Summary
곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.
Abstract
사회적 행동 및 생식 분업과 같은 진사회적 곤충의 독특한 특성은 유전 시스템에 의해 제어됩니다. 유전자가 사회적 형질을 조절하는 방법을 다루기 위해 우리는 CRISPR 복합체를 세포 융합 단계에서 어린 배아에 전달하여 돌연변이 개미를 개발했습니다. 여기에서 우리는 현저한 표현형 가소성을 나타내는 포네린 개미 종인 Harpegnathos saltator에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발 프로토콜을 제공합니다. H. 소금 개미는 실험실 환경에서 쉽게 사육됩니다. 배아는 Cas9 단백질로 미세 주입하기 위해 수집되고 집에서 만든 석영 바늘을 사용하여 시험관 내에서 합성 된 작은 가이드 RNA (sgRNA)가 수집됩니다. 주입 후 배아는 식민지 외부에서 사육됩니다. 첫 번째 유충이 출현 한 후, 모든 배아와 유충은 추가 개발을 위해 몇 명의 간호 종사자와 함께 둥지 상자로 옮겨집니다. 이 프로토콜은 개미의 카스트 특이적 생리학 및 사회적 행동 분석을 위한 돌연변이 유발을 유도하는 데 적합하지만 더 넓은 범위의 hymenopteran 및 기타 곤충에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
곤충의 진사회성, 즉 Hymenoptera와 Blattodea (이전의 Isoptera)의 진화는 개인과 식민지 수준 모두에서 나타나는 독특하고 종종 정교한 행동 특성을 초래했습니다. 가장 진보 된 사회 곤충 그룹을 특징 짓는 특성 인 생식 분업은 종종 여러 행동 적으로 그리고 종종 형태 학적으로 독특한 그룹으로 구성된 카스트 제도를 포함합니다. 카스트 간의 이러한 행동 및 형태 학적 다양성은 유전 체계뿐만 아니라 종종 환경 1,2,3,4에 의해 통제되어 진생 곤충을 유전 및 후성 유전 학적 연구에 매력적인 주제로 만듭니다.
진사회적 곤충의 유전 시스템을 조작하는 능력은 많은 종들이 실험실 환경에서 짝짓기 및 번식하지 않기 때문에 어려운 것으로 입증되었습니다. 대부분의 eusocial 곤충은 또한 식민지에 생식 개체가 거의 없기 때문에 생산할 수있는 자손의 수를 제한하고 결과적으로 유전자 조작을위한 표본 크기를 제한합니다5. 또한, 많은 진사회적 곤충은 유전 연구에 일반적으로 사용되는 곤충(예: 초파리)에 비해 생성 시간이 길기 때문에유전 계통을 설정하는 데 어려움이 가중됩니다5. 그러나 일부 eusocial 종은 식민지에서 생식 활성 개체의 상당 부분을 생성 할 수 있으며, 이는 문제를 완화하고 돌연변이 또는 형질 전환 계통을 확립 할 수있는 기회를 제공합니다.
포네린 개미 종인 하르페냐토스 살타토르(Harpegnathos saltator)의 경우, 모든 여성 노동자는 여왕의 죽음이나 사회적 고립에 따라 생식 활동을 할 수 있습니다. 이러한 작업자를 "게이머게이트"라고 하며 새로운 식민지를 생성하는 데 사용할 수 있습니다6. 더욱이, 하나의 군집에 하나 이상의 게이머게이트가 존재할 수 있어서,자손 생산5,7,8을 증가시킨다. 지금까지 돌연변이 및 / 또는 형질 전환 계통은 유럽 꿀벌 인 Apis mellifera와 개미 종, H. saltator, Ooceraea biroi 및 Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15에서 개발되었습니다. . 사회적 꿀벌과 개미의 유전자 분석은 유전자와 유전자가 진사회적 곤충 행동 및 카스트 특정 생리학에 미치는 영향을 연구할 수 있는 다양한 기회를 제공하여 진사회성에 대한 더 나은 이해를 향한 길을 열었습니다.
