное окрашивание вирусной ДНК (vDNA) и вРНК для отслеживания инфекции HTLV-1. Для оптимизации маркировки нуклеиновых кислот мы строго придерживались процедуры окрашивания вДНК/ВРНК, разработанной для мультиплексированной флуоресцентной визуализации ВИЧ-инфекции. Мы продемонстрировали, что мы можем специфически маркировать ДНК и РНК HTLV-1 одновременно.
Рисунок 3: Одновременная маркировка HTLV-1 vDNA и vRNA в клетках MT-2. (A) HTLV-1 vDNA (помечена ATTO 550; красным цветом на рисунке) (B) Несплитая HTLV-1 смысловая (+) РНК (зонд РНК C2 и помеченная Alexa 488; зеленая на рисунке)). (C) HTLV-1 HBZ антисмысловая (-) вРНК (РНК C3 зонд & (помечен Alexa 647; белый на рисунке)). (D) Объединенное изображение. Шкала представляет собой 20 мкм. Ядра были окрашены DAPI (синий). Amp 4-FL 'B' использовался (см. таблицу 4 в протоколе) для достижения мультиплексированной маркировки РНК HTLV-1 ('+' & '-'). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Контрольные эксперименты для оценки специфичности и фона целевого зонда. Специфичность целевых зондов ВИЧ-1 и HTLV-1 оценивалась после заражения лимфоцитарными клеточными линиями (неинфицированные Т-клетки Юрката, инфицированные клетки HTLV-1 (MT2) и ВИЧ-1-инфицированные клетки (H9111B)). Шкала баров представляет собой 10 мкм. (А) Клетки обрабатывали РНК-зондами HTLV-1. (B) Клетки обрабатывали зондом РНК ВИЧ-1 (+) (C-D). Дальнейшая демонстрация специфичности зондов HTLV-1 без перекрестной реактивности с ВИЧ-1. Белые стрелки на рисунке 4C обозначают ДНК HTLV-1 (красный). (Е-Ф). окрашивание вРНК (зеленый) +/- РНКаз-обработка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы проверить специфичность гибридизационных зондов и оценить, как метод маркировки ISH влияет на эффективность окрашивания белка и общий фон, мы проводим критический контроль, чтобы обеспечить высочайший уровень строгости и воспроизводимости для экспериментов. Например, на рисунке 4A-D мы проверяем специфичность наших зондов ВИЧ-1 и HTLV-1 vDNA и vRNA, поскольку мы показываем очень мало или вообще не показываем перекрестную реактивность между наборами зондов в двух вирусах. Несмотря на маркировку двух ретровирусов с потенциалом перекрестной реактивности зондов, зонды ВИЧ-1 специфичны только для генетического материала ВИЧ-1, а не HTLV-1. Та же тенденция справедлива и для зондов HTLV-1. Кроме того, на рисунке 4F мы показываем, что мы можем устранить окрашивание вРНК, если мы обработаем наши клетки RNase во время подготовки образца. Чтобы оценить возможность ослабления эффективности окрашивания белка из-за ISH (лечение протеазой (шаг 4 в протоколе и рисунок 1B) и условий гибридизации, которые могут привести к абляции распознавания эпитопов или увеличению фонового сигнала, мы демонстрируем, что эффективность окрашивания белка для маркера ядерного спекля sc-35 сопоставима с обычными подходами ПЧ и иммуноокрашиванием во время протокола MICDDRP. В обычном протоколе ПЧ клетки были проницаемы 0,1% Triton X-100 в течение 15 минут, а не пермеабилизацией с 0,1% Tween-20 в течение 10 минут, что используется в протоколе MICDDRP (шаг 3 в протоколе и рабочем процессе на рисунке 1B). Окрашивание белка в обоих условиях (IF против MICDDRP) производило сигнал на несколько порядков больше, чем контроль (MICDDRP без первичного антитела), дополнительно демонстрируя низкий фон, генерируемый в соответствии с этим протоколом, и сохранение белковых эпитопов для эффективного иммуноокрашивания. Количественное определение изображения средней интегральной интенсивности флуоресценции сигнала sc-35 на ячейку (фиг.5Е) выполняли так, как описано ранее3. Для всех показанных результатов визуализации мы обеспечили специфичность зонда и антител, а также оценили любые возможные возмущения или фоновый шум выше нормы, связанные с нашим подходом ISH.
