Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Derivatisering av Protein kristaller med I3C med hjälp av Random Microseed Matrix Screening

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61894
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2, 1
1School of Biological Sciences, The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences, The University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

Denna artikel presenterar en metod för att generera proteinkristaller derivatized med I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syra) med hjälp av microseeding att generera nya kristallisation villkor i gles matris skärmar. Brickorna kan ställas in med hjälp av flytande dispenseringsrobotar eller för hand.

Abstract

Proteinstruktur elucidation med hjälp av röntgenkristallografi kräver både hög kvalitet diffraktion kristaller och beräkningslösning av diffraktion fas problemet. Nya strukturer som saknar en lämplig homologimodell härleds ofta med tunga atomer för att ge experimentell fasinformation. Det presenterade protokollet genererar effektivt derivatized protein kristaller genom att kombinera slumpmässiga microseeding matris screening med derivatization med en tung atom molekyl I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalic syra). Genom att införliva I3C i kristallgitter, kan diffraktionsfasen problemet effektivt lösas med hjälp av enda våglängd anomala spridning (SAD) fasning. Den liksidiga triangel arrangemang av jod atomer i I3C möjliggör snabb validering av en korrekt avvikande substruktur. Detta protokoll kommer att vara användbart för att strukturella biologer som löser makromolekylära strukturer med hjälp av kristallografi-baserade tekniker med intresse för experimentell fasning.

Introduction

Inom området strukturbiologi betraktas röntgenkristallografi som guldstandardtekniken för att bestämma makromolekylers atomupplösningsstrukturer. Det har utnyttjats i stor utsträckning för att förstå den molekylära grunden för sjukdomar, vägleda rationella projekt drug design och belysa katalytisk mekanism av enzymer1,2. Även om strukturella data ger en mängd kunskap, kan processen för protein uttryck och rening, kristallisering och struktur bestämning vara extremt mödosam. Flera flaskhalsar är allmänt påträffade som hindrar utvecklingen av dessa projekt och detta måste åtgärdas för att effektivt effektivisera rörledningen för fastställande av kristallstruktur.

Efter rekombinant uttryck och rening, måste preliminära förhållanden som är befruktande till kristallisering identifieras som ofta är en mödosam och tidskrävande aspekt av röntgenkristallografi. Kommersiella glesa matris skärmar som konsolidera kända och publicerade villkor har utvecklats för att underlätta denna flaskhals3,4. Det är dock vanligt att generera några träffar från dessa första skärmar trots att använda mycket rena och koncentrerade proteinprover. Observera tydliga droppar indikerar att proteinet inte kan nå de nivåer av supersaturation som krävs för att nucleate en kristall. För att uppmuntra kristallkärnbildning och tillväxt kan frön som framställts av redan existerande kristaller läggas till villkoren och detta möjliggör ökad provtagning av kristalliseringsutrymmet. Ireton och Stoddard introducerade först mikroseed matrisscreeningmetoden5. Dålig kvalitet kristaller krossades för att göra ett fröbestånd och sedan läggas systematiskt till kristallisering villkor som innehåller olika salter för att generera nya diffraktion-kvalitet kristaller som annars inte skulle ha bildats. Denna teknik förbättrades ytterligare genom D'Arcy et al. som utvecklat slumpmässiga microseed matris screening (rMMS) i vilken frön infördes i en reservmatris kristallisation skärmen6,7. Detta förbättrade kvaliteten på kristaller och ökade antalet kristallisering träffar i genomsnitt med en faktor 7.

Efter att kristaller framgångsrikt framställts och man har fått ett röntgendiffraktionsmönster, stöter man på en annan flaskhals i form av att lösa 'fasproblemet'. Under datainsamlingsprocessen registreras intensiteten av diffraktion (proportionell mot kvadraten på amplituden) men fasinformationen går förlorad, vilket ger upphov till det fasproblem som stoppar omedelbar strukturbestämning8. Om målproteinet delar högsekvensidentitet till ett protein med en tidigare bestämd struktur kan molekylär ersättning användas för att uppskattafasinformationen 9,10,11,12. Även om denna metod är snabb och billig, kanske modellstrukturer inte är tillgängliga eller lämpliga. Framgången för den homologimodellbaserade molekylärersättningsmetoden sjunker avsevärt eftersom sekvensidentiteten faller under 35%13. I avsaknad av en lämplig homologimodell kan ab initio-metoder, såsom ARCIMBOLDO14,15 och AMPLE16, testas. Dessa metoder använder beräkningsmässigt förutsagda modeller eller fragment som utgångspunkter för molekylär ersättning. AMPLE, som använder förutsagda lockbete modeller som utgångspunkter, kämpar för att lösa strukturer av stora (> 100 rester) proteiner och proteiner som innehåller övervägande β-ark. ARCIMBOLDO, som försöker få plats med små fragment för att sträcka sig in i en större struktur, är begränsat till högupplösta data (≤2 Å) och av algoritmernas förmåga att expandera fragmenten till en fullstruktur.

Om molekylära ersättningsmetoder misslyckas måste direkta metoder som isomorfaersättning 17,18 och avvikande spridning vid en enda våglängd (SAD19) eller flera våglängder (MAD20) användas. Detta är ofta fallet för verkligt nya strukturer, där kristallen måste bildas eller härletts med en tung atom. Detta kan uppnås genom blötläggning eller co-kristallisering med en tung atom förening, kemisk modifiering (såsom 5-bromouracil införlivande i RNA) eller märkt proteinuttryck (såsom införlivar selenometionin eller selenocystein aminosyror i den primära strukturen)21,22. Detta komplicerar ytterligare kristalliseringsprocessen och kräver ytterligare screening och optimering.

