Summary
Utvärdering av motorisk återhämtning förblir riktmärket resultatet åtgärd i experimentella perifera nerv studier. Den isometriska stelkramp kraft mätning av tibialis främre muskeln i råtta är ett ovärderligt verktyg för att bedöma funktionella resultat efter återuppbyggnad av ischias nerv defekter. Metoderna och nyanserna beskrivs i den här artikeln.
Abstract
Traumatiska nerv skador resulterar i betydande funktionella förlust och segmental nerv defekter kräver ofta användning av autolog interposition nerv ympkvistar. På grund av deras begränsade tillgänglighet och tillhörande donator sida sjuklighet, många studier inom området nerv regenerering fokuserar på alternativa tekniker för att överbrygga en segmental nerv gap. För att undersöka resultaten av kirurgiska eller farmakologiska experimentella behandlingsalternativ används råtta ischias nerv modell ofta som en bioassay. Det finns en mängd olika utfallsmätningar som används i råttmodeller för att bestämma omfattningen av nervregenerering. Den maximala utdatakraften hos målmuskeln är fortfarande det mest relevanta resultatet för klinisk översättning av experimentella terapier. Isometrisk kraftmätning av stelkramp muskelkontraktion har tidigare beskrivits som en reproducerbar och giltig teknik för att utvärdera motorisk återhämtning efter nervskada eller reparation i både råtta och kanin modeller. I den här videon kommer vi att ge en steg-för-steg-instruktion av detta ovärderliga förfarande för bedömning av funktionell återhämtning av tibialis främre muskeln i en råtta ischias nerv defekt modell med hjälp av optimerade parametrar. Vi kommer att beskriva de nödvändiga pre-kirurgiska preparat utöver kirurgiska tillvägagångssätt och dissekering av gemensamma peroneal nerv och tibialis främre muskel sena. Den isometriska tetaniska kraftmätningstekniken kommer att specificeras. Bestämning av optimal muskellängd och stimulanspulsfrekvens förklaras och mätning av maximal stelkramtisk muskelkontraktion påvisas.
Introduction
Förlust av motorisk funktion efter traumatisk perifera nerv skada har en betydande inverkan på livskvalitet och socioekonomisk status hos patienter1,2,3. Prognosen för denna patientpopulation är fortfarande dålig på grund av minimala förbättringar i kirurgiska tekniker under åren4. Direkt end-to-end spänning-fria epineural reparation bildar guld standard kirurgiska återuppbyggnad. Men i fall med utökade nerv luckor interposition av en autolog nerv moderplantor har visat sig vara överlägsen5,6. Den tillhörande donator webbplats sjuklighet och begränsad tillgänglighet av autolog nerv ympkvistar har infört behovet av alternativa tekniker7,8.
Experimentella djurmodeller har använts för att belysa mekanismen för perifer nervregenerering och för att utvärdera resultaten av en mängd rekonstruktiva och farmakologiska behandlingsalternativ8,9. Råtta ischias nerv modell är den vanligaste djurmodell10. Deras lilla storlek gör dem lätta att hantera och hysa. På grund av deras superlativa neuroregenerativa potential kan den minskade tiden mellan intervention och utvärdering av resultat resultera i relativt lägre kostnader11,12. Andra fördelar med dess användning inkluderar morfologiska likheter med mänskliga nervfibrer och det höga antalet jämförande / historiska studier13. Även om det senare bör närma sig försiktigt, eftersom en mängd olika utfallsmått mellan studier gör det svårt att jämföra resultat14,15,16,17,18.
Utfallsåtgärder för att bedöma nervregenerering sträcker sig från elektrofysiologi till histomorfologi, men dessa metoder innebär ett samband men mäter inte nödvändigtvis direkt återkomsten av motoriskfunktion 14,15. Regenererande nervfibrer kanske inte gör lämpliga anslutningar som kan orsaka en överskattning av antalet funktionella anslutningar14,15,19,20. Den bästa och kliniskt mest relevanta mätningen för att påvisa korrekt återinsättning av slutorgan förblir bedömning av muskelfunktion21,22,23. Att skapa motoriska funktionsbedömningsverktyg för djurmodeller är dock utmanande. Medinaceli et al. beskrev först vandringsspåranalysen, som sedan dess har varit den vanligaste metoden för att utvärdera funktionell återhämtning i experimentella periferanervstudier 21,24,25,26,27,28. Vandringsspåranalysen kvantifierar det ischiasfunktionella indexet (SFI) baserat på mätningar av tassavtryck från gångråttor21,29. Stora begränsningar av vandringsspåranalysen, såsom tåkontrakturer, automutilation, utstryk av trycket och dålig korrelation med andra åtgärder för återinsättning, har krävt användning av andra parametrar för kvantifiering av funktionellåterhämtning 30,31.