Рисунок 5: Сравнение эффективности окрашивания белка после обычного ПЧ и MICDDRP. Клеточный белок sc-35, биомаркер ядерных пятен, был иммуноокрашен в Т-клетках Юрката. Все шкалы представляют собой 10 мкм. (A) Неинфицированные Т-клетки Jurkat прошли протокол MICDDRP и были обработаны зондами гибридизации ДНК / РНК ВИЧ-1, используемыми на рисунке 2 и рисунке 4 выше. Во время иммуноокрашивания первичное антитело не добавлялось. (B). Неинфицированные Т-клетки Юрката подверглись обычному ПЧ, маркировке sc-35 (белый). Клетки проницали 0,1% Тритоном Х-100 в течение 15 минут. (C). MICDDRP проводили на ВИЧ-инфицированных Т-клетках Юрката. vRNA помечена зеленым цветом, vDNA — красным, а sc-35 — белым. (D). Крупный план вРНК, вДНК и маркировки белка (sc-35) в ВИЧ-инфицированных клетках. (E) Количественная оценка среднего интегрированного флуоресцентного сигнала на клетку sc-35 в различных иммуноокрашивающих условиях. Ось Y находится на логарифмической шкале. Пунктирная линия представляет собой фоновый сигнал от неинфицированных клеток, которые прошли протокол MICDDRP, где не было добавлено первичное антитело. Нет существенной разницы в сигнале после MICDDRP по сравнению с обычным IF. Более 500 клеток были отобраны для количественной оценки для достижения соответствующего состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот метод также может быть применен для изучения РНК-вирусов, которые могут включать или не включать шаблоны ДНК для репликации вируса. Например, цепно-специфические зонды bDNA могут быть разработаны для мониторинга экспрессии чувственной (+) или антисмысловой (-) нитевой РНК и различных видов вРНК в таких вирусах, как HBV, HCV, IAV и ZIKV. Визуализация различных видов РНК в ходе инфекции может дать представление о кинетике репликации различных вирусных систем.
Следуя временному течению инфекции HBV, мы можем видеть, что количество прегеномной РНК HBV (pgRNA) и общей РНК HBV увеличивается в зависимости от времени. Кроме того, мы одновременно иммунопитали клеточный фактор хозяина, MOV10 (рисунок 6).
Рисунок 6: HBV. Временное течение HBV-инфекции клеток 3E8. Клетки были инфицированы 300 геномами HBV на клетку. Вирусная репликация показана в трех временных точках (24, 48 и 72 hpi). pgRNA (помечена ATTO 550; красная на рисунке), общая РНК HBV (помечена Alexa 647; зеленая на рисунке) и MOV10 (вторичное антитело, конъюгированное с Alexa 488; белое на рисунке). Ядра окрашиваются в DAPI синего цвета. Шкала на объединенных изображениях представляет собой 10 мкм. hpi, часов после заражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Визуализация была выполнена с помощью конфокальной микроскопии с использованием 60-кратного масляного иммерсионного объектива. Длины волн полосы возбуждения/излучения, используемые для обнаружения DAPI, Alexa 488, ATTO 550 и Alexa 647, были установлены на 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 и 647/655-705 нм соответственно (рисунок 7, рисунок 8 и рисунок 9).
Рисунок 7: Временное течение ВГС-инфекции клеток Huh-7.5.1. Клетки Huh-7.5.1 были инфицированы вирусом гепатита С (HCV) Jc1 / Gluc2A при MOI 0,5. В указанные промежутки времени клетки были зафиксированы и последовательно исследованы на наличие смысловой (+) вРНК, антисмысловой (-) вРНК и NS5A (белок HCV). Ядра окрашивали DAPI. Репрезентативные объединенные изображения из каждой точки времени, показывающие (+) РНК зеленым цветом (помечена Alexa 647), (-) РНК красным цветом (помечена Atto 555), NS5A белым (вторичный козий антимыший, конъюгированный с Alexa 488) и ядра синего цвета. Шкала брусков составляет 10 мкм. Нижние изображения представляют собой увеличенные вырезы из соответствующей временной точки. hpi, часы после заражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Специфическая для пряди bDNA FISH и иммуноокрашивание клеток A549, инфицированных вирусом гриппа A. Клетки A549, инфицированные вирусом PR8 Flu A, были зафиксированы и исследованы на наличие (A) РНК нуклеопротеина (NP) IAV (помеченного Alexa 488; зеленым на рисунке) и (B) полимеразного белка IAV (PB1) (вторичный козий антимышиный Atto 550; красный на рисунке), а ядра были окрашены DAPI (синий). (C) Объединенное изображение. Шкала представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Нитевидная bDNA FISH в клетках, инфицированных вирусом Зика (ZIKV). Клетки Vero были инфицированы ZIKV при MOI 0,1. Ячейки были зафиксированы на уровне 48 hpi. (A) Клетки были одновременно окрашены для смысловой (+) вРНК (помеченной Alexa 488; зеленый на рисунке) и антисмысловой (-) вРНК (помеченной Atto 550; красной на рисунке). Ядра окрашивали DAPI. В (A) белый квадрат обозначает область с (+) и (-) вРНК. Вставки представляют собой крупный план (+) вРНК (зеленый) и более редкий (-) вид вРНК (красный). (B) смысл (+) вРНК (зеленый). (C) антисмысловая (-) вРНК (красная). Шкала в (A) представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одновременная визуализация РНК, ДНК и белка часто требует обширной оптимизации. Двумя широко используемыми методами являются маркировка 5-этинил-2-дезоксиуридина (EdU) и ДНК FISH. Маркировка EdU была применена для визуализации вирусной ДНК и белка