En ny klass av fasning föreningar, inklusive I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic syra) och B3C (5-amino-2,4,6-tribromoisophthalic syra), erbjuder spännande fördelar jämfört med befintliga fasning föreningar23,24,25. Både I3C och B3C har en aromatisk ringställning med ett alternerande arrangemang av avvikande scatters som krävs för direktfasningsmetoder och amino- eller karboxylatfunktionella grupper som interagerar specifikt med proteinet och ger bindningsplatssegenskap. Den efterföljande liksidigt triangelformade arrangemang av heavy metal-grupper möjliggör förenklad validering av fasning underkonstruktion. I skrivande stund finns det 26 I3C-bundna strukturer i Protein Data Bank (PDB), varav 20 löstes med hjälp av SAD fasa26.

Detta protokoll förbättrar effekten av strukturen bestämning pipeline genom att kombinera metoderna för tungmetall härledning och rMMS screening att samtidigt öka antalet kristallisering träffar och förenkla kristall härledningsprocessen. Vi visade denna metod var extremt effektiv med hen äggvita lysozym och en domän av en roman lysin protein från bakteriofage P6827. Strukturlösning med hjälp av den högautomatiserade Auto-Rickshaw struktur bestämning pipeline beskrivs, särskilt anpassade för I3C fasning förening. Det finns andra automatiserade rörledningar som kan användas som AutoSol28, ELVES29 och CRANK230. Icke helt automatiserade paket som SHELXC/D/E kan också användas31,32,33. Denna metod är särskilt fördelaktig för forskare som studerar proteiner som saknar homologa modeller i det preliminära budget-talet, genom att avsevärt minska antalet screening- och optimeringssteg. En förutsättning för denna metod är proteinkristaller eller en kristallin fällning av målproteinet, som erhållits från tidigare kristalliseringsförsök.

Protocol

1. Försöksplanering och överväganden

  1. Använd redan existerande kristaller av proteinet av intresse, helst genereras genom ånga diffusion kristallisation. För ett generaliserat protokoll av vapor diffusion kristallisering, se Benvenuti och Mangani34. Andra metoder för kristallisation såsom microbatch under olja och fritt gränssnitt diffusion kommer att kräva skörd kristallerna före krossning för att generera microseeds.
  2. Vid beredning av ett fröbestånd, använd kristaller av högsta kvalitet som kan offras. Den högsta kvalitet kristall kan bedömas visuellt baserat på morfologi eller den bästa diffracting kristall kan väljas, om sådana uppgifter finns tillgängliga. Det är mycket troligt att ännu bättre kvalitet kristaller erhålls efter optimering genom sådd. I det fall där inga kristaller finns tillgängliga kan man använda kristallin fällning som sfäruliter och barr.
  3. Identifiera saltkristaller. Saltkristaller kan växa i kristalliseringsskärmar och kan se ut som proteinkristaller. Använda saltkristaller i rMMS kommer att ge någon nytta och kommer att slösa dyrbara prov, så det är viktigt att eliminera salt falska positiva.
    1. Saltkristaller är högljudda när de krossas. Kristaller måste krossas för att generera ett fröbestånd, så denna strategi är särskilt relevant. Om ett hörbart sprickljud hörs vid krossning av kristallerna, är kristallen sannolikt salt.
    2. Om proteinet innehåller tryptofan och tyrosin rester, använd ultraviolett fluorescensmikroskopi för att identifiera proteinkristaller som fluorescerande under dessa ljusförhållanden.
    3. Använd Izit färgämne (metylenblått) för att färga proteinkristaller för att skilja dem till saltkristaller som förblir relativt obefläckade. Emellertid, detta förfarande är mer destruktiva och rekommenderas endast om man har kristaller att avvara från replikat av samma droppe.
      OBS: Även om de tidigare nämnda testerna kan ge lovande resultat, kan saltkristaller fortfarande misstas för proteinkristaller. I detta fall kan diffraktionsexperiment användas för att slutgiltigt urskilja mellan ett protein och saltkristall.

2. Beredning av litium I3C-lager

  1. Mät upp 120 mg I3C (5-amino-2,4,6-triiodoisoftalic syra) till ett 1,5 mL mikrocentrifugrör.
  2. Lös upp I3C i 200 μL av 2 M litiumhydroxid. Lösningen kan försiktigt värmas upp med hjälp av ett värmeblock vid 40-60 °C för att uppmuntra till upplösning. Den resulterande litium I3C-lösningen ska vara brun och har en koncentration på 1 M.
    VAR FÖRSIKTIG: Litiumhydroxid är frätande. Skyddsglasögon, handskar och en labbrock ska bäras.
  3. Mät lösningens pH.Värde. Tillsätt vid behov små mängder 1 M saltsyra eller 2 M litiumhydroxid för att justera pH-värdet till mellan 7 och 8. Tillsätt milliQ vatten för att göra den slutliga lösningsvolymen till 400 μL. Koncentrationen av I3C-stamlösningen är 0,5 M.
    OBS: Steg 2.3 är valfritt. Lösningens pH-värde bör ligga mellan pH 7-8 före eventuell pH-justering. Detta steg bör utföras om proteinet av intresse påverkas starkt av pH. Protokollet kan pausas här. Litium I3C kan hållas i mörker vid 4 °C i minst två veckor35.

3. Tillsats av I3C till proteinstocken

  1. Metod 1
    1. Tillsätt lager litium I3C till en 150 μL alikvot av målproteinet. Den slutliga koncentrationen ska vara mellan 5-40 mM litium I3C.
  2. Metod 2 (skonsammare metod)
    1. Förbered en proteinutspädningsbuffert som matchar bufferten för målproteinet. Till denna utspädningsbuffert, tillsätt lager litium I3C för att ge en koncentration av litium I3C mellan 10-80 mM.
    2. Späd proteinet 1:1 med proteinutspädningsbuffert för att ge en slutlig koncentration av litium I3C mellan 5-40 mM.
      OBS: Vissa proteiner kommer att fällas ut vid kommna i kontakt med höga koncentrationer av litium I3C i metod 1, medan andra proteiner kan tolerera det. Metod 2 minskar sannolikheten för nederbörd. Denna metod halverar dock proteinkoncentrationen. För proteiner som inte har ett etablerat kristalliseringsprotokoll rekommenderas i allmänhet en proteinkoncentration på 10 mg/mL för inledande kristalliseringsscreening. En initial molar-kvot av I3C till protein av 8 rekommenderas. Proteinkoncentration och molarförhållande mellan I3C och protein kan optimeras efter den inledande skärmen.