I tidigare studier på Lewis råttor32 och Nya Zeelandkaniner 33, validerade vi den isometriska tetaniska kraften (ITF) mätning för tibialis främre (TA) muskeln och visade dess effektivitet i utvärderingen av muskelåterhämtning efter olika typer av nerv reparation34,35,36,37,38,39. TA-muskeln är väl lämpad på grund av dess relativt stora storlek, innervation av den peroneala grenen av ischiasnerven och väl belyser biokemiska egenskaper40,41,42,43. När muskellängd (förbelastningskraft) och elektriska parametrar optimeras ger ITF en variabilitet från sida till sida på 4,4% respektive 7,5% hos råttor32 respektivekaniner 33.
Denna artikel ger ett detaljerat protokoll av ITF mätning i råtta ischias nerv modell, inklusive en grundlig beskrivning av den nödvändiga pre-surgical planering, kirurgiska tillvägagångssätt och dissekering av den gemensamma peroneal nerv och distala TA muskel sena. Med hjälp av förutbestämda värden för stimulansintensiteten och varaktigheten kommer den optimala muskellängden och stimulanspulsfrekvensen att definieras. Med dessa fyra parametrar kan ITF därefter mätas konsekvent och noggrant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes med godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A334818).
1. Kalibrering av kraftgivaren
- Kontrollera att datorn är korrekt ansluten till USB-6009 multifunktionella I/O-datainsamlingsenhet (DAQ), som i sin tur ska anslutas till kraftgivaren.
OBS: Andra råttstammar och arter kan kräva en annan lastcellskraftgivare eftersom högre krafter kan förväntas 44. - Fäst en anpassad klämma från en modifierad kirurgisk hemostat på kraftgivaren som är monterad på en vakuumbasjusterbar spakarm.
OBS: Den specialtillverkade klämman består av en kirurgisk hemostat modifierad med en åtdragningsskruv som gör det möjligt att justera spänningen (figur 1). - Placera den skräddarsydda testplattformen för akrylglas, som innehåller två träblock för fixering av råtta bakbenet, på bordet.
OBS: Andra material som uretan kan också användas istället för trä så länge K-ledningarna kan tränga in och fixera. - Fäst klämman, kraftgivaren och den justerbara spakarmkombinationen vertikalt på testplattformen med hjälp av dess vakuumbas.
- Fäst en krok eller ögla på klämman för kalibreringsvikterna.
- Slå på datorn och öppna programvaran (t.ex. LabVIEW).
- När programvaran har öppnats startar du det skräddarsydda virtuella instrumentet (VI) för ITF-mätning (figur 2).
Bild 2 innehåller LabVIEW-koden i ett VI-utdrag. Det här VI-kodavsnittet kan dras till blockdiagrammet i LabVIEW. Den omvandlas automatiskt till en grafisk kod. För detta experiment fastställdes samplingshastigheten till 2000 Hz med 25 prover att läsa för varje iteration. - Kör VI genom att trycka på den vita pilen i det vänstra övre hörnet och välj Ny kalibrering. Ett nytt fönster öppnas.
- Starta kalibreringsprocessen med noll vikt (endast klämman med en fastsatt krok eller ögla) och tryck på OK.
- I följd, tillsätt 10, 20, 30 och 50 gram vikt och tryck OK mellan varje viktmätning.
- När alla fem mätningarna har samlats in klickar du på Process.
- Acceptera endast värdena om diagrammet på VI visar en positiv linjär kurva (bild 3).
- Flytta klämman, kraftgivaren och den justerbara spakarmkombinationen horisontellt på testplattformen. Detta kommer att vara den position som används för att mäta ITF.
- Klicka på Noll så stängs fönstret automatiskt.
2. Djurförsök
- Använd hanråttor som väger mellan 300-500 g.
OBS: För jämförelse av nervregenerering är det absolut nödvändigt att använda samma råttstam i både kontroll- och experimentgrupperna, eftersom vikt och incidens av autotomi är belastningsberoende och kan påverka resultaten av ITF10,32,45,46,47.
3. Kirurgisk förberedelse
- Förbered alla nödvändiga kirurgiska instrument före operationen (Table of Materials).
- Väg djuren för att bestämma den erforderliga mängden anestesi.
- Framkalla anestesi genom att placera råttan i en kammare gasad med 3% isofluran i syre.
- Bedöva råttan djupt med en cocktail av tio delar ketamin (100 mg/ml) och en del xyzin (100 mg/ml) vid en dos av 1 ml/kg kroppsvikt via en intraperitoneal injektion. Övervaka anestesins djup baserat på svaret på en tånypa och genom att observera andningshastigheten.
- Ungefär 30 minuter efter den första dosen av ketamin/xylazincocktailen, administrera en tilläggsdos på 0, 3-0, 6 ml/kg kroppsvikt av endast ketamin (100 mg/ml) intraperitoneally för att upprätthålla tillräcklig anestesi under hela proceduren, vilket definieras som en låg andningsfrekvens och ett frånvarande svar på en tånypa.