여기에서는 H. saltator의 CRISPR / Cas9 시스템을 통한 유전자 변형 프로토콜을 제공합니다. 특히,이 기술은 모든 냄새 수용체 (OR)의 절대 공동 수용체를 암호화하는 유전자 인 orco에서 생식선 돌연변이를 생성하는 데 사용되었습니다.10. OR 유전자는 hymenopteran eusocial 곤충16에서 현저하게 확장되었으며, orco는 곤충 후각에 필수적인 역할을합니다. 부재시 OR은 정상적으로 조립되거나 작동하지 않습니다. 따라서 orco 유전자의 돌연변이는 후각 감각, 신경 발달 및 관련 사회적 행동을 방해합니다 9,10.
이 프로토콜에서는 Cas9 단백질과 소형 가이드 RNA(sgRNA)를 표적 유전자의 돌연변이 유발을 유도할 목적으로 미세 주입을 사용하여 개미 배아에 도입합니다. 여기에서는 콜로니 및 주입 된 배아의 관리에 관한 지침과 함께 미세 주입 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이러한 방법은 H. saltator 개미의 다양한 유전자에서 돌연변이 유발을 유도하는 데 적합하며 더 넓은 스펙트럼의 hymenopteran 곤충에 적용될 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 하르페냐토스 염제 식민지의 정기적인 유지 관리
- 야생형 콜로니를 22-25°C의 개미 사육실에서 투명한 플라스틱 상자에 보관하고 12시간 빛: 12시간 어두운(12L:12D) 조명 일정의 광주기를 유지합니다.
- 작은 상자 (9.5 x 9.5 cm2)를 사용하여 개별 작업자 또는 소규모 식민지를 양육하십시오. 중간 크기의 상자(19 x 13.5cm 2) 또는 큰 상자(27 x 19cm2)를 사용하여 더 큰 군체를 사육합니다(그림 1).
- 둥지 상자를 만들려면 석고를 사용하여 상자 바닥을 만드십시오. 젖은 석고가 중간 및 큰 상자에서 건조되면 거품 블록을 상자 뒤쪽에서 몇 센티미터 깊이와 몇 센티미터 깊이의 석고에 눌러 낮은 둥지 영역을 지정합니다. 석고가 마르면 지정된 둥지 부분을 정사각형 유리 조각으로 덮으십시오.
참고: 작은 상자에서는 아래쪽 둥지 영역을 지정할 필요가 없습니다. 개미가 지정된 낮은 둥지 영역을 사용하는 것을 게을리하는 경우 사각형의 빨간색 셀로판으로 유리를 덮는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이것은 H. saltator 가 야생에서 사용하는 둥지와 유사한 어두운 지하 공간의 인상을주고 새끼를 지정된 지역으로 옮기도록 장려 할 수 있습니다.
- 일주일에 두 번 살아있는 귀뚜라미로 식민지를 먹이십시오.
알림: 식민지는 다음 먹이를 먹기 전에 모든 귀뚜라미를 섭취 할 수있을만큼 충분히 먹여야합니다. 고립 된 개미와 돌연변이 개미 식민지에 매주 2-3 번 일반 식민지의 작업자가 미리 쏘인 귀뚜라미를 먹이십시오. - 세척 병을 사용하여 석고 둥지 상자 바닥에 정기적으로 물을 바르십시오.
알림: 석고는 만졌을 때 먼지가 느껴지지 않을 정도로 촉촉해야 하지만 추가된 모든 물이 석고에 흡수될 만큼 충분히 건조해야 합니다. 둥지에 과도하게 물을주지 않는 것이 중요합니다. 평균적으로 둥지 상자는 일주일에 한 번 소량의 물을 추가해야합니다. - 수유가 발생할 때마다 쓰레기와 죽은 사람을 제거하십시오. 이러한 물질을 일반 쓰레기로 폐기하기 전에 모든 폐기물과 죽은 개미를 -30°C에서 밤새 동결하십시오.
- 주기적으로 식민지에 말린 톱밥을 넣으십시오. 이것은 유충이 번데기를 겪을 때 돕고 작업자가 둥지 상자를 깨끗하게 유지하는 데 도움이됩니다.
2. 석영 유리 미세 주입 바늘의 제조
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 미세 주입 바늘을 당깁니다.
- 당길 유리를 선택합니다. 사용 중인 유리가 먼지가 없고 깨끗한 환경에 보관되었는지 확인하십시오.