4. Att göra ett fröbestånd

  1. Gör en rundad sond för krossning av kristaller.
    1. Med en Bunsenbrännare på den blå lågan värmer du en Pasteurpipett mot mitten. Med hjälp av en pincett drar du änden av Pasteur-pipetten för att dra ut den i en tunn diameter på mindre än 0,3 mm.
    2. När midsection är tunn nog, håll det segmentet i lågan för att separera pipetten på denna punkt och runt änden av pipetten för att avsluta glassonden.
      OBS: Rundade probkristallkrossar säljs av tredjepartsleverantörer. Dessa är ett alternativ till att göra rundade sonder.
  2. Placera fem 1,5 mL mikrocentrifugrör på is.
  3. Under ett ljusmikroskop, undersöka kristallisering facket för ett lämpligt tillstånd att generera mikrokristaller. Helst är bra morfologi stora kristaller utvalda. Denna teknik fungerar dock även med dåliga morfologikristaller, nålar, plattor, mikrokristaller och sfäruliter.
  4. Öppna upp kristallisering facket väl. För 96 väl kristallisering brickor förseglade med plast, använd en skalpell för att skära plast tätning brunnen. För hängande droppbrickor förseglade med fett kan täcket tas bort med hjälp av pincett och inverteras på en jämn yta.
  5. Överför 70 μL reservoarlösning till ett mikrocentrifugrör och kyl ner det på is. Till de andra mikrocentrifugrören, tillsätt 90 μL reservoarlösning och återgå till is till kyla.
    OBS: Om reservoaren inte har tillräckligt med volym eller inte existerar (när det gäller mikrobatch under olja), skapa kristallisationsbehållare genom att blanda lämpliga reagenser.
  6. Agitera kristallen i droppen med hjälp av kristallsonden för att grundligt krossa den. Kristallen måste krossas helt upp som kan övervakas under mikroskopet.
  7. Ta bort all vätska från droppen och överför den till mikrocentrifugröret med reservoarlösningen. Blanda och därefter ta 2 μL av blandningen från mikrocentrifugröret och lägg tillbaka den till brunnen. Skölj brunnen med lösningen och överför den till mikrocentrifugröret. Upprepa detta sköljsteg en gång till. Från denna punkt på, hålla mikrocentrifugröret kallt för att undvika att smälta mikrofederna i blandningen.
  8. Vortexa röret vid högsta hastighet vid 4 °C i 3 min, stoppa regelbundet för att kyla röret på is för att förhindra överhettning.
    OBS: Vissa mikroseeding protokoll lägga till en polytetrafluoreten utsäde pärla till mikrocentrifugröret till stöd kristall krossning7,36. Vi har använt tekniken utan användning av ett frö pärla med framgång, men ser inga problem med att utnyttja ett frö pärla att krossa upp kristaller.
  9. Gör en 1 i 10 serieutspädning av fröbeståndet genom att sekventiellt överföra 10 μL mellan de kylda reservoarlösningarna.
  10. Förvara frölager som inte kommer att användas omedelbart vid -80 °C.

5. Ställa in en rMMS-skärm

  1. Ställa in en 96 väl screening tallrik med hjälp av en flytande dispensering robot. I avsaknad av en robot kan även en flerkanalig pipett användas.
    1. Överför 75 μL från ett djupt brunnsblock till ett 96 brunnskristalliseringsbricka. Tillsätt 1 μL till kristallisationsdropin och 74 μL till reservoaren.
    2. Överför 1 μL protein kompletterat med litium I3C, tillverkad i steg 2, till kristallisationsdropp.
    3. Överför 0,1 μL fröbestånd till kristallisationsdropin.
    4. Täta plattan med klar tätningstejp och inkubera plattan vid en konstant temperatur för att möjliggöra kristalltillväxt.
  2. Ställa in en hängande drop skärmar
    1. Smörj kanterna på de hängande droppvältarna (hängande drop kristallisationsbrickor finns i 24 och 48 brunnsformat).
    2. Överför 500 μL kristalliseringslösning till reservoar.
    3. Nära mitten av ett glas täcka slide, placera en 1 μL droppe protein kompletterat med litium I3C, tillverkad i steg 2.
    4. Tillsätt 1 μL av kristalliseringslösningen till droppen.
    5. Överför 0,1 μL fröbestånd till kristallisationsdropin.
    6. Invertera täckglaset och täta kristalliseringen väl genom att trycka in kåpan i fettet.
    7. Inkubera plattan vid en konstant temperatur för att möjliggöra kristalltillväxt.
      OBS: Med nya och oprövade frölager rekommenderas att använda det mest koncentrerade fröbeståndet för att maximera chanserna att få kristallisationsträffar. Efterföljande förhållanden kan ställas in med minskad frökoncentration för att optimera antalet kristaller.
  3. Inspektera kristallbrickor under ett mikroskop regelbundet för kristalltillväxt. Om kristaller är av tillräcklig kvalitet kan de skördas för datainsamling. Kristaller kan också användas för att generera nya frö lager och nya rMMS skärmar för att möjliggöra iterativ optimering.