одновременно, поскольку EdU включен в зарождающуюся ДНК и впоследствии маркируется азидосодержащими флуоресцентными красителями с помощью химии щелчков. Таким образом, маркировка EdU может быть использована для мониторинга кинетики репликации нативных вирусов ДНК вирусов или вирусов с помощью шаблонов ДНК для репликации12. Недостатком маркировки EdU, однако, является то, что в делящихся клетках реплицирующийся геном будет включать EdU, создавая высокий фон и смешивая анализ изображений. DNA FISH может обойти эти проблемы, непосредственно гибридизируя зонд нуклеиновой кислоты с соответствующей мишенью независимо от клеточного цикла. Однако обычные FISH часто полагались на высокие температуры для достижения эффективной гибридизации зонда, препятствуя иммуноокрашиванию или даже одновременному окрашиванию РНК13. MICDDRP потенциально может обойти эти проблемы, обеспечивая надежную одновременную флуоресцентную маркировку ДНК, РНК и белка в различных клеточных системах.
Хотя мы продемонстрировали, что мы можем маркировать белок и нуклеиновую кислоту одновременно, используя наш протокол MICDDRP, оптимизация была необходима в разных системах. Первым важным параметром, который мы должны были оптимизировать, было лечение протеазой. Мы варьировали концентрацию протеазы III в зависимости от условий. Оптимизация лечения протеазами была эмпирической, так как мы использовали различные разведения для оценки того, что дало наибольшую эффективность гибридизации, без ущерба для эффективности иммуноокрашивания. Соответствующие контрольные меры проводились бок о бок для оценки специфичности зонда и изменений эффективности окрашивания белка, связанных с лечением протеазой. Следующими основными параметрами, которые нуждались в оптимизации, были конструкция зонда и гибридизация зонда.
Правильная конструкция датчиков захвата и усилителя имеет решающее значение для достижения чувствительности и специфичности технологии бДНК. Доступны программные пакеты, которые предсказывают вероятность неспецифических событий гибридизации для улучшения конструкции зонда 7,11. Датчики bDNA с сопутствующим предусилителем, усилителем и флуоресцентными датчиками теперь можно приобрести на коммерческой основе для обеспечения совместимости с комплектами изображений бДНК. Пользователи могут предоставить производителям информацию о последовательностях (~300-1000 пар оснований) для целевой области (областей) в виде файла fasta (текстовый формат для представления нуклеотидной последовательности). Целевые зонды генерируются с > 90% гомологии последовательности к поставляемой последовательности.
Для маркировки ДНК мы обнаружили, что разбавление зондов в буфере гибридизации, описанном на этапе 5 Протокола, улучшает гибридизацию ДНК. При маркировке как ДНК, так и РНК РНК-зонд может быть разбавлен в буфере гибридизации. Маркировка ДНК при отсутствии РНКазы не может исключать возможности того, что наблюдаемая нуклеиновая кислота включает РНК целевой цепкости. Температура также может быть скорректирована для повышения эффективности гибридизации. Повышение температуры может повлиять на эффективность окрашивания белка, так как повышение температуры может способствовать денатурации белка, абляции эпитопного распознавания первичного антитела. В представленных нами репрезентативных данных мы выполнили ISH при 40 °C.
По сравнению с обычной ДНК FISH, MICDDRP обеспечивает улучшенную процедуру одновременной маркировки ДНК, РНК и белка для визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии. Потенциальным ограничением является то, что выбор зонда может повлиять на эффективность гибридизации и способность количественно сравнивать данные между зондами. Этот протокол был эффективен в различных клеточных и вирусных системах в наших руках с незначительной оптимизацией, необходимой в различных условиях. Недавние громкие публикации использовали наш подход к изучению выбора сайта интеграции ВИЧ14 и кинетики обратной транскрипции ВИЧ15. Будущие применения MICDDRP могут включать визуализацию вирусных нуклеиновых кислот одновременно с последовательностями нуклеиновых кислот специфических клеточных генов и клеточных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана полностью или частично Национальными институтами здравоохранения (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 и U54 AI150472). Мы благодарим д-ра Раймонда Ф. Шинази и Сэди Амичай за предоставление клеток, инфицированных вирусом гриппа А.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
- Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
- Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
- Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
- Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
- Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
- Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
- Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
- Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
- Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
- Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
- Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
- Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).