참고: 여기에서는 외경 1.0mm, 내경 0.5mm, 길이 7.5cm의 얇은 벽 필라멘트 석영 유리를 사용하여 미세 주사 바늘을 생산했습니다. 연체 배아를 주사하는 경우 붕규산 바늘도 적용 할 수 있지만 붕규산 바늘은 단단한 융모막을 관통 할 수 없습니다. - 풀러의 매개변수 설정을 지정합니다. H. saltator 배아에 대한 미세 주입 바늘을 당기는 2 단계 프로세스를 사용하십시오 : 첫 번째 단계의 매개 변수에는 열 575, 필라멘트 3, 속도 35, 지연 145 및 당김 75가 포함됩니다. 두 번째 단계의 매개 변수는 열 425, 필라멘트 0, 속도 15, 지연 128 및 당김 200을 포함합니다. 두 번째 단계에 따라 결과 바늘의 테이퍼가 2mm이고 팁이 0.5μm인지 확인합니다(그림 2).
알림: 이 매개변수 세트는 다른 바늘 유형에 대한 매개변수와 함께 사용 설명서17에서 찾을 수 있습니다. 피펫 풀러에 대한 매뉴얼은 종종 다양한 기술에 대한 권장 매개 변수를 제공합니다. 특정 요구에 가장 적합한 바늘을 생성하는 매개 변수를 결정하기 위해 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다. 짧은 테이퍼는 H. saltator 배아의 단단한 융모막을 관통 할 수 있기 때문에 H. saltator 주사에 이상적입니다. 디코리온화된 배아(예: 초파리)와 같은 부드러운 배아를 주입하는 경우 약 10mm 정도 더 긴 테이퍼가 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 피펫 풀러의 작동 설명서는 일반적으로 다양한 요구에 적합한 바늘을 당기는 특정 매개 변수를 제공합니다. 유리 필라멘트를 다루고 바늘을 당기는 동안 장갑을 착용하는 것이 중요합니다. 장갑을 착용하지 않으면 맨손의 기름이 유리로 옮겨 질 수 있습니다. - 매개변수가 설정되면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 미세 주입용 바늘을 당깁니다. 바늘을 사용할 때까지 먼지가없고 깨끗한 환경에 보관하십시오.
알림: 새로 뽑은 미세 주사 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 미리 뽑은 바늘을 사용하는 경우 바늘 끝의 손상 및 잠재적 인 오염을 방지하기 위해 상자에 올바르게 보관해야합니다. 장기 보관을 거친 바늘은 배아 주사에 권장되지 않습니다.
3. 마이크로 인젝터의 제조
- 마이크로 인젝터를 사용하여 개미 배아에 원하는 재료를 주입하십시오.
- Cas9 단백질의 미세 주입 혼합물을 준비하고 시험관 내에서 합성된 소형 가이드 RNA(sgRNA)10. 미세 주사 바늘을 넣을 때까지 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 사용하지 않을 때는 미세 주입 혼합물을 -80 ° C에서 보관하십시오.
참고: 농도는 종마다 다릅니다. 고농도는 높은 사망률을 유발할 수 있지만 낮은 농도는 효율성을 감소시킬 수 있습니다. 우리는 H. saltator 배아 주입을 위해 0.2 μg / μL Cas9 단백질과 0.2 μg / μL sgRNA를 사용합니다. 우리의 sgRNA의 설계는 이전에 확립 된 프로토콜18을 따랐습니다. 유전자 서열은 DNA 데이터베이스로부터 수득하였다. H. saltator의 게놈 서열도 이전에19,20으로 보고되었습니다. - H. saltator 배아에 대한 주입 매개 변수를 조정하십시오 : 주입 압력 140 헥토 파스칼 (hPa), 일정 압력 70hPa 및 0.4 초의 시간. 재료가 한 방향으로 만 흐르도록 일정한 압력을 조정하십시오. 바늘에서 배아로 물질이 흐르지 않는 경우에만 주입 압력과 시간을 조정하십시오.
알림: 다른 유형의 배아를 주입하는 경우 변경될 수 있는 주요 매개변수는 일정한 압력이며, 이는 배아의 체액이 바늘로 다시 흐르지 않도록 하는 역할을 합니다. 이 프로토콜에서는 볼륨이 제어되지 않습니다. 마이크로 인젝터의 매개 변수를 설정하면 일관된 주사를 얻기에 충분합니다. - 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 혼합물 2μL를 마이크로주입 바늘에 넣습니다. 혼합물에 기포가 형성되지 않도록 천천히 수행하십시오.