6. Insamling av uppgifter

  1. Skörda kristaller med hjälp av cryoloops, cryoprotect kristallerna och flash cool dem i flytande kväve. För ytterligare information om blixtkylningskristaller, se Teng37 och Garman och Mitchell38.
    1. Under kryoprotektionsstadiet, om kristallen förs genom en ny vattenlösning, kan I3C gå förlorad från kristallen på grund av att den leeching in i kryoprotektionslösningen. Använd litium I3C i kryoskyddslösningen vid en koncentration som matchar kristalliseringsvillkoret för att mildra detta.
    2. Kristaller som odlas med hjälp av detta protokoll har framgångsrikt varit cryoprotected med hjälp av Parabar 10312 oljebaserade cryoprotectant (Hampton Research).
      OBS: Protokollet kan pausas här medan kristaller förvaras i flytande kväve.
      FÖRSIKTIGHET: Flytande kväve kan orsaka kalla brännskador. Flytande kväve kan också orsaka kvävning om det används i slutna utrymmen.
  2. Montera kristallen på röntgenkällan goniometer och samla in diffraktionsdata med hjälp av det protokoll som är specifikt för röntgenkällan.
  3. Denna teknik bygger på avvikande signal från jodatomer i I3C. Välj således röntgenbildens energi för att maximera denna signal.
    1. Ställ in synkrotronröntgenkällor med avstämbara energier så låga som möjligt. För många makromolekylära kristallografi beamlines, den lägsta konfigurerbara energi är 8000 till 8500 eV.
    2. Det går inte att stäma av roterande anodröntgenkällor. Vanligt förekommande anodkällor med koppar har Kα-kanten vid 8046 eV, vilket ger en bra avvikande signal för jod (f" = 6,9 e). Anodkällor med krom har en Kα-kant vid 5415 eV, vilket ger en stor avvikande signal för jod (f" = 12,6 e).
  4. Strålningsskador är ett betydande problem under datainsamlingen eftersom det kommer att försämra den avvikande signalen39. Välj exponeringstid och dämpning av strålen för att uppnå bästa diffraktion samtidigt som stråldosen minimeras.
    OBS: I en liknande fasningsförening med jodatomerna ersatta med bromatomer har strålningsskador visat sig orsaka radiolys av kolbrobindningen och en minskning av beläggningen av bromatomer24.
    1. Använd inverse beam SAD-datainsamling som en insamlingsstrategi. Uppgifterna samlas in i kilar, med motsatta kilar som samlas in efter varandra. Detta gör att Friedel par kan samlas in med en ekvivalent dos, vilket resulterar i en förbättrad mätning av avvikande signal mindre påverkas av strålningsskador. Till exempel en åttakilsstrategi för att samla in 360° skulle innebära att samla in uppgifterna i storleksordningen kil 1 (0°-45°), kil 2 (180°-225°), kil 3 (46°-90°), kil 4 (225°), kil 4 (225°), kil 3 (46°-90°), kil 4 (225°), kil 4 (225°), kil 3-270°), kil 5 (90°-135°), kil 6 (270°-315°), kil 7 (135°-180°) och kil 8 (315°-360°).
      OBS: Kontinuerlig rotation är en alternativ insamling strategi till den av inverse beam datainsamling. För en nyligen genomförd jämförelse av insamlingsstrategierna, se Garcie-Bonte & Katona40.

7. Databehandling och strukturlösning

  1. Utför datareduktion på diffraktionsdata med hjälp av XDS41, med syfte att maximera avvikande signal. Dataminsknings indataparametrar är specifika för datauppsättningen och kan kräva vissa försök och misstag. Här är några rekommendationer att börja.
    1. Ställ IN FRIEDELS LAG=FALSE. Utför KORREKT två gånger, inställning STRICT_ABSORPTION_CORRECT = SANT och STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSKT. En körning kan ha en högre avvikande signal än den andra. Jämför avvikande signaler mellan körningarna med hjälp av "Anomal Corr" och "SigAno" discipliner i produktionen. Detta ger en indikator på datakvalitet.
    2. Kör SHELXC på XDS_ASCII. HKL fil för en mer exakt indikation av avvikande signal. "Ranom"-disciplinen kommer att ge en indikation på den avvikande signalen vid olika resolutioner.
  2. Kör POINTLESS42 och AIMLESS43 för att skala data. I AIMLESS, ställ in parametern ANOMALOUS ON. Om GUI:t används väljer du alternativet Separera avvikande par för avvisning avvikande och sammanslagning av statistik. Testa olika upplösning cutoffs kan krävas för att maximera avvikande signal.
  3. Lösa proteinstrukturen med hjälp av Auto-Rickshaw automatiserad kristallstruktur bestämning pipeline44. Auto-Rickshaw kommer att försöka lösa fas problemet och bygga kristallstrukturen av proteinet automatiskt med protein modellering och förfining programvara.
    1. För proteiner utan en homology modellmall, kör SAD-protokollet av Auto-Rickshaw i avancerat läge. Ange de parametrar som krävs.
      1. Välj PROTEIN som molekyltyp.
      2. Ange datainsamlingens våglängd i ångströms (Å).
      3. Välj "I" som underbyggnadselement för att indikera jodatomer användes.
      4. Välj "i3c" som understrukturtyp för att indikera att I3C var fasningsmolekylen.
      5. Välj "sub_direct" som bestämningsmetod för underkonstruktion. Denna metod använder SHELXD32 för att söka efter understrukturen.
      6. Välj "3" som antal förväntad understruktur per monomer.
      7. Ange "1" som upplösningen cutoff av understruktur sökning. Detta gör att Auto-Rickshaw automatiskt bestämma en lämplig upplösning cutoff.
      8. Ange antalet rester i en enda monomer, rymdgrupp av datauppsättningen, och antal molekyler i den asymmetriska enheten baserat på Matthews-koefficienten.
      9. Välj lämplig spridningsnivå för röntgendata som passar behoven. Välja "AutoRickshaw utvecklare" kommer att tillåta Auto-Rickshaw utvecklare att felsöka körningen om problem uppstår.
      10. Mata in avvikande data som en mtz-fil.
      11. Mata in proteinsekvensen som en seq- pir- eller txt-fil. En seq-fil kan genereras i en textredigerare (till exempel Anteckningar++9 på Windows eller nano i Linux). Skapa en ny fil, ange proteinens primära sekvens som en lång rad eller avgränsade med radbrytningar. Spara filen med filtillägget .seq.
      12. Ange en institutionell e-postadress.
  4. Resultat levereras via en webb-länk som skickas till den e-postadress som anges.
    OBS: AutoRickshaw är en automatiserad pipeline som åberopar olika kristallografi programpaket för att lösa en röntgenkristallstruktur32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Om Auto-Rickshaw-körningen inte lyckas lösa strukturen kan andra Auto-Rickshaw-inställningar testas. Strukturbestämningsmetoden kan ändras till "sub_phassade" för att använda Phaser59 istället för SHELXD32. Antalet förväntade substruktur per monomer kan också ökas eller minskas.
  5. Under den experimentella fasningen av kristallstrukturen kommer Auto-Rickshaw att försöka placera tunga atomer i enhetscellen, vilket skapar en understruktur. Den liksidiga triangel arrangemang av jodatomer i I3C presenterar ett effektivt sätt att validera understrukturen. Om steg 6.3 misslyckas, kan validering av understrukturen stöd i felsökning struktur lösning.
    1. Ladda ner listan över tunga atom platser från Auto-Rickshaw resultatsida. Det är en hyperlänk som kallas "tunga atom platser". Detta kommer att ladda ner en textfil med den tunga atomen platser.
    2. Ändra filtillägget för filen från .txt till .pdb.
    3. Öppna PDB-filen i Coot60. Slå på symmetri för att se andra tunga atomer från angränsande asymmetriska enheter.
    4. Mät avstånden mellan de tunga atomerna, inklusive över asymmetriska enheter. I3C kommer att visas som en liksidig triangel med en sidolängd på 6 ångström. Närvaron av en triangel med dessa dimensioner indikerar placeringarna av dessa tunga atomer är korrekta.

