Summary
Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.
Abstract
Sosyal davranış ve üreme işbölümü gibi ösosyal böceklerin benzersiz özellikleri, genetik sistemleri tarafından kontrol edilir. Genlerin sosyal özellikleri nasıl düzenlediğini ele almak için, sinsityal aşamalarında genç embriyolara CRISPR kompleksinin verilmesi yoluyla mutant karıncalar geliştirdik. Burada, çarpıcı fenotipik plastisite gösteren bir ponerin karınca türü olan Harpegnathos saltator'da CRISPR aracılı mutagenezinin bir protokolünü sunuyoruz. H. tuzlayıcı karıncalar laboratuvar ortamında kolayca yetiştirilir. Embriyolar, Cas9 proteinleri ile mikroenjeksiyon için toplanır ve ev yapımı kuvars iğneleri kullanılarak in vitro sentezlenmiş küçük kılavuz RNA'lar (sgRNA'lar). Enjeksiyon sonrası embriyolar koloni dışında yetiştirilir. İlk larvaların ortaya çıkmasından sonra, tüm embriyolar ve larvalar, daha fazla gelişme için birkaç hemşirelik çalışanı ile bir yuva kutusuna taşınır. Bu protokol, karıncalarda kasta özgü fizyoloji ve sosyal davranışların analizi için mutagenezi indüklemek için uygundur, ancak daha geniş bir hymenopteran ve diğer böcek spektrumuna da uygulanabilir.
Introduction
Böceklerde ösosyalliğin, yani Hymenoptera ve Blattodea (eski adıyla Isoptera) düzenlerinin evrimi, hem birey hem de koloni seviyelerinde ortaya çıkan benzersiz ve genellikle sofistike davranışsal özelliklerle sonuçlanmıştır. En gelişmiş sosyal böcek gruplarını karakterize eden bir özellik olan üreme işbölümü, genellikle davranışsal ve genellikle morfolojik olarak ayırt edici gruplardan oluşan kast sistemlerini içerir. Kastlar arasındaki bu tür davranışsal ve morfolojik çeşitlilik sadece genetik sistemleri tarafından değil, aynı zamanda çevre 1,2,3,4 tarafından da kontrol edilir ve bu da ösosyal böcekleri genetik ve epigenetik araştırmalar için çekici konular haline getirir.
Ösosyal böceklerin genetik sistemini manipüle etme yeteneğinin, birçok türün laboratuvar ortamlarında çiftleşmediği ve üremediği için zor olduğu kanıtlanmıştır. Çoğu ösosyal böcek ayrıca bir kolonide çok az sayıda üreme bireyine sahiptir, bu da üretilebilecek yavru sayısını sınırlar ve sonuç olarak genetik manipülasyon için örneklem boyutunu sınırlar5. Ek olarak, birçok ösosyal böcek, genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan böceklere ( Drosophila gibi) kıyasla uzun nesil sürelerine sahiptir ve genetik çizgilerin oluşturulmasının zorluğuna katkıdabulunur 5. Bununla birlikte, bazı ösosyal türler, bir kolonide üreme açısından aktif bireylerin büyük bir bölümünü üretebilir, bu da zorlukları hafifletir ve mutant veya transgenik çizgiler oluşturma fırsatları sunar.
Poperin karınca türü Harpegnathos tuzlayıcısı söz konusu olduğunda, tüm kadın işçiler bir kraliçenin ölümü veya sosyal izolasyon üzerine üreme açısından aktif hale gelebilir. Bu işçilere "gamergates" denir ve yeni koloniler oluşturmak için kullanılabilir6. Ayrıca, bir kolonide birden fazla oyuncu kapısı bulunabilir, böylece yavru üretimi 5,7,8 artar. Şimdiye kadar, Avrupa bal arısı, Apis mellifera ve karınca türlerinde, H. saltator, Ooceraea biroi ve Solenopsis invicta9,10,11,12,13,14,15 mutant ve / veya transgenik çizgiler geliştirilmiştir. . Sosyal arılarda ve karıncalarda yapılan genetik analizler, ösosyalliğin daha iyi anlaşılmasına giden yolu açmış, genleri ve bunların ösosyal böcek davranışı ve kasta özgü fizyoloji üzerindeki etkilerini incelemek için bir dizi fırsat sağlamıştır.