알림: 기포가 형성되면 일관된 미세 주입을 유지하기 어려울 수 있습니다. - 좁은 테이퍼가 유지되도록 테이프 가장자리를 따라 부러뜨려 바늘 끝만 부러뜨립니다. 바늘이 끝이 열릴 정도로 부러졌는지 확인하되 테이퍼가 부러질 정도는 아닙니다.
알림: 중요한 것은 부러진 후 바늘의 구멍이 너무 넓으면 주입 압력을 가하기 전에 가압 된 마이크로 인젝터에 장착 할 때 바늘에서 액체가 흘러 나오는 것을 볼 수 있다는 것입니다. 일부 미세 주입 프로토콜은 가위로 팁을 잘라 바늘을 끊는 것이 좋습니다. 가위로 인해 바늘 끝이 부서 질 수 있으므로이 방법은 권장되지 않습니다. 부서진 바늘로 배아를 주입하는 것은 매우 해로울 것입니다. - 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착
4. 배아 주입
- 세포 융합 단계에서 미세 주입을위한 배아를 선택하십시오 : 세포질 분열없이 핵이 분열하는 발달 기간.
참고: 이것은 이전에 Drosophila21에서 발견된 바와 같이 미세 주입에 의한 게놈 편집을 위한 개발 중 이상적인 시기입니다. H. saltator 배아는 세포 융합 단계를 통과하고 난자 침착 후 약 36 시간 후에 세포화에 도달합니다10. 어린 배아가 주사에 사용되는 경우 더 높은 효율이 달성됩니다. - 양면 테이프 조각에 배아를 유리 현미경 슬라이드에 붙였습니다. 주사 중 움직임을 방지하기 위해 배아가 테이프에 잘 고정되어 있는지 확인하십시오. 배아의 측면이 테이프의 가장자리에 오도록 배아를 수직 방향으로 놓습니다 (그림 3). 슬라이드와 라이닝된 배아를 지정된 미세 주입 워크스테이션의 현미경 스테이지에 놓습니다.
알림: 매 주사마다 바늘 위치를 조정하는 대신 스테이지에서 슬라이드를 움직여 연속 주사를 수행할 수 있도록 배아를 배열하는 것이 좋습니다. 이를 통해 연속 주입을보다 효율적으로 수행 할 수 있습니다. - 바늘을 미세 조작기를 사용하여 주입할 첫 번째 배아에 맞춥니다(그림 4a).
- 현미경으로 등쪽 / 복부 축을 따라 첫 번째 배아에 바늘을 옆으로 뚫습니다.
- 미세 주입 혼합물을 주입하십시오. 주입 된 액체로 인한 내부 압력의 증가를 나타내는 배아의 약간의 움직임을 찾으십시오. 또한 배아의 외막에 눈에 보이는 미량의 조직 및/또는 지질을 포함하는 작은 물방울이 형성되는지 관찰하십시오(그림 4b).
참고: 물방울에 조직 및/또는 지질의 흔적이 있다는 것은 바늘이 배아의 융모막과 유리막 막을 성공적으로 뚫었음을 나타냅니다. 이러한 물질의 흔적이 없으면 주입이 성공적으로 수행되지 않았으므로 반복해야합니다. 몇 초 후, 물방울은 배아에 의해 재 흡수되어 더 이상 보이지 않습니다. - 즉시 배아에서 바늘을 부드럽게 제거하고 현미경 슬라이드의 위치를 조정하여 다음으로 진행하십시오. 모든 배아가 주입 될 때까지 반복하십시오.
- 슬라이드의 모든 배아가 성공적으로 주입되면 슬라이드를 습한 상자에 1시간 동안 옮겨 배아가 슬라이드에서 제거되기 전에 주입 과정에서 회복할 시간을 줍니다.
5. 주입된 배아의 사육
- 습한 상자에서 1 시간 동안 배양 한 후, 페더 급 집게를 사용하여 테이프에서 주입 된 배아를 부드럽게 제거하고 소량의 70 % 에탄올로 채워진 튜브로 옮깁니다. 배아를 튜브 바닥으로 옮기기 위해 튜브를 여러 번 뒤집습니다. 에탄올 세척을 한 번 반복 한 다음 오토 클레이브 물로 세 번 세척하십시오.
- 작고 부드러운 붓을 사용하여 주입 된 모든 배아를 2 % 항생제 항진균제가 함유 된 1 % 한천 플레이트로 옮깁니다. 항생제-항진균제를 붓고 식힌 후 한천 플레이트를 세포 스프레더를 사용하여 플레이트 표면에 퍼뜨립니다. 한천 건조를 방지하기 위해 한천 플레이트를 파라 필름으로 밀봉하십시오.
참고: 작업자가 대부분의 주입된 배아를 파괴할 수 있으므로 주사 후 주입된 배아를 식민지로 되돌리려고 시도하지 마십시오. 따라서 생존은 정상적인 식민지 환경 외부의 한천 판에서 배아가 발달하도록 허용함으로써 최적화됩니다. - 한천 플레이트를 대략 4주 동안 25°C에서 인큐베이션한다. 부화를 정기적으로 확인하십시오.
- 첫 번째 배아가 유충으로 부화하면 모든 배아와 유충을 둥지 상자에 넣고 몇 명의 젊은 간호사와 함께 부화한 새끼를 돌봅니다. 더 큰 야생형 식민지에 미리 쏘인 귀뚜라미를 사용하여 먹이를 주고, 폐기물을 제거하고, 섹션 1에서 논의된 것과 동일한 프로토콜에 따라 물을 추가합니다.
알림: 작은 상자 (9.5 x 9.5 cm2)는 이러한 식민지에 이상적입니다. H. saltator 는 포로 상태에서 잘 번식합니다. 따라서 돌연변이 배아는 성인으로 양육 될 수 있습니다. 돌연변이 성체의 분리는 생식 게이머게이트 단계로의 전환을 유도합니다. 통제 된 십자가는 이형 접합체 또는 동형 접합체 개체가있는 돌연변이 콜로니를 확립하는 데 사용됩니다 (그림 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기에 제공된 프로토콜을 사용하여 Harpegnathos saltator 배아에서 게놈 편집이 성공적으로 수행되었습니다. 이러한 결과는 중합효소 연쇄 반응 및 주입된 배아에서 추출한 DNA의 pGEM 클로닝과 DNA 시퀀싱을 통해 검증되었습니다. 이 프로토콜을 사용한 체세포 돌연변이 유발의 효율은 약 40 %에 도달했습니다. F1 돌연변이 수컷은 야생형 암컷과 교배되어 이형 접합체 F2 암컷을 생산했으며, 짝짓기하지 않으면 F3 수컷을 생산했습니다. 돌연변이 F3 수컷은 F4 동형접합체 돌연변이 암컷을 생산하기 위해 이형접합체 암컷과 교배되었다. 표적 펩티드의 부재는 이들 F4 동형접합체 여성 개체의 질량분석법을 통해 추가로 확인하였다. 날개는 미세 해부 가위를 사용하여 수컷에서 자르고 유전형 분석 목적으로 사용되었습니다. 작업자는 날개가 없기 때문에 일반적으로 실험 후 희생되고 유전형이 지정됩니다. 성공적인 돌연변이 유발의 결과로, 표적 유전자의 손실과 관련이있는 비정상적인 행동이 관찰되었다. 오르코 의 손실은 페로몬 감지 상실, 먹이를 감지할 수 없음, 번식력 저하, 식민지에서 방황하는 것과 관련된 비정상적인 행동을 초래했습니다. 또한, orco 돌연변이 개미는 냄새 수용체 뉴런 및 안테나 엽 사구체의 수가 감소하여 개미의 신경 해부학이 냄새 수용체 기능에 의존한다는 것을 시사합니다10.
그림 1: 하르페냐토스 염주 둥지. (A) H. saltator 식민지가 들어있는 19 x 13.5 cm2 둥지 상자의 외부 특징. (B) H. saltator 식민지가 들어있는 19 x 13.5 cm2 둥지 상자의 내부 특징. 정사각형 유리 조각 아래에 낮은 둥지 영역이 있는지 확인하십시오. (C) 작은 H. saltator 식민지가 들어있는 9.5 x 9.5 cm2 둥지 상자의 외부 특징. 이러한 둥지 상자는 격리 된 작업자 및 돌연변이 식민지에도 적합합니다. (D) 작은 H. saltator 식민지가 들어있는 9.5 x 9.5 cm2 둥지 상자의 내부 특징. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 하르페냐토스 솔테이터 배아 미세 주입 을 위한 바늘. 바늘의 얇은 테이퍼 (화살표로 표시)에 유의하십시오. 바늘은 팁을 약간 부러뜨려 열 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 양면 테이프에 배아의 정렬. 배아는 길이가 테이프의 긴 가장자리와 평행하도록 정렬되어야합니다. 이를 통해 스테이지에서 슬라이드를 움직여 연속 주입을 쉽게 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 미세 주입 중에 본 배아와 바늘 . (A) 주사 전에 바늘과 배아의 적절한 정렬. 바늘은 전형적인 주사 부위 인 배아 측면의 중간 지점에 수직으로 놓여 있습니다. (B) 성공적인 주사 후 배아와 바늘. 작은 물방울이 배아의 측면에서 튀어 나옵니다 (화살표로 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 기본 돌연변이 교배의 다이어그램. CRISPR은 F0 암컷의 표적 유전자에 돌연변이를 유도할 수 있으며, 이는 이후에 성인이 되면 분리되어 게이머게이트 전이를 유도합니다. 생식세포에서 돌연변이가 발생하면 짝짓기를 하지 않은 게이머게이트가 돌연변이 수컷 알을 낳을 수 있습니다. F1 돌연변이 성인 수컷은 야생형 암컷과 교배하여 이형 접합체 자손을 생성하거나 이형 접합 암컷과 교배하여 동형 접합 또는 이형 접합 자손을 생성 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
개미, 벌, 말벌, 흰개미를 포함한 곤충들 사이에서 우사회성의 진화는 새로운 행동 및 형태학적 특성의 출현을 가져왔으며, 그 중 많은 부분이 환경 및 유전적 요인의 조합에 의해 영향을 받는 것으로 이해됩니다1,2,3,4. 불행히도, 유전학 분야의 연구 모델로서의 eusocial 곤충의 매력과 유용성은이 그룹의 돌연변이 유발과 관련된 어려움으로 인해 방해 받았다. 이러한 장애는 번식 분업으로 인해 발생하며, 이는 식민지의 소수의 구성원 만 번식 할 수있는 진사회적 곤충의 핵심 특성입니다. 이 특성은 돌연변이 자손의 수에 제한을 두고 유전 계통의 발달을 어렵게 만듭니다5. 포네린 개미 종인 Harpegnathos saltator는 모든 암컷이 고립될 때 생식 게이머게이트가 될 수 있기 때문에 이러한 딜레마에 대한 해결책을 제공합니다.5. 여기에서는 배아 미세 주입을 통해 전달되는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. saltator에서 돌연변이 유발 방법을 제공합니다.
적절한 집락 유지 및 미세 주입을위한 적절한 발달 단계에서 배아의 선택이 중요합니다. 이전 연구는 곤충 발달의 세포 융합 단계가 게놈 편집을위한 이상적인 단계임을 입증했지만21, H. saltator 배아 발달에서이 단계의시기는 이전에 알려지지 않았습니다. 초기 배아 절편의 핵 염색을 통해 H. saltator 배아의 세포 융합 단계가 난자 침착 후 36 시간까지 지속된다는 것을 확인할 수 있었으며, 미세 주입을위한 새로운 배아를 선택할시기를 결정할 수있었습니다10.
바늘 당김 및 미세 주입을 위한 매개변수를 선택하는 것은 어려울 수 있습니다. 바늘 당김에 대한 매개 변수를 선택할 때 고려해야 할 요소에는 (1) 사용되는 유리의 유형, (2) 바늘의 원하는 목적, (3) 원하는 팁 크기, (4) 주사 중에 바늘이 경험하게 될 저항의 양, (5) 원하는 테이퍼 길이 및 (6) 주입 될 세포 또는 유기체의 유형이 포함됩니다. 다양한 바늘 유형을 당기는 것에 대한 제안 및 지침은 다양한 사용 설명서(17)에서 찾을 수 있습니다. 유사하게, (1) 사용되는 바늘의 크기 및 (2) 주입할 배아22를 포함하여 미세 주입을 위한 매개변수를 선택할 때 고려해야 할 요소가 있습니다. 이 프로토콜은 H. saltator 배아의 미세 주입에 초점을 맞추고 있지만, 기술은 이러한 매개 변수를 수정하여 다른 곤충에서 다를 수 있습니다. 특히, 바늘 당김 및 주입에 대한 매개 변수는 문제의 배아가 부드럽거나 쇠모 화 된 경우 다릅니다. H. saltator 배아는 거친 융모막을 가지고 있으며 짧은 테이퍼가있는 바늘 (약 2mm)을 사용할 때 주사 결과가 가장 좋습니다. 덜 단단한 융모막이 있는 배아에는 테이퍼가 더 긴 바늘(약 10mm)을 주사할 수 있습니다.
H. saltator에서 주입 된 배아는 간호 노동자에 의해 파괴 될 위험이 있기 때문에 식민지로 즉시 반환 될 수 없습니다. 이 프로토콜을 다른 사회 곤충 종에 적용하면 그렇지 않을 수 있습니다. 다른 종에서 최상의 미세 주입 후 사육 방법을 결정하려면 시행 착오가 필요할 수 있습니다. H. saltator의 경우, 배아는 부화 할 때까지 한천 판에서 양육해야합니다. 일단 부화되면, 그들은 주입 된 무리10을 돌보기 위해 몇 명의 일꾼과 함께 작은 식민지로 안전하게 돌아갈 수 있습니다. 유사한 배아 관리 방법이 불개미(Solenopsis invicta)와 클론 침입자 개미(Ooceraea biroi)에서 사용되어 주입된 배아의 생존율을 증가시킵니다9,15. 성체 폐쇄시, 성숙한 돌연변이 암컷은 생식주기를 시작하기 위해 개별적으로 또는 작은 식민지에 보관 될 수 있습니다. H. saltator 돌연변이체의 보살핌에 대한 지침이이 프로토콜에 제공되지만, 다른 종을 사용하는 경우, 주입 된 배아 및 돌연변이 성인의 보살핌에 대한 지시는 종의 필요에 맞게 수정되어야한다.
여기에 제공된 프로토콜은 특히 필수적이지 않은 유전자를 표적으로 하는 돌연변이 유발에 최적화되어 있습니다. 이 경우 orco 유전자를 표적으로 삼았고 orco의 돌연변이는 개미 가 성인이 될 때까지 생존에 영향을 미치지 않았습니다. 유사하게, 이 프로토콜은 다른 감각 수용체와 관련된 유전자를 포함하는 다른 비필수 유전자를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 표적 유전자가 필수적이라면 CRISPR 또는 트랜스포존을 통해 트랜스 제닉 개미를 대신 생성해야합니다. 트랜스포존-매개 형질전환은 꿀벌13에서 사용되었고, 개미에 적용될 수 있다. 원하는 결과가 형질 전환 유기체 인 경우, 주입 된 물질은 달라야합니다. 그러나 주입 후 프로세스는 유사하므로 원하는 결과의 차이에도 불구하고이 프로토콜의 일부 측면이 유익합니다.
전반적으로, H. saltator 는 작업자가 격리 후 번식을 시작하는 플라스틱 생식 기관으로 인해 모델 유기체로 사용하고 유전 적 교배를 수행하는 데 이상적입니다10. 이것은 이 개미 종을 CRISPR/Cas9 기술이 확립된 다른 개미, 예를 들어 모든 암컷이 클론으로 번식하는 종인 O. biroi와 구별됩니다. H. saltator 는이 종의 유전 적 혈통이 확립되고 돌연변이가 세대에 걸쳐 유지 될 수 있기 때문에 같은 종류의 유기체들 사이에서 독특한 연구 기회를 제공합니다. 이 시스템의 참신함으로 인해 연구자들은 돌연변이 개미를 생성 할뿐만 아니라 미래에 트랜스 제닉 라인을 개발할 수 있습니다. 이것은 진보 된 eusociality의 유전 적 통제를 연구하기위한 새로운 연구의 기회를 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 뉴욕 대학의 Danny Reinberg와 Claude Desplan의 실험실과 애리조나 주립 대학의 Jürgen Liebig의 실험실에 개미 유전학에 대한 지원에 감사드립니다. Hua Yan은 국립 과학 재단 I/UCRC, 보조금 번호 IIP-1821914에 따른 절지동물 관리 기술 센터 및 업계 파트너의 지원을 인정합니다. Maya Saar는 미국-이스라엘 양국 농업 연구 개발 기금, Vaadia-BARD 박사후 연구원 번호 FI-595-19의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. Drosophila Cytogenetics Protocols. , Humana Press. (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