Representative Results

Införliva I3C i rMMS kan generera nya villkor som stöder härlett kristall tillväxt
Effekten av samtidig rMMS-screening och I3C-härledning visades i två proteiner, hönsäggvita lysozym (HEWL, erhållen som ett lyophilized pulver) och den förmodade Orf11 lysin N-terminal domänen (Orf11 NTD) från bakteriofag P68. Varje protein screenades mot PEG/ION HT under fyra olika förhållanden inklusive: oseedade, seedade, oseedade med I3C och seedade med I3C (Figur 1). För båda proteinerna ökade inte den enda tillsats av I3C antalet villkor som främjar kristallisering. När det gäller Orf11 NTD identifierades endast ett lämpligt tillstånd med och utan I3C (figur 1B). När I3C lades till PÅ HEWL-skärmarna minskades antalet träffar från 31 till 26, vilket framhävde den adderade komplexiteten i kristalliseringen när man införde fasningsföreningar (figur 1A). Överensstämmer med andra studier, lägga till utsäde till kommersiella gles matris skärmar för att generera en rMMS skärm avsevärt ökat antalet möjliga kristallisering villkor för båda proteinerna, vilket resulterar i en 2,1 och 6 faldig ökning för HEWL och Orf11 NTD, respektive6,61 (Figur 1). Viktigast av allt, samtidig tillsats av I3C och utsäde ökade antalet träffar i förhållande till en oseedad skärm, visar en 2,3 och 7 faldig ökning för HEWL och Orf11 NTD, respektive. Många av kristallerna från rMMS i närvaro av I3C visar utmärkt kristall morfologi (Figur 2).

Seedning möjliggör noggrann kontroll av kristallnummer i I3C rMMS-skärmar
I mikroseederande experiment kan antalet frön som förs in i en kristalliseringsprövning kontrolleras genom utspädning av fröbeståndet och detta möjliggör exakt kontroll av kärnbildning idroppen 7,36. Detta tillåter ofta större kristaller att bilda eftersom det finns minskad konkurrens av proteinmolekyler på kärnbildning platser. Denna fördel sträcker sig också till I3C-rMMS-metoden och har visats framgångsrikt i både HEWL och Orf11 NTD. Rekreation av en kristallisering tillstånd som identifierats från I3C-rMMS skärmen med en utspädd utsäde lager gav färre men större kristaller (Figur 3).

SAD-fasning kan användas för att lösa strukturerna från kristaller som härrör från RMMS I3C-skärm
Kristaller som odlas med hjälp av det utspädda fröbeståndet som visas i figur 3 användes för att lösa strukturen hos proteinerna med hjälp av SAD-fasning med hjälp av diffraktionsdata från en enda kristall (Figur 4). Data samlades in på australian Synchrotron MX1 beamline62. Detaljerade detaljer om datainsamling och strukturlösning beskrivs på andra ställen27.

Figure 1
Figur 1 - rMMS användes för att generera nya förutsättningar för kristalltillväxt i närvaro av I3C för två testproteiner. 96 väl ånga diffusion kristallisation skärmar utfördes med hjälp av kommersiella gles matris skärmar. (A) Hen äggvita lysozym testades med Index HT-skärmen. Brickor var seedade med HEWL kristaller odlas i 0,2 M ammoniumtartrat dibasic pH 7,0, 20% (w / v) polyetylenglykol 3350. (B) Orf11 NTD från bakteriofage P68 testades med PEG/ION-skärmen. Orf11 NTD brickor var seedade från kristaller från skick G12 från oseedade skärmen, visas i blått. Förhållanden som stöder kristalltillväxt visas i rött. rMMS seedning i närvaro och avsaknad av I3C båda gav betydligt mer kristall träffar än oseedade brickor. Figur anpassad från Truong et al.27. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2 - Representativa bilder av kristaller som odlas från de ångdiffusionsförsök som visas i figur 1 a och b. Figur anpassad från Truong et al.27. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3 - Utspädning av fröbeståndet är ett effektivt sätt att minska kärnbildning i en kristallisering tillstånd som finns med I3C-rMMS metod, för att kontrollera antalet kristaller som form. Att minska kärnbildning inom en droppe resulterar ofta i kristaller som växer till större dimensioner. Figur anpassad från Truong et al.27. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) och HEWL (PDB ID 6PBB) kristalliserades med hjälp av I3C-rMMS-metoden och löstes med hjälp av Auto-Rickshaw SAD-fasning. (A) Bandstrukturer av HEWL och Orf11 NTD löst genom experimentell fasning. (B) I3C-molekyl bunden till HEWL och Orf11 NTD. (C) Avvikande jodatomer i I3C är ordnade i en liksidig triangel av 6 Å. Således närvaron av denna triangel i fasning understrukturen indikerar att det finns en I3C molekyl i den positionen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

Strukturbestämning av ett nytt protein i avsaknad av en lämplig homologimodell för molekylär ersättning kräver experimentell fasning. Dessa metoder kräver införlivande av tunga atomer i proteinkristallen som lägger till en nivå av komplexitet till strukturen beslutsamhet rörledningen och kan införa ett flertal hinder som måste åtgärdas. Tunga atomer kan införlivas direkt i proteinet genom märkt uttryck med hjälp av selenometionin och selenocystein. Eftersom denna metod är kostsam, mödosam och kan resultera i lägre proteinutbyten uttrycks ofta märkt protein efter att kristalliseringsförhållanden har hittats och optimerats med omärkt protein. Alternativt kan kristaller härledas genom blötläggning i en lösning som innehåller tunga atomer22,63,64. Denna metod använder ofta högkvalitativa kristaller och utförs därför efter att en robust kristallisationsmetod redan har utvecklats. Framgångsrikt erhålla en härledas kristall med denna metod kräver ytterligare optimering av blötläggning förfaranden och screening av olika fasning föreningar, därför lägga mer tid till en redan mödosam process.

Co-kristallisering av proteinet med den tunga atomen kan utföras på screeningstadiet, och på så sätt effektivt effektivisera processen och minska kristallmanipuleringssteg som kan orsaka skada. Det finns dock fortfarande det potentiella scenariot att få få första kristallisation träffar och problemet med att välja en kompatibel tung atom förening. Många närvarande tillgängliga fasning föreningar är oförenliga med precipitants, buffertar och tillsatser som vanligen finns i kristallisering villkor. De kan vara olösliga i sulfat- och fosfatbuffertar, kelatera till citrat och acetat, reagera på ett ogynnsamt sätt med HEPES och Tris buffertar eller bli beslagsförlitna av DTT och β-merkaptoetanol21. Som I3C fasning förening inte lider av dessa inkompatibiliteter, Det är en robust fasning förening som kan vara mottagliga för många olika villkor.

I denna studie, en strömlinjeformad metod för att producera derivatized kristaller redo för SAD fasa genom samtidig co-kristallisering av I3C fasning förening och rMMS presenteras. Kombinationen av båda teknikerna ökar antalet kristallisering träffar, med många av de villkor som har förbättrad morfologi och diffraktion egenskaper. I både Orf11 NTD och HEWL testfall, nya villkor i skärmen I3C-rMMS identifierades som var frånvarande när I3C inte var närvarande. Potentiellt kan I3C binda positivt till proteinet, underlätta bildandet och stabilisering av kristallkontakter27. I sin tur kan detta framkalla kristallisering och eventuellt förbättra diffraktion egenskaper. Förutom att vara en förening kompatibel med gles matris skärmar, I3C är också en attraktiv fasning förening på grund av dess inneboende egenskaper. De funktionella grupper som växlar med jod på den aromatiska ringställningen möjliggör specifik bindning till proteiner. Detta leder till större beläggning och minskar potentiellt bakgrundssignal23. Arrangemanget av avvikande scatterers i en liksidig triangel är dessutom uppenbart i underkonstruktionen och kan användas för att snabbt validera bindning av I3C (Figur 4B och 4C). Slutligen kan det producera en anomal signal med avstämbar synkrotronstrålning samt krom och koppar roterande anod röntgenkällor. Det kan alltså tillämpas på många olika arbetsflöden. Eftersom I3C är allmänt tillgänglig och billig att köpa, är detta tillvägagångssätt inom räckhåll för de flesta laboratorier för strukturbiologi.

Det finns flera experimentella överväganden som måste åtgärdas när I3C-rMMS-metoden används. Denna metod kan inte tillämpas om initialt kristallint material av proteinet inte kan erhållas. I svåra fall kan man även använda kristallint material från ett homologt protein för att generera fröbestånd. Denna cross-seeding strategi för rMMS har visat några lovande resultat7. Optimera kristall nummer genom utspädning av fröet beståndet är ett avgörande steg, som inte bör förbises, för att maximera chansen att producera hög kvalitet stora kristaller och förvärva lämpliga diffraktion data. Om det finns få I3C-platser som identifieras i den asymmetriska enheten, bör förhållanden som främjar kristallisering optimeras ytterligare med en ökad koncentration av I3C. Detta kan öka beläggningen av I3C för att maximera den avvikande signalen och stöd kristall härledning.