VARNING: Det är viktigt att noggrant administrera den erforderliga anestesin eftersom en överdos inte kan motverkas. - Raka försiktigt råttans bakben med elektriska klippare.
- Placera råttan i benägen position på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen vid 37 °C. Som tillval kan kroppstemperaturen övervakas med hjälp av en rektal termometer.
- Injicera 5 ml 0,9% natriumklorid (NaCl) subkutant i den lösa huden över råttans hals för att bevara en adekvat hydreringsstatus under hela proceduren.
- På grund av att detta ingrepp inte överlever måste det kirurgiska fältet och instrumenten inte vara sterila. Kirurgen bör använda personlig skyddsutrustning (PPE) och kirurgiska lupp rekommenderas för korrekt visualisering av de anatomiska strukturerna.
4. Kirurgiskt förhållningssätt till den gemensamma peronealnerven
- Placera råttan i antingen höger eller vänster lateralt liggande läge beroende på vilken sida som mäts först.
- Skapa ett 2-3 cm snitt i huden på det posterolaterala låret parallellt med lårbenet som börjar vid den större trochantern med ett kirurgiskt nr 15-blad.
- Identifiera planet mellan biceps femoris muskeln och gluteus maximus och vastus lateralis muskler och utföra en trubbig dissekering med hjälp av tenotomi sax för att separera dessa muskler och exponera den underliggande ischiasnerven.
- Lokalisera trifurcation av ischiasnerven och placera ett upprullningsdon för att få bättre åtkomst. De tre grenarna av ischiasnerven inkluderar den gemensamma peronealnerven, tibialisnerven och suralnerven.
- Isolera den gemensamma peroneal nerv grenen (vanligtvis den mest ventrala grenen) av ischiasnerven med hjälp av en krökt mikrokirurgiska tång.
OBS: I händelse av osäkerhet, stimulera försiktigt den isolerade nerven med en kirurgisk nervstimulator och observera motoriska svaret. Stimulering av den gemensamma peroneal nerven resulterar i dorsiflexion av tassen.
5. Dissekering av den distala tibialis främre muskel sena
- För att exponera TA-muskeln och dess insättning, incise huden vid den anterolateral aspekten av underbenet, börjar vid knäleden och går ner till den mediodorsala sidan av bakpotten.
- Dissekera den distala TA muskel sena från den omgivande vävnaden med hjälp av en skalpell med ett kirurgiskt blad nr 15.
- Använd myggtångor, dissekera trubbigt TA-muskelsenan mot insättningen och skär senan så distal som möjligt. Lämna den proximala TA-muskeln ostörd och bevara den neurovaskulära pedikeln.
OBS: Fukta TA-muskeln regelbundet (ungefär var 5:e minut) med uppvärmd 0,9 % NaCl (37 °C) för att förhindra kylning och avtorkning.
6. Isometrisk ttanisk kraftmätning
- Anslut de bipolära elektrodkablarna och jordkabeln enligt deras färg till en bipolär stimulatoranordning.
- Fäst den andra änden av de bipolära elektrodkablar på en subminiaturelektrod.
OBS: Referenselektroden (röd, anod) ska placeras distal och den aktiva elektroden (svart, katod) proximal. - Överför djuret tillsammans med värmedynan till testplattformen.
- Fixera råttans bakben på träblocket med två 1 mm Kirschner-ledningar genom fotleden och den laterala kondylen i det distala lårbenet och undvik den bakre aspekten av knäet.
VARNING: Undvik kärlskador på den popliteala artären och venen som är placerade dorsalt på lårbenskondylen. - Fäst en hållare med en anpassad klämma på testplattformen med hjälp av dess vakuumbas.
- Fäst den distala TA-muskelsenan på klämman som är fäst vid kraftgivaren.
OBS: Kläm- och kraftomvandlaren ska placeras parallellt med TA-muskeln. - Placera upprullningsdonet vid råttans posterolaterala lår för att komma åt den vanliga peronealnerven.
OBS: Ischiasnerven och dess grenar ska hållas fuktiga med uppvärmd 0,9% NaCl (37 °C) för att förhindra kylning och uttorkning. - Sätt in markkabeln i de omgivande musklerna (t.ex. vastus lateralis muskeln).
OBS: Grass SD9-stimulatorn kräver en jordkabel för att minska elektriska artefakter. Nyare stimulatorer kanske inte kräver en extra jordkabel. - Haka fast den gemensamma peroneala nerven på subminiaturelektroden och fäst dess position med hjälp av hållaren på plattformen (figur 4).
OBS: Se till att endast den gemensamma peronealnerven är ansluten till subminiaturelektroden. - Optimering av muskellängden
- Slå på den bipolära stimulatorenheten och justera inställningarna enligt följande: kvadratisk monofasisk puls, fördröjning 2 ms, stimulanspulsens varaktighet 0,4 ms, stimulansintensitet 2 V.
OBS: Fördröjningen bestämmer tiden mellan synkroniseringspulsen och leveransen av pulsens framkant. - Välj Parametertest och aktivera triggersamling i VI.
- Öka muskellängden (förladdningen) genom att justera spakarmen som är fäst vid kraftgivaren.
- Börja vid 10 g förladdning och använd steg om 10 g tills den maximala aktiva muskelkraften bestäms.
- För varje förladdning, applicera två enda ryckningar direkt efter varandra med hjälp av knappen på den bipolära stimulatorenheten. Utgången kommer att vara synlig på skärmen och råttan ska visa dorsiflexion av tassen.
OBS: Innan du stimulerar nerven, ta alltid bort eventuella överskott 0,9% NaCl som omger nerven med bomullsspetsade applikatorer för att säkerställa att signalen inte utförs till den omgivande vävnaden. - Om du vill stoppa mätningen träffar du Trigger-samlingen igen i VI.
- Om programmet automatiskt upptäcker de två topputgångskrafterna klickar du på Acceptera. Om programmet inte automatiskt väljer dessa utdatakrafter trycker du på Minska och väljer topparna manuellt. De två toppeffektkrafterna kommer att medelvärdet vara en genomsnittlig toppeffekt(figur 5).
- Beräkna den aktiva muskelkraften genom att subtrahera förladdningen från medelvärdet toppeffektkraften.
- Skriv ner den aktiva kraften för varje förladdning för att visualisera trenden och känna igen den maximala aktiva kraften (figur 6). Ett kalkylblad kan också användas.
- Slå på den bipolära stimulatorenheten och justera inställningarna enligt följande: kvadratisk monofasisk puls, fördröjning 2 ms, stimulanspulsens varaktighet 0,4 ms, stimulansintensitet 2 V.
- Mätning av isometrisk stelkrampkraft
- Efter att ha bestämt den idealiska muskellängden, låt muskeln vila vid noll förladdning i 5 minuter innan du börjar de stela muskelsammandragningarna.
- Under tiden, växla från parametertest till frekvenstest på VI och justera stimulansintensiteten till 10 V på den bipolära stimulatorenheten.
- Håll fördröjningen och stimulanspulsens varaktighet på 2 ms respektive 0,4 ms.
- Mät den isometriska stelkrampmuskelkraften med ökande stimulansfrekvenser från 30 Hz med steg om 30 Hz tills maximal kraftplatå observeras.
- Klicka på Trigger-insamlingen och ställ in på den förutbestämda optimala muskellängden.
- Tryck på repeat-knappen på den bipolära stimulatoranordningen för att inducera en teutanisk stimulering i högst 5 sekunder eller tills en krafttopp tydligt observeras.
OBS: Innan du stimulerar nerven, ta alltid bort eventuella överskott 0,9% NaCl som omger nerven med bomullsspetsade applikatorer för att säkerställa att signalen inte utförs till den omgivande vävnaden. - Om du vill samla in data trycker du på Utlösarsamling igen och dokumenterar den maximala utdatakraften. Om programmet inte automatiskt upptäcker maximal toppeffekt trycker du på Minska och väljer toppen manuellt.
- Låt muskeln vila igen vid noll förladdning i 5 minuter innan nästa stelkramp muskel sammandragningar.
OBS: Fukta TA-muskeln regelbundet (ungefär var 5:e minut) med uppvärmd 0,9 % NaCl (37 °C) för att förhindra kylning och uttorkning. - Fortsätt att öka stimulansfrekvensen tills den maximala kraftplatån har uppnåtts. Kraftplatån definieras som den maximala isometriska stelkrampkraften.
OBS: Ta sedan bort K-ledningarna, häftklammern eller suturen i huden och upprepa hela proceduren till den kontralaterala bakbenet, med början i steg 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fem parametrar används för att mäta ITF-mätningen. Dessa inkluderar muskelspänning (förbelastningskraft), stimulansintensitet (spänning), stimulanspulsfrekvens, stimulanstid på 0,4 ms och en fördröjning på 2 ms. Innan ITF mäts måste den optimala muskelspänningen bestämmas med hjälp av två muskelsammandragningar med en intensitet av 2 V under parametertestet. Dessa stimuli orsakar dorsiflexion av tassen och ger en utgångssignal på grafen i VI (Figur 5). Dessa enda ryckkurvor har helst en snabb vertikal uppgång som representerar sammandragningsperioden direkt följt av en långsammare vertikal minskningsperiod som visar avslappningsperioden. Programmet kommer att i genomsnitt dessa två topputgångskrafter, men den aktiva kraften måste beräknas manuellt genom att subtrahera förladdningskraften från medeleffekten. I exemplet i figur 5resulterar en förladdning på 10 g i två toppeffektkrafter på 411,09 g (4,03 N) och 379,78 g (3,73 N), vilket är i genomsnitt en genomsnittlig toppeffekt på 395,43 g (3,88 N). När de aktiva krafterna för varje förinläsning ritas upp i ett diagram kan den maximala aktiva kraften identifieras. Dessa aktiva krafter producerar vanligtvis en klockformad kurva och den maximala aktiva kraften för Lewis råttor som väger 300-500 g bör vara cirka 30-40 g (0,29-0,39 N) (Figur 6).
För de ttaniska stimuleringarna under frekvenstestet ökas stimulansintensiteten till en supra-maximal spänning (10 V) för att säkerställa maximal aktivering av alla TA-muskelmotorenheter med ökande frekvenser. Den optimala stelkramtiska kurvan ökar och minskar kraftigt och har en långsamt minskande platåfas med minimala svängningar. Figur 7 visar ett exempel på en stelkramtisk kurva med en stimulansfrekvens på 30 Hz med en isometrisk stelkrampkraft på 803,25 g (7,88 N). Den högsta kraftplatån definieras som maximal ITF.
Bild 1: Bild av anpassad klämma formad av en kirurgisk hemostat och modifierad med en åtdragningsskruv som gör det möjligt att justera spänningen.
Bild 2: Grafisk kod för virtuellt instrument för isometrisk ttanisk kraftmätning på LabVIEW. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:Kalibrering av kraftgivaren. Framgångsrik kalibrering av kraftgivaren med fem vikter (0, 10, 20, 30 och 50 g) bör resultera i en positiv linjär kurva. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Schematisk översikt överexperimentell installation för isometrisk ttanisk kraftmätning. (Upphovsrättsskyddad och använd med tillstånd från Mayo Foundation for Medical Education and Research; alla rättigheter förbehållna. Omtryckt från: Shin, R. H. et al. Isometriska tetanic kraft mätning metod för tibialis främre i råtta. Mikrokirurgi. 28 (6), 452-457 (2008)). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativa enkla ryckkurvor för optimering av muskellängd. För varje förladdningsmätning appliceras två enda ryckningar. Dessa enkla ryckkurvor har en snabb vertikal uppgång (sammandragningsperiod) följt av en vertikal minskning (avslappningsperiod). De två toppeffektkrafterna kommer att vara genomsnittliga till en genomsnittlig toppeffektkraft. I det här exemplet med en Lewis-råtta resulterar en förladdning på 10 g i två toppeffektkrafter på 411,09 g (4,03 N) och 379,78 g (3,73 N), vilket är i genomsnitt en genomsnittlig toppeffekt på 395,43 g (3,88 N). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 6:Optimal muskellängd (förladdning). Den aktiva muskelkraften kan beräknas genom att subtrahera förladdningen från medelvärdet toppeffektkraften. Den aktiva muskelkraften för varje förladdning bör dokumenteras tills en minskning av aktiv muskelkraft är synlig. Förladdningen som ger den högsta aktiva muskelkraften kommer att användas för att mäta den isometriska stelkramtiska kraften. Den optimala förladdningen för Lewis råttor som väger 300-500 g bör vara cirka 30-40 g (0,29-0,39 N) (N=10). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Representativ isometrisk stelkrampskraftkurva. Den optimala stelkrampkurvan ökar kraftigt och har sedan en långsamt minskande platåfas följt av en kraftig minskning. Den högsta kraftplatån definieras som maximal ITF. Det här exemplet visar den steltiska kurvan vid en stimulansfrekvens på 30 Hz med en isometrisk stelkrampkraft på 803,25 g (7,88 N). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en tidigare validerad metod för att förvärva exakta maximala ITF mätningar av TA muskeln i råtta modell32. Återhämtning av maximal styrka efter experimentella nerv återuppbyggnad behandlingar är av primärt intresse i den kliniska inställningen eftersom det bevisar att nerven inte bara regenereras, men också gjorde fungerande anslutningar med målmuskeln. ITF kan användas i en liten nervgap modell, såsom råtta ischias nerv modell32, och med några ändringar i protokollet, Det kan också användas i en större nerv gap kanin modell33.
Det finns flera kritiska steg som bör övervägas för att säkerställa konsekventa och tillförlitliga maximala isometriska muskelkraftmätningar. Vikten av att noggrant välja typ av anestesi för att förhindra skelettmuskulatur biverkningar har tidigare beskrivits32,33. Användningen av isofluran har visat en tidsberoende minskning av muskelkraften, vilket kan förklaras av dess förmåga att inducera sarkoplasmiskt retikulum stimulerad frisättning av kalcium33,48. Effekten av ketamin/xylazin på muskelkraften har visat sig vara minimal baserat på vår erfarenhet och tidigare studie32. Säker fastsättning av den distala TA muskelsenan till kraftgivaren är också av stor betydelse för exakta mätningar. Glidning eller rivning av senan bör förhindras eller korrigeras direkt. Därför skapades en skräddarsydd klämma från en kirurgisk hemostat och modifierades med en åtdragningsskruv. Andra forskargrupper har beskrivit en teknik för att torka senan i cirka 30 minuter för att mekaniskt stärka gränssnittet mellan senan och en klämma49. För att upprätthålla uthålligheten i muskeln är det viktigt att undvika uttorkning av TA-muskeln och senan med varm 0,9% NaCl och genomföra en 5-minuters viloperiod mellan varje ttanisk stimulering. Viloperioden baseras på fosphagensystemets verksamhet, även känd som den omedelbara energikällan, vilket är viktigt för explosiva muskelsammandragningar. Den består av adenosin tripfosfat (ATP) och kreatinfosfat aktivitet och ger energi för mindre än 10 sekunder av maximal aktivitet. Det tar cirka 3-5 minuter att fylla på 100% av fosphagens50.
Vi känner igen begränsningarna för metoden som beskrivs i den här videon. Förfarandets överlevnadskaraktär medger inte seriella mätningar över tid. Dessutom är det ett detaljerat och tidskrävande testprotokoll. Under testtiden på 1 till 2 timmar genomgår nerven och muskeln ett betydande antal stimuleringar som kan leda till muskeltrötthet med potentiell minskning av ITF. Detta har dock visat sig vara mindre framträdande i råttmodellen jämfört med kaninen33.
Sammanfattningsvis är ITF-mätningen som beskrivs i denna video ett ovärderligt verktyg i experimentella perifera nervstudier för att kvantifiera motorisk återhämtning. När presenteras med andra utfall åtgärder såsom elektrofysiologi och histomorfologi, en global bedömning av nerv funktion kan tillhandahållas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institutes of Health under Award Number RO1 NS 102360. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride | Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL, USA | G130203 | |
| 1 mm Kirshner wires | Pfizer Howmedica, Rutherford, NJ | N/A | |
| Adson Tissue Forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-6801226 | |
| Bipolar electrode cables | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Bipolar stimulator device | Grass SD9, Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Cotton-tip Applicators | Cardinal Health, Waukegan, IL, USA | C15055-006 | |
| Curved Mosquito forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | MTK-1201112 | |
| Force Transducer MDB-2.5 | Transducer Techniques, Temecula, CA | N/A | |
| Gauze Sponges 4x4 | Covidien, Mansfield, MA, USA | 2733 | |
| Ground cable | Grass Instrument, Quincy, MA | N/A | |
| Isoflurane chamber | N/A | N/A | Custom-made |
| Ketamine | Ketalar, Par Pharmaceutical, Chestnut, NJ | 42023-115-10 | |
| LabView Software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Loop | N/A | N/A | Custom-made |
| Microsurgical curved forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JFA-5B | |
| Microsurgical scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | SAS-15R-8-18 | |
| Microsurgical straight forceps | ASSI, Westbury, NY, USA | JF-3 | |
| Retractor | ASSI, Westbury, NY, USA | AG-124426 | |
| Scalpel Blade No. 15 | Bard-Parker, Aspen Surgical, Caledonia, MI, USA | 371115 | |
| Slim Body Skin Stapler | Covidien, Mansfield, MA, USA | 8886803512 | |
| Subminiature electrode | Harvard Apparatus, Holliston, MA | N/A | |
| Surgical Nerve Stimulator | Checkpoint Surgical LCC, Cleveland, OH, USA | 9094 | |
| Terrell Isoflurane | Piramal Critical Care Inc., Bethlehem, PA, USA | H961J19A | |
| Testing platform | N/A | N/A | Custom-made |
| Tetontomy Scissors | ASSI, Westbury, NY, USA | ASIM-187 | |
| Traceable Big-Digit Timer/Stopwatch | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S407992 | |
| USB-6009 multifunctional I/O data acquisition (DAQ) device | National Instruments, Austin, TX | 779026-01 | |
| Vacuum Base Holder | Noga Engineering & Technology Ltd., Shlomi, Isreal | N/A | Attached clamp is custom-made |
| Weight (10 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820010.4 | |
| Weight (20 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820020.4 | |
| Weight (50 g) | Denver Instruments, Denver, CO, USA | 820050.4 | |
| Xylazine | Xylamed, Bimeda MTC Animal Health, Cambridge, Canada | 1XYL002 |
References
- Taylor, C. A., Braza, D., Rice, J. B., Dillingham, T. The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 87 (5), 381-385 (2008).
- Huckhagel, T., Nuchtern, J., Regelsberger, J., Lefering, R., TraumaRegister, D. G. U. Nerve injury in severe trauma with upper extremity involvement: evaluation of 49,382 patients from the TraumaRegister DGU(R) between 2002 and 2015. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 26 (1), 76 (2018).
- Tapp, M., Wenzinger, E., Tarabishy, S., Ricci, J., Herrera, F. A. The Epidemiology of Upper Extremity Nerve Injuries and Associated Cost in the US Emergency Departments. Annals of Plastic Surgery. 83 (6), 676-680 (2019).
- Grinsell, D., Keating, C. P. Peripheral nerve reconstruction after injury: a review of clinical and experimental therapies. BioMed Research International. 2014, 698256 (2014).
- Terzis, J., Faibisoff, B., Williams, B. The nerve gap: suture under tension vs. graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 56 (2), 166-170 (1975).
- Millesi, H. Forty-two years of peripheral nerve surgery. Microsurgery. 14 (4), 228-233 (1993).
- Wood, M. D., Kemp, S. W., Weber, C., Borschel, G. H., Gordon, T. Outcome measures of peripheral nerve regeneration. Annals of Anatomy-Anatomischer Anzeiger. 193 (4), 321-333 (2011).
- Alvites, R., et al. Peripheral nerve injury and axonotmesis: State of the art and recent advances. Cogent Medicine. 5 (1), 1466404 (2018).
- Diogo, C. C., et al. The use of sheep as a model for studying peripheral nerve regeneration following nerve injury: review of the literature. Journal of Neurology Research. 39 (10), 926-939 (2017).
- Irintchev, A. Potentials and limitations of peripheral nerve injury models in rodents with particular reference to the femoral nerve. Annals of Anatomy. 193 (4), 276-285 (2011).
- Brenner, M. J., et al. Role of timing in assessment of nerve regeneration. Microsurgery. 28 (4), 265-272 (2008).
- Vleggeert-Lankamp, C. L. The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: a systematic review. Laboratory investigation. Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).
- Deumens, R., Marinangeli, C., Bozkurt, A., Brook, G. A. Assessing motor outcome and functional recovery following nerve injury. Methods in Molecular Biology. 1162, 179-188 (2014).
- Dellon, A. L., Mackinnon, S. E. Selection of the appropriate parameter to measure neural regeneration. Annals of Plastic Surgery. 23 (3), 197-202 (1989).
- Munro, C. A., Szalai, J. P., Mackinnon, S. E., Midha, R. Lack of association between outcome measures of nerve regeneration. Muscle Nerve. 21 (8), 1095-1097 (1998).
- Varejao, A. S., Melo-Pinto, P., Meek, M. F., Filipe, V. M., Bulas-Cruz, J. Methods for the experimental functional assessment of rat sciatic nerve regeneration. Journal of Neurology Research. 26 (2), 186-194 (2004).
- Hadlock, T. A., Koka, R., Vacanti, J. P., Cheney, M. L. A comparison of assessments of functional recovery in the rat. Journal of the Peripheral Nervous System. 4 (3-4), 258-264 (1999).
- Kanaya, F., Firrell, J. C., Breidenbach, W. C. Sciatic function index, nerve conduction tests, muscle contraction, and axon morphometry as indicators of regeneration. Plastic and Reconstructive Surgery. 98 (7), 1264-1271 (1996).
- Nichols, C. M., et al. Choosing the correct functional assay: a comprehensive assessment of functional tests in the rat. Behavioural Brain Research. 163 (2), 143-158 (2005).
- Terzis, J. K., Smith, K. J. Repair of severed peripheral nerves: comparison of the "de Medinaceli" and standard microsuture methods. Experimental Neurology. 96 (3), 672-680 (1987).
- de Medinaceli, L., Freed, W. J., Wyatt, R. J. An index of the functional condition of rat sciatic nerve based on measurements made from walking tracks. Experimental Neurology. 77 (3), 634-643 (1982).
- Doi, K., Hattori, Y., Tan, S. H., Dhawan, V. Basic science behind functioning free muscle transplantation. Clinics in Plastic Surgery. 29 (4), (2002).
- Vathana, T., et al. An Anatomic study of the spinal accessory nerve: Extended harvest permits direct nerve transfer to distal plexus targets. Clinical Anatomy. 20 (8), 899-904 (2007).
- Chaiyasate, K., Schaffner, A., Jackson, I. T., Mittal, V. Comparing FK-506 with basic fibroblast growth factor (b-FGF) on the repair of a peripheral nerve defect using an autogenous vein bridge model. Journal of Investigative Surgery. 22 (6), 401-405 (2009).
- Lee, B. K., Kim, C. J., Shin, M. S., Cho, Y. S. Diosgenin improves functional recovery from sciatic crushed nerve injury in rats. Journal of Exercise Rehabilitation. 14 (4), 566-572 (2018).
- Lubiatowski, P., Unsal, F. M., Nair, D., Ozer, K., Siemionow, M. The epineural sleeve technique for nerve graft reconstruction enhances nerve recovery. Microsurgery. 28 (3), 160-167 (2008).
- Luis, A. L., et al. Use of PLGA 90:10 scaffolds enriched with in vitro-differentiated neural cells for repairing rat sciatic nerve defects. Tissue Engineering, Part A. 14 (6), 979-993 (2008).
- Shabeeb, D., et al. Histopathological and Functional Evaluation of Radiation-Induced Sciatic Nerve Damage: Melatonin as Radioprotector. Medicina. 55 (8), Kaunas. (2019).
- Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 83 (1), 129-138 (1989).
- Monte-Raso, V. V., Barbieri, C. H., Mazzer, N., Yamasita, A. C., Barbieri, G. Is the Sciatic Functional Index always reliable and reproducible. Journal of Neuroscience Methods. 170 (2), 255-261 (2008).
- Lee, J. Y., et al. Functional evaluation in the rat sciatic nerve defect model: a comparison of the sciatic functional index, ankle angles, and isometric tetanic force. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (5), 1173-1180 (2013).
- Shin, R. H., et al. Isometric tetanic force measurement method of the tibialis anterior in the rat. Microsurgery. 28 (6), 452-457 (2008).
- Giusti, G., et al. Description and validation of isometric tetanic muscle force test in rabbits. Microsurgery. 32 (1), 35-42 (2012).
- Bulstra, L. F., et al. Functional Outcome after Reconstruction of a Long Nerve Gap in Rabbits Using Optimized Decellularized Nerve Allografts. Plastic and Reconstructive Surgery. 145 (6), 1442-1450 (2020).
- Giusti, G., et al. The influence of vascularization of transplanted processed allograft nerve on return of motor function in rats. Microsurgery. 36 (2), 134-143 (2016).
- Giusti, G., et al. The influence of nerve conduits diameter in motor nerve recovery after segmental nerve repair. Microsurgery. 34 (8), 646-652 (2014).
- Hundepool, C. A., et al. Comparable functional motor outcomes after repair of peripheral nerve injury with an elastase-processed allograft in a rat sciatic nerve model. Microsurgery. 38 (7), 772-779 (2018).
- Lee, J. Y., et al. The effect of collagen nerve conduits filled with collagen-glycosaminoglycan matrix on peripheral motor nerve regeneration in a rat model. Journal of Bone and Joint Surgery. 94 (22), 2084-2091 (2012).
- Shin, R. H., Friedrich, P. F., Crum, B. A., Bishop, A. T., Shin, A. Y. Treatment of a segmental nerve defect in the rat with use of bioabsorbable synthetic nerve conduits: a comparison of commercially available conduits. Journal of Bone and Joint Surgery. 91 (9), 2194-2204 (2009).
- Coombes, J. S., et al. Effects of vitamin E deficiency on fatigue and muscle contractile properties. Eur J Appl Physiol. 87 (3), 272-277 (2002).
- Kauvar, D. S., Baer, D. G., Dubick, M. A., Walters, T. J. Effect of fluid resuscitation on acute skeletal muscle ischemia-reperfusion injury after hemorrhagic shock in rats. Journal of the American College of Surgeons. 202 (6), 888-896 (2006).
- Murlasits, Z., et al. Resistance training increases heat shock protein levels in skeletal muscle of young and old rats. Experimental Gerontology. 41 (4), 398-406 (2006).
- Zhou, Z., Cornelius, C. P., Eichner, M., Bornemann, A. Reinnervation-induced alterations in rat skeletal muscle. Neurobiology of Disease. 23 (3), 595-602 (2006).
- Schmoll, M., et al. In-situ measurements of tensile forces in the tibialis anterior tendon of the rat in concentric, isometric, and resisted co-contractions. Physiological Reports. 5 (8), (2017).
- Heinzel, J. C., Hercher, D., Redl, H. The course of recovery of locomotor function over a 10-week observation period in a rat model of femoral nerve resection and autograft repair. Brain and Behavior. 10 (4), 01580 (2020).
- Kingery, W. S., Vallin, J. A. The development of chronic mechanical hyperalgesia, autotomy and collateral sprouting following sciatic nerve section in rat. Pain. 38 (3), 321-332 (1989).
- Weber, R. A., Proctor, W. H., Warner, M. R., Verheyden, C. N. Autotomy and the sciatic functional index. Microsurgery. 14 (5), 323-327 (1993).
- Kunst, G., Graf, B. M., Schreiner, R., Martin, E., Fink, R. H. Differential effects of sevoflurane, isoflurane, and halothane on Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Anesthesiology. 91 (1), 179-186 (1999).
- Schmoll, M., et al. A novel miniature in-line load-cell to measure in-situ tensile forces in the tibialis anterior tendon of rats. PLoS One. 12 (9), 0185209 (2017).
- Paul, R. J. Cell Physiology Source Book (Fourth Edition). Sperelakis, N. , Academic Press. 801-821 (2012).
