Derivatización de cristales proteicos con I3C mediante el cribado de matriz de microsemalla aleatoria
16 de enero de 2021
Este artículo presenta un método para generar cristales proteicos derivados con I3C (5-amino-2,4,6-ácido triiodoisophtalico) utilizando microsedizaciones para generar nuevas condiciones de cristalización en pantallas de matriz dispersas. Las bandejas se pueden configurar con robots dispensadores de líquidos o a mano.
Este es un protocolo de cristalización diseñado para optimizar el crecimiento de un cristal de proteína al mismo tiempo que se deriva la proteína con una molécula de fase para determinar la estructura de una proteína mediante cristalografía de rayos X. Para determinar la estructura de cristal de rayos X de una proteína completamente novedosa, las condiciones de cristalización están optimizadas para producir cristales de calidad. En el caso de una proteína completamente novedosa, los átomos pesados necesitan ser introducidos en el cristal para producir un cristal derivado.
Los datos de difracción de rayos X se recopilan del cristal derivado y deben resolverse computacionalmente para producir una estructura de cristal de rayos X. La cristalización y la desrivitización son procesos laboriosos. Para hacer frente a estos cuellos de botella, hemos ideado un procedimiento de cribado optimizado que simultáneamente logra ambos objetivos.
Este protocolo utiliza una técnica previamente desarrollada conocida como cribado aleatorio de matriz de microselécticas. Cristales o precipitado cristalino se tritura en microsempresas que se pueden utilizar para iniciar el crecimiento de cristal en condiciones completamente independientes. Al mismo tiempo, introducimos una molécula de fase llamada I3C en la condición de cristalización.
Esta molécula proporciona una gran señal anómala que permite que la estructura se resuelva mediante una sola fase de discusión anómala de longitud de onda. Para los usuarios que no están familiarizados con el tamaño experimental de las estructuras de cristal, presentamos una canalización de software fácil de usar para automatizar parcialmente la solución de estructura a medida para utilizar la señal anómala de I3C. El primer paso es crear un stock I3C.
Mida 120 miligramos de I3C en un tubo de microcentrífuga. Añadir 200 microlitros de dos molares de hidróxido de litio al tubo de microcentrífuga. Calentar el tubo a 40 a 60 grados y el vórtice se puede utilizar para fomentar la disolución.
El stock molar de solución de litio I3C debe ser marrón. Se pueden utilizar dos métodos para introducir I3C en el stock de proteínas. El litio I3C se puede añadir directamente al stock de proteínas.
Se pueden añadir 3,75 microlitros a 30 microlitros de I3C a 150 microlitros de proteína para dar una concentración de entre cinco y 14 milimolares. Algunas proteínas pueden precipitarse al contacto con altas concentraciones de I3C. En estos casos, el litio I3C se puede añadir a un tampón de dilución de proteína que es tampón que coincide con la proteína de la muestra a una concentración final entre 10 a 80 mililitros.
Añadir 150 microlitros del tampón de dilución de proteínas a 150 microlitros de muestra de proteína. Una sonda de vidrio para aplastar cristales está hecha de una pipeta Pasteur de vidrio. Con un quemador Bunsen en la llama azul, calienta la pipeta Pasteur hacia el medio.
Con un par de pinzas, tire de los extremos de la pipeta Pasteur hacia fuera en un diámetro delgado de menos de 0,3 milímetros. Sostenga ese segmento en la llama para separar la pipeta en este punto y alrededor del extremo de la pipeta para terminar la sonda de vidrio. Este es un ejemplo de cómo debe verse la pipeta de vidrio.
Los trituradores de cristal también se pueden pedir a proveedores externos como alternativa a hacer que su propia población de microselémiles A se genere triturando cristales de proteína o precipitado cristalino. Coloque cinco tubos de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo. Bajo un microscopio de luz, seleccione los mejores cristales morfológicos o precipitados cristalinos que se pueden sacrificar.
Para 96 bandejas de cristalización de pozos abrir el pozo mediante el corte de la cinta de sellado de plástico. Para las bandejas colgantes, el resbalón de la cubierta se puede quitar con pinzas e invertirse en una superficie plana. Transfiera 70 microlitros de solución de depósito a uno de los tubos de microcentrífuga y escalfa sobre hielo.
A los tubos restantes, transfiera 90 microlitros de solución de depósito a él y vuelva al hielo para enfriar. Si el volumen de depósito insuficiente está presente, el depósito de cristalización se puede hacer mezclando los reactivos apropiados y se puede utilizar en su lugar. Agitar los cristales en la gota de cristalización usando la sonda de vidrio aplastarlo a fondo.
El progreso se puede monitorear bajo el microscopio hasta que no se puedan ver cristales ni material cristalino. Transfiera todo el líquido de la gota al tubo de microcentrífuga que contiene 70 microlitros de solución de depósito. Mezclar en pipeteando arriba y abajo.
Transfiera de dos a tres microlitros de mezcla de vuelta al pozo y enjuague el pozo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la mezcla de nuevo al tubo de microcentrífuga. Este paso de enjuague debe repetirse una vez más.
El tubo de microcentrífuga debe mantenerse frío desde este punto hacia adelante para evitar la fusión de las microsedas. Vórtice el tubo a una velocidad máxima a cuatro grados durante unos tres minutos enfriando el tubo sobre hielo regularmente para evitar el sobrecalentamiento. hacer una de cada 10 diluciones en serie del stock de semillas mediante la transferencia secuencial de 10 microlitros entre las soluciones de depósito refrigerado.
Entre las diluciones de stock de semillas, el tubo debe ser vórtice. Las existencias de semillas que no se utilizarán inmediatamente, deben almacenarse en un congelador ultra frío de menos 80 grados. Se puede configurar una pantalla de matriz de microselédigo al azar de 96 años utilizando un robot dispensador de líquidos.
Coloque el stock de semillas, la solución de proteína suplementada con I3C y la pantalla de cristalización en el robot. Usando el robot transfiera 75 microlitros de la pantalla de cristalización a la bandeja de 96 pozos. Agregue un microlitro a la gota de cristalización y 74 microlitros al depósito.
Transfiera un microlitro de proteína suplementado con I3C a la gota de cristalización. Transfiera 0,1 microlitros de stock de semillas a la caída de cristalización. Selle la placa con cinta adhesiva.
Las pantallas colgantes se pueden configurar en 24 bandejas de cristalización de gotas colgantes. Engrase los bordes de los pozos colgantes. Transfiera 500 microlitros de solución de cristalización al depósito.
Cerca del centro de una corredera de cubierta de vidrio coloque una gota de microlitrotro de solución de cristalización. A esta gota, añadir un microlitro de proteína suplementado con litio I3C y 0,1 microlitros de stock de semillas. Invierta la corredera de la cubierta y selle bien la cristalización empujando el portaobjetos de la cubierta en la grasa.
Las bandejas colgantes de caída y sellado se incuban a una temperatura constante para permitir la formación de cristales. Deben ser inspeccionados regularmente bajo un microscopio para el crecimiento de cristales. Una vez obtenidos, integrados y escalados los datos de difracción como se explica en el protocolo escrito acompañado, la tubería de determinación automatizada de la estructura cristalina Auto-Rickshaw se puede utilizar para resolver el problema de fase y modelar la proteína.
En la página de destino de Auto-Rickshaw, haga clic en el botón proceder. Ingrese su correo electrónico institucional en el formulario web de Auto-Rickshaw y haga clic en continuar con la ejecución de Auto-Rickshaw. Para proteínas sin una plantilla de moto homología ejecutar el protocolo SAD de Auto-Rickshaw en modo avanzado.
Introduzca los parámetros necesarios. Seleccione la proteína como el tipo de molécula. Introduzca la longitud de onda de recopilación de datos en angstroms.
Así como yo como elemento de subestructura para indicar que se utilizaron átomos de yodo. Seleccione el tipo de subestructura I3C para indicar que I3C era la molécula de fase. Seleccione sub_direct como método de determinación de subestructuras.
Seleccione tres como el número de subestructuras esperadas por monómero. Introduzca uno como límite de reserva de búsqueda de subestructuras. Esto permite que Auto-Rickshaw determine automáticamente un límite de resolución adecuado.
Introduzca el número de residuos en un solo monómero, grupo espacial del conjunto de datos y número de moléculas en la unidad asimétrica en función del coeficiente Matthews. Seleccione el nivel de difusión adecuado de los datos de rayos X que se adapte a sus necesidades. Introduzca los datos anómalos como un archivo de conjunto vacío.
Introduzca la secuencia de proteínas como un archivo SEQ, PIR o TXT. Introduzca su dirección de correo electrónico institucional. Los resultados se le entregan a través de un enlace web enviado a la dirección de correo electrónico proporcionada.
Si Auto-Rickshaw no resuelve la estructura utilizando su subestructura determinada que valida la subestructura podría ayudar a solucionar la solución de estructura. Descargue la lista de sitios de átomos pesados desde la página de resultados de Auto-Rickshaw. Es un hipervínculo llamado sitios de átomos pesados.
Esto descargará un archivo de texto con los sitios de átomos pesados. Cambie la extensión de archivo del archivo de txt a pdb. Abra el archivo pdb en Coot.
Active la simetría para ver todos los átomos pesados de las unidades asimétricas vecinas. Mida las distancias entre los átomos pesados, incluso a través de unidades asimétricas. I3C aparecerá como un triángulo equilátero con una longitud lateral de seis angstroms.
La presencia de un triángulo con estas dimensiones indica que las ubicaciones de esos átomos pesados son correctas. Si la subestructura de ejecución de Auto-Rickshaw es incorrecta, se pueden probar otras configuraciones de Auto-Rickshaw como se describe en el protocolo escrito. El método I3C RMMS se probó en dos proteínas, la lysozyme de clara de huevo de gallina utilizando la pantalla en HT de Hampton Research y el dominio de la proteína de lisina Orf11 de bacteriófago P68.
Se configuraron pantallas completas para cada proteína correspondiente a la pantalla de control sin I3C o microsedas, pantalla con microsema agregó, pantalla con I3C, y finalmente la pantalla con I3C y microsemedor. Añadir I3C a una pantalla de cristal no parece aumentar el número de golpes de cristalización. Con la lysozime de clara de huevo de gallina, el número de condiciones disminuyó de 31 a 26.
Con el dominio Orf11 se encontró una sola condición de acierto en la pantalla de control. La adición de I3C a la pantalla también dio un solo golpe en las mismas condiciones. La adición de microsemedros al pozo dio lugar a un aumento significativo en el número de condiciones de impacto, lo que resultó en un aumento de 2,1 y seis veces para la lysozime de clara de huevo de gallina y el dominio Orf11 respectivamente.
Este resultado es consistente con otros estudios que prueban RMMS. Lo más importante, la adición de I3C y microsema a una pantalla también aumentó el número de condiciones de impacto en relación con la pantalla de control que demuestra un aumento de 2,3 y siete veces para la lysozyme de clara de huevo de gallina y el dominio Orf11 respectivamente. Esto demuestra que el método I3C RMMS puede producir eficientemente nuevas condiciones para cristales derivados.
Los cristales de estas condiciones podrían ser cosechados y utilizados para resolver la estructura cristalina. Tanto la estructura del dominio de la lesozima de la clara de huevo de gallina Orf11 podría resolverse con la fase SAD en el gasoducto Auto-Rickshaw, utilizando la señal anómala de I3C que demuestra la derivitización exitosa por la pantalla I3C RMMS. Hemos presentado un protocolo simple y eficiente para producir cristales de alta calidad derivados con la molécula de fase I3C.
Minimiza el número de pantallas y pasos de manejo cristalino, y por lo tanto es de particular interés para los biólogos estructurales que estudian proteínas novedosas. Recomendamos encarecidamente optimizar el tamaño del cristal probando diferentes diluciones de stock de semillas que se hicieron durante la preparación del stock de semillas. Y este paso se completa después de que se hayan realizado las pantallas iniciales.
I3C está ampliamente disponible y es barato de comprar y por lo tanto creemos que este método está al alcance de la mayoría de los laboratorios de biología estructural.
Visión general
Este artículo presenta un protocolo de cristalización que optimiza el crecimiento de cristales de proteínas mientras los derivatiza con I3C para cristalografía de rayos X. El método emplea un cribado de matriz de microsíembras aleatorias para mejorar las condiciones de cristalización.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Cristalización de proteínas
- Cristalografía de rayos X
- Biología estructural
Fundamentos
- La cristalización es esencial para determinar las estructuras de proteínas.