Burada, H. saltator'daki CRISPR / Cas9 sistemi aracılığıyla genetik modifikasyon için bir protokol sağlıyoruz. Spesifik olarak, bu teknik, tüm koku verici reseptörlerin (OR'lar) zorunlu ko-reseptörünü kodlayan gen olan orco'da bir germline mutasyonu oluşturmak için kullanıldı10. OR genleri, hymenopteran eusocial böceklerinde16 önemli ölçüde genleşmiştir ve orko, böcek koku almada önemli bir rol oynamaktadır; yokluğunda, ameliyathaneler normal şekilde toplanmaz veya çalışmaz. Orko geninin mutasyonları bu nedenle koku alma hissini, sinirsel gelişimi ve ilişkili sosyal davranışları bozar 9,10.
Bu protokolde, Cas9 proteinleri ve küçük kılavuz RNA'lar (sgRNA'lar), bir hedef genin mutagenezini indüklemek amacıyla mikroenjeksiyon kullanılarak karınca embriyolarına verilir. Burada, mikroenjeksiyon prosedürünü, kolonilerin ve enjekte edilen embriyoların bakımı ile ilgili talimatlarla birlikte ayrıntılı olarak açıklayacağız. Bu yöntemler, H. tuzlayıcı karıncalarında çeşitli farklı genlerde mutagenezi indüklemek için uygundur ve daha geniş bir hymenopteran böcek spektrumuna uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Harpegnathos tuzlayıcı kolonilerinin düzenli bakımı
- H. saltator'un vahşi tip kolonilerini, 22-25 ° C'de bir karınca yetiştirme odasında şeffaf plastik kutularda ve 12 saatlik bir ışık fotoperiyodunda tutun: 12 saat karanlık (12L: 12D) aydınlatma programı.
- Bireysel işçileri veya küçük kolonileri desteklemek için küçük kutular (9,5 x 9,5cm2) kullanın. Daha büyük kolonileri desteklemek için orta boy kutular (19 x 13,5cm2) veya büyük kutular (27 x 19 cm 2) kullanın (Şekil 1).
- Yuva kutuları oluşturmak için, kutular için zemin yapmak üzere sıva kullanın. Islak sıva ortamda ve büyük kutularda kuruduğundan, daha düşük bir yuva bölgesi belirlemek için sıvaya birkaç santimetre derinliğinde ve kutunun arkasından birkaç santimetre uzakta bir köpük blok bastırın. Sıva kuruduktan sonra, belirlenen yuva bölgesini kare bir cam parçası ile örtün.
NOT: Küçük kutularda, daha düşük bir yuva bölgesi belirlemeye gerek yoktur. Karıncalar belirlenen alt yuva bölgesini kullanmayı ihmal ediyorlarsa, camın kare bir kırmızı selofan parçası ile kaplanmasına yardımcı olabilir. Bu, H. saltator'un vahşi doğada kullandığı yuvalara benzeyen karanlık bir yeraltı alanı izlenimi verir ve yavrularını belirlenen bölgeye taşımaya teşvik edebilir.
- Kolonileri haftada iki kez canlı cırcır böcekleriyle besleyin.
NOT: Koloniler, bir sonraki beslenmelerinden önce tüm cırcır böceklerini tüketecek kadar beslenmelidir. İzole edilmiş karıncaları ve mutant karınca kolonilerini, her hafta 2-3 kez düzenli bir koloninin işçileri tarafından önceden sokulmuş cırcır böcekleriyle besleyin. - Bir yıkama şişesi kullanarak alçı yuva kutusu döşemesine düzenli olarak su uygulayın.
NOT: Sıva, dokunuşa tozlu gelmeyecek kadar nemli olmalı, ancak eklenen tüm suyun sıva tarafından emileceği kadar kuru olmalıdır. Yuvaların aşırı sulanmaması önemlidir. Ortalama olarak, yuva kutuları haftada bir kez az miktarda suya ihtiyaç duyacaktır. - Beslenme gerçekleştiğinde, çöpleri ve ölü bireyleri çıkarın. Bu malzemeleri normal çöp olarak atmadan önce tüm atıkları ve ölü karıncaları gece boyunca -30 ° C'de dondurun.
- Periyodik olarak kolonilere bir tutam kurutulmuş talaş ekleyin; Bu, larvaların yavrulaşmaya maruz kalmalarına yardımcı olur ve işçilerin yuva kutusunu temiz tutmasına yardımcı olur.
2. Kuvars cam mikroenjeksiyon iğnelerinin hazırlanması
- Cam mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için bir mikropipet çektirici kullanın.
- Çekilecek camı seçin. Kullanılan camın tozsuz ve temiz bir ortamda saklandığından emin olun.
NOT: Burada, mikroenjeksiyon iğneleri üretmek için dış çapı 1,0 mm, iç çapı 0,5 mm ve uzunluğu 7,5 cm olan ince duvarlı filamentli kuvars cam kullanılmıştır. Yumuşak gövdeli bir embriyo enjekte edilirse, borosilikat iğneleri de uygulanabilir, ancak borosilikat iğneleri sert koryona nüfuz edemez. - Çektirmenin parametre ayarlarını yapın. H. tuzlayıcı embriyoları için mikroenjeksiyon iğnelerini çekmek için iki aşamalı bir işlem kullanın: ilk adım için parametreler arasında 575 ısı, 3 filament, 35 hız, 145 gecikme ve 75 çekme bulunur; İkinci adımın parametreleri arasında 425 ısı, 0 filament, 15 hız, 128 gecikme ve 200 çekme bulunur. İkinci adımı takiben, elde edilen iğnenin 2 mm'lik bir konik ve 0,5 μm'lik bir uca sahip olduğundan emin olun (Şekil 2).
NOT: Bu parametre seti, diğer iğne tipleri için parametrelerle birlikte, Kullanım Kılavuzu17'de bulunabilir. Pipet çekiciler için kılavuzlar genellikle çeşitli teknikler için önerilen parametreleri sağlar. Hangi parametrelerin belirli ihtiyaçlar için en iyi iğneleri oluşturduğunu belirlemek için bazı deneme yanılma gerekebilir. Kısa bir konik, H. tuzlayıcı embriyolarının sert koryonuna nüfuz edebildiği için H. tuzlayıcı enjeksiyonları için idealdir . Dekoryonlanmış bir embriyo gibi yumuşak bir embriyo enjekte edilirse (örneğin, Drosophila), 10 mm civarında daha uzun bir konik daha iyi sonuçlar verebilir. Pipet çekiciler için kullanım kılavuzları genellikle farklı ihtiyaçlara uygun çekme iğneleri için özel parametreler sağlar. Cam filamentleri tutarken ve iğneleri çekerken eldivenlerin giyilmesi önemlidir. Eldiven giyilmediği takdirde çıplak ellerden gelen yağlar cama geçebilir. - Parametreler ayarlandıktan sonra, mikroenjeksiyon için iğneleri çekmek üzere bir mikropipet çektirici kullanın. İğnelerin kullanılıncaya kadar tozsuz ve temiz bir ortamda muhafaza edildiğinden emin olun.
NOT: Yeni çekilmiş mikroenjeksiyon iğnelerinin kullanılması tavsiye edilir. Önceden çekilmiş iğneler kullanılıyorsa, iğne uçlarının zarar görmesini ve potansiyel kontaminasyonu önlemek için bir kutuda uygun şekilde saklanmalıdır. Uzun süreli depolamaya tabi tutulan iğneler embriyo enjeksiyonları için önerilmez.
3. Mikroenjektörün hazırlanması
- İstenilen materyalleri karınca embriyolarına enjekte etmek için bir mikroenjektör kullanın.
- Cas9 proteinlerinin mikroenjeksiyon karışımını ve in vitro sentezlenmiş küçük kılavuz RNA'ları (sgRNA'lar)10 hazırlayın. Bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleme zamanı gelene kadar karışımı buz üzerinde tutun. Kullanılmadığında, mikroenjeksiyon karışımını -80 ° C'de saklayın.
NOT: Konsantrasyonlar farklı türlerde farklılık gösterir. Yüksek konsantrasyon yüksek mortaliteye neden olabilