Preparación de conjugados de proteínas citotóxicas específicas del sitio mediante la química de maleimida-tiol y la ligadura mediada por sortasa A

Resumen

Aquí proporcionamos protocolos detallados para un marcaje específico del sitio de proteínas con fármacos citotóxicos mediante la reacción de maleimida-tiol y la ligadura mediada por la sortasa A.

Resumen

El cáncer es actualmente la segunda causa más común de muerte en todo el mundo. El sello distintivo de las células cancerosas es la presencia de proteínas marcadoras específicas, como los receptores del factor de crecimiento, en su superficie. Esta característica permite el desarrollo de terapias altamente selectivas, los bioconjugados proteicos, compuestos por proteínas diana (anticuerpos o ligandos receptores) conectadas a fármacos altamente citotóxicos por un enlazador específico. Debido a la alta afinidad y selectividad de las proteínas dirigidas, los bioconjugados reconocen las proteínas marcadoras en la superficie de las células cancerosas y utilizan la endocitosis mediada por receptores para llegar al interior de la célula. En última instancia, el sistema de transporte vesicular intracelular entrega los bioconjugados a los lisosomas, donde la proteólisis separa los fármacos citotóxicos libres del núcleo proteico de los bioconjugados, lo que desencadena la muerte de las células cancerosas dependientes de fármacos. Actualmente, existen varios bioconjugados de proteínas aprobados para el tratamiento del cáncer y un gran número está en desarrollo o ensayos clínicos.

Uno de los principales desafíos en la generación de los bioconjugados es la unión del fármaco citotóxico a la proteína diana. Los últimos años han traído un tremendo progreso en el desarrollo de estrategias químicas y enzimáticas para la modificación de proteínas con fármacos citotóxicos. Aquí presentamos los protocolos detallados para la incorporación de ojivas citotóxicas en proteínas objetivo utilizando un método químico que emplea la química de maleimida-tiol y un enfoque enzimático que se basa en la ligadura mediada por la sortasa A. Utilizamos una variante modificada del factor de crecimiento de fibroblastos 2 y una región cristalizable fragmentada de la inmunoglobulina G humana como proteínas dirigidas ejemplares y monometil auristatina E y metotrexato como fármacos citotóxicos modelo. Todas las estrategias descritas permiten la generación altamente eficiente de conjugados citotóxicos biológicamente activos de arquitectura molecular definida con potencial para el tratamiento selectivo de diversos cánceres.

Introducción

Décadas de esfuerzos científicos han llevado a un enorme avance en nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares que gobiernan el desarrollo y la progresión del cáncer. Al mismo tiempo, las posibilidades terapéuticas siguen siendo muy limitadas debido a los efectos adversos de los fármacos causados por su falta de selectividad, la gran variabilidad de los tumores y la resistencia a los fármacos que se desarrolla tras un tratamiento prolongado. Las terapias dirigidas contra el cáncer han ganado atención en los últimos años como enfoques novedosos y muy prometedores para el tratamiento de diversos tumores. Las terapias dirigidas....

Protocolo

1. Conjugación del dominio FC con MMAE

NOTA: Antes de las conjugaciones específicas del sitio, prepare los reactivos clave: proteína de alta pureza de interés (en este caso, el fragmento Fc y la variante FGF2 diseñada, como punto de partida 1-5 mg de proteína recombinante, preparada de acuerdo con Sokolowska-Wedzina¹⁸), maleimidocaproil-Val-Cit-p-aminobencil alcohol (PABC)-monometil auristatina E (MMAE) (PRECAUCIÓN, agente altamente citotóxico, manéjelo con cuidado), Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) y sortasa A¹⁶. El metotrexato unido al péptido de tet....

Resultados

Los protocolos presentados describen dos estrategias distintas para la conjugación de diferentes fármacos citotóxicos en proteínas de interés. Además, se muestra una combinación de estrategias individuales que permite generar conjugados citotóxicos duales de ojivas de una manera específica para cada sitio.

Como se muestra en los geles SDS-PAGE en la Figura 2 (carril 2 vs. 3), la reacción de maleimida-tiol permite alcanzar una eficiencia de casi el 100% para la con.......

Discusión

Debido al gran interés en el diseño de terapias selectivas contra diversos tipos de cáncer, existe una necesidad urgente de estrategias que permitan la unión específica del sitio de distintas cargas a las proteínas diana. La modificación específica del sitio de las proteínas diana es fundamental, ya que garantiza la homogeneidad de los conjugados bioactivos desarrollados, un requisito previo para la terapéutica moderna. Existen varios métodos, tanto químicos como enzimáticos, que permite.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Columna CM-Sepharose	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU	CCF100
Columna de heparina Sepharose	GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU	GE17-0407-01
HiTrap Columna de desalinización	GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU	GE17-1408-01
Columna HiTrap MabSelect SuRe	GE Healthcare, Chicago, IL, EE. UU	GE11-0034-93
maleimidocaproyl-Val-Cit-PABC-monometilauristatina E (MMAE)	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EE. UU.	HY-100374	Toxic
N,N-Dimetilacetamida (DMAc)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU	. 185884
Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU	. 646547

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