Det kan finnas fall där denna teknik kanske inte är den optimala metoden att härleda proteinkristaller. Eftersom storleken på ett protein eller protein-komplex ökar, det begränsade antalet I3C platser på proteinytan kan inte ge tillräcklig fasning makt för att lösa strukturen. I dessa scenarier där proteinstorlek misstänks vara impeding fasning, selenometionin märkning av proteinet kan vara en mer livskraftig strategi för att fasa proteinet. Om proteinet har tillräckligt antal metioninrester i proteinet (rekommenderas att ha minst en metionin per 100 rester65) och hög effektivitet selenometion i ett protein kan uppnås (såsom i bakteriell uttryckssystem66), flera hög beläggning selen atomer kommer att finnas i kristallerna för att fasa strukturen.

Dessutom kan vissa proteiner i sig vara olämpliga för derivatisering med I3C. I3C bindningsställen på proteiner är beroende av proteinstruktur. Det kan finnas proteiner som naturligt har få exponerade plåster kompatibla med I3C-bindning. Således är det inte oförutsebart att det kan finnas svårigheter att co-kristallisera vissa målproteiner med I3C.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning genomfördes på MX1 beamline vid Australian Synchrotron, en del av ANSTO. Författarna vill tacka ledamöterna från laboratorierna Shearwin och Bruning för diskussioner om detta arbete. Författarna vill också erkänna Dr Santosh Panjikar och Dr Linda Whyatt-Shearwin som bidragit till det ursprungliga arbetet som banat väg för detta protokoll.