- La derivatización con átomos pesados es necesaria para la fase en cristalografía de rayos X.
- Los métodos tradicionales pueden ser laboriosos y consumir mucho tiempo.
- Las técnicas de microsíembras pueden mejorar los resultados de la cristalización.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo simplificado para la cristalización y derivatización de proteínas.
- Introducir I3C como molécula de fase para mejorar la determinación de estructuras por rayos X.
- Proporcionar un pipeline de software fácil de usar para la solución de estructuras.
Métodos utilizados
- Preparación de soluciones madre de I3C.
- Molienda de cristales de proteínas para crear microsíembras.
- Configuración de pantallas de cristalización utilizando robots de distribución de líquidos.
- Monitoreo del crecimiento de cristales y optimización de condiciones.
Resultados principales
- Generación exitosa de cristales de proteínas derivatizados.
- Mejoras en las condiciones de cristalización mediante microsíembras.
- Uso efectivo de I3C para la fase en cristalografía de rayos X.
- Automatización de partes del proceso de solución de estructuras.
Conclusiones
- El protocolo mejora la eficiencia de la cristalización de proteínas.
- La microsíembra mejora significativamente la calidad de los cristales obtenidos.
- I3C sirve como un agente de fase eficaz para la determinación estructural.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in structural biology by combining protein crystallization with heavy-atom derivatization to enable experimental phasing for novel targets. By integrating random microseed matrix screening with I3C derivatization, it reduces the number of discrete steps required to obtain phase information, accelerating early-stage target validation. The approach supports de-risking of structural hypotheses in discovery pipelines where homology models are unavailable.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables experimental phasing for novel proteins lacking homology models, supporting target validation through direct structure determination.
- Operational Value: Combines crystallization and derivatization in a single workflow, reducing hands-on time and sample handling.
- Predictive Value: The equilateral triangle arrangement of iodine atoms in I3C allows rapid validation of the anomalous substructure, increasing confidence in phased models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates derivatized crystal hits suitable for downstream data collection and phasing, enabling reliable electron density maps.
- Operational Value: Uses liquid dispensing robots to set up 96-well random microseed matrix screens, improving reproducibility and throughput.
- Scalability: Microseed stocks can be serially diluted and stored at -80°C, allowing reuse across multiple screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a path from crystallization to automated structure solution via the Auto-Rickshaw pipeline, supporting preclinical target characterization.
- Mechanistic De-risking: Successful SAD phasing using I3C-derived anomalous signal validates the structural model, reducing uncertainty in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Demonstrated on hen egg white lysozyme and Orf11 lysin domain, showing applicability to diverse protein classes including antimicrobial targets.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking crystallization to structure solution for targets requiring experimental phasing, particularly when computational methods fail due to lack of templates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D structure determination of novel proteins, clarifying binding sites and domain architecture.
- Screening: Produces reproducible crystallization conditions through microseeding, increasing hit rates for derivatized crystals as shown by 2.3- to 7-fold improvements over controls.
- Analytics: Outputs anomalous diffraction data suitable for SAD phasing, with substructure validation via I3C’s characteristic six-angstrom equilateral triangle.
- Translational Research: Connects to downstream validation through automated model building in Auto-Rickshaw, enabling progression to preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Microseed stocks and I3C protocols are standardized and storable, supporting platform reuse across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides experimental phase information, reducing reliance on molecular replacement and increasing success rate for novel targets.
- Operational Value: Streamlines workflow by combining two labor-intensive steps (crystallization and derivatization) into one integrated screen.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by enabling rapid structure determination.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target selection through high-quality, phased structures, supporting risk-adjusted advancement.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallization, microseeding, and handling of heavy atom compounds is required.
- Access to liquid dispensing robots, X-ray diffraction equipment, and structure solution software (Auto-Rickshaw, Coot) is necessary.
- Standardization across teams benefits from predefined I3C stock protocols and microseed storage procedures.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of I3C concentration to avoid precipitation, as noted for sensitive targets.
- Practical limitations include the need for initial crystal or precipitate to generate microseeds and the dependence on sufficient anomalous signal for SAD phasing.