Följande finansiering erkänns: Australian Research Council (bidrag nr. DP150103009 och DP160101450 till Keith E. Shearwin); University of Adelaide (Australian Government Research Training Program stipendium stipendium till Jia Quyen Truong och Stephanie Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL disposable luer lock syringes Adelab Scientific T3SS10LAT Used for dispensing vacuum grease for hanging drop crystal tray wells
24 well tissue culture plate Sigma Aldrich CLS3527 Used for hanging drop crystal tray
3 inch wide Crystal Clear Sealing Tape Hampton Research HR4-506 For 96 well crystallization screens set up by robot
5-amino-2,4,6-triiodoisophthalic acid Alfa Aesar B22178 Commonly referred to as I3C in the article
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Original Hampton Research HR3-297 For 96 well crystallization screens set up by robot
Coverslips  Thermo Fisher Scientific 18X18-2 Coverslips for hanging drop crystal tray wells
Dow Corning vacuum grease Hampton Research HR3-510 Used for sealing hanging drop crystal tray wells
Eppendorf Pipette 0.1 μL-2.5 μL Eppendorf 3120000011
Gilson Pipette 2 μL-20 μL John Morris Group 1153247
Gilson Pipette 20 μL-200 μL John Morris Group 1152006
Glass pasteur pipettes Adelab Scientific HIR92601.01
Hen Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Approximately 95% pure
IndexHT screen Hampton Research HR2-134
Microscope illuminator Meiji Techno FT192/230 Light source to illuminate crystallography experiments
PEG/ION HT screen Hampton Research HR2-139
Phoenix Liquid Dispenser Art Robbins Instruments 602-0001-10
Scalpel with scalpel blade no. 15 Adelab Scientific LV-SMSCPO15
Seed bead kit Hampton Research HR2-320 Kit contains a glass probe for crushing crystals. A PTFE seed bead, designed for crushing crystals, is also part of the kit but not used in this protocol.
Stereo microscope  Meiji Techno EMZ-5TR Microscope for visualising crystallography experiments
Tweezers Sigma-Aldrich T5415
Vortex mixer Adelab Scientific RAVM1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zheng, H., Hou, J., Zimmerman, M. D., Wlodawer, A., Minor, W. The future of crystallography in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 9 (2), 125-137 (2014).
  2. Oakley, A. J., Wilce, M. C. J. Macromolecular crystallography as a tool for investigating drug, enzyme and receptor interactions. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 27 (3), 145-151 (2000).
  3. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling. A screening method for crystallization of proteins. Journal of Applied Crystallography. 24, pt 4 409-411 (1991).
  4. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- To medium-sized academic laboratories: The PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1426-1431 (2005).
  5. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  6. D'Arcy, A., Villard, F., Marsh, M. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (4), 550-554 (2007).
  7. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  8. Taylor, G. The phase problem. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (11), 1881-1890 (2003).
  9. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A. 46 (2), 73-82 (1990).
  10. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  11. Millán, C., Jiménez, E., Schuster, A., Diederichs, K., Usón, I. ALIXE: a phase-combination tool for fragment-based molecular replacement. Acta Crystallographica Section D. 76 (3), 209-220 (2020).
  12. Liebschner, D., et al. Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: Recent developments in Phenix. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, 861-877 (2019).
  13. Abergel, C. Molecular replacement: Tricks and treats. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (11), 2167-2173 (2013).
  14. Pröpper, K., et al. Structure solution of DNA-binding proteins and complexes with ARCIMBOLDO libraries. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (6), 1743-1757 (2014).
  15. Rodríguez, D. D., et al. Crystallographic ab initio protein structure solution below atomic resolution. Nature Methods. 6 (9), 651-653 (2009).
  16. Bibby, J., Keegan, R. M., Mayans, O., Winn, M. D., Rigden, D. J. AMPLE: A cluster-and-truncate approach to solve the crystal structures of small proteins using rapidly computed ab initio models. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (12), 1622-1631 (2012).
  17. Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method. Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287-307 (1954).
  18. Blow, D. M., Rossmann, M. G. The single isomorphous replacement method. Acta Crystallographica. 14 (11), 1195-1202 (1961).
  19. Wang, B. C. Resolution of phase ambiguity in macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 115, 90-112 (1985).
  20. Hendrickson, W. A. Determination of macromolecular structures from anomalous diffraction of synchrotron radiation. Science. 254 (5028), 51-58 (1991).
  21. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).
  22. Dauter, Z., Dauter, M., Rajashankar, K. R. Novel approach to phasing proteins: Derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (2), 232-237 (2000).
  23. Beck, T., Krasauskas, A., Gruene, T., Sheldrick, G. M. A magic triangle for experimental phasing of macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (11), 1179-1182 (2008).
  24. Beck, T., Gruene, T., Sheldrick, G. M. The magic triangle goes MAD: Experimental phasing with a bromine derivative. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 374-380 (2010).
  25. Beck, T., Da Cunha, C. E., Sheldrick, G. M. How to get the magic triangle and the MAD triangle into your protein crystal. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (10), 1068-1070 (2009).
  26. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. , (2000).
  27. Truong, J. Q., Panjikar, S., Shearwin-Whyatt, L., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Combining random microseed matrix screening and the magic triangle for the efficient structure solution of a potential lysin from bacteriophage P68. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (7), 670-681 (2019).
  28. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: The PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 582-601 (2009).
  29. Holton, J., Alber, T. Automated protein crystal structure determination using ELVES. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (6), 1537-1542 (2004).
  30. Skubák, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nature Communications. 4, (2013).
  31. Sheldrick, G. M. Crystal structure refinement with SHELXL. Acta Crystallographica Section C: Structural Chemistry. 71, 3-8 (2015).
  32. Schneider, T. R., Sheldrick, G. M. Substructure solution with SHELXD. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (10), 1772-1779 (2002).
  33. Sheldrick, G. M. Macromolecular phasing with SHELXE. Zeitschrift fur Kristallographie. 217 (12), 644-650 (2002).
  34. Benvenuti, M., Mangani, S. Crystallization of soluble proteins in vapor diffusion for x-ray crystallography. Nature Protocols. , (2007).
  35. Beck, T. Sticky triangles New tools for experimental phasing of biological macromolecules. , (2010).
  36. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  37. Teng, T. -Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29, 584-587 (1996).
  39. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (4), 907-911 (2019).
  40. Garcia-Bonete, M. J., Katona, G. Bayesian machine learning improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 75, 851-860 (2019).
  41. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  44. Panjikar, S., Parthasarathy, V., Lamzin, V. S., Weiss, M. S., Tucker, P. A. Auto-Rickshaw: An automated crystal structure determination platform as an efficient tool for the validation of an X-ray diffraction experiment. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (4), 449-457 (2005).
  45. Jones, T. A., Thirup, S. Using known substructures in protein model building and crystallography. The EMBO journal. 5 (4), 819-822 (1986).
  46. Kleywegt, G. J., Jones, T. A. Template convolution to enhance or detect structural features in macromolecular electron-density maps. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 53 (2), 179-185 (1997).
  47. Perrakis, A., Morris, R., Lamzin, V. S. Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nature Structural Biology. 6 (5), 458-463 (1999).
  48. Morris, R. J., et al. Breaking good resolutions with ARP/wARP. Journal of Synchrotron Radiation. 11 (1), 56-59 (2004).
  49. Yao, D. Q., et al. SAD phasing by OASIS-2004: Case studies of dual-space fragment extension. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 883-890 (2006).
  50. Hao, Q. ABS: A program to determine absolute configuration and evaluate anomalous scatterer substructure. Journal of Applied Crystallography. 37 (3), 498-499 (2004).
  51. Collaborative Computational Project Number 4. The CCP4 suite: Programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 50 (5), 760-763 (1994).
  52. Sheldrick, G. M., Hauptman, H. A., Weeks, C. M., Miller, R., Usón, I. Ab initio phasing. International Tables for Crystallography. , 333-345 (2006).
  53. Smith, G. D. Matching selenium-atom peak positions with a different hand or origin. Journal of Applied Crystallography. 35 (3), 368-370 (2002).
  54. Pannu, N. S., McCoy, A. J., Read, R. J. Application of the complex multivariate normal distribution to crystallographic methods with insights into multiple isomorphous replacement phasing. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (10), 1801-1808 (2003).
  55. Pannu, N. S., Read, R. J. The application of multivariate statistical techniques improves single-wavelength anomalous diffraction phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 60 (1), 22-27 (2004).
  56. De La Fortelle, E., Bricogne, G. Maximum-likelihood heavy-atom parameter refinement for multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods in Enzymology. 276, 472-494 (1997).
  57. Cowtan, K. Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein. Crystallography. 31, 34-38 (1994).
  58. Terwilliger, T. C. Maximum-likelihood density modification. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 56 (8), 965-972 (2000).
  59. Read, R. J., McCoy, A. J. Maximum-likelihood determination of anomalous substructures. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2018).
  60. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  61. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. Journal of visualized experiments JoVE. (78), e50548 (2013).
  62. McPhillips, T. M., et al. Blu-Ice and the distributed control system: Software for data acquisition and instrument control at macromolecular crystallography beamlines. Journal of Synchrotron Radiation. 9 (6), 401-406 (2002).
  63. Nagem, R. A. P., Polikarpov, I., Dauter, Z. Phasing on Rapidly Soaked Ions. Methods in Enzymology. 374, 120-137 (2003).
  64. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  65. Hendrickson, W. A., Ogata, C. M. Phase determination from multiwavelength anomalous diffraction measurements. Methods in Enzymology. 276, 494-523 (1997).
  66. Doublié, S. Production of Selenomethionyl Proteins in Prokaryotic and Eukaryotic Expression Systems. Macromolecular Crystallography Protocols. Methods in Molecular Biology. , 91-108 (2007).

Tags

Biokemi seedning slumpmässig mikroseed matris screening rMMS proteinkristallografi fasning Magic Triangle I3C
Derivatisering av Protein kristaller med I3C med hjälp av Random Microseed Matrix Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning,… More

Truong, J. Q., Nguyen, S., Bruning, J. B., Shearwin, K. E. Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (167), e61894, doi:10.3791/61894 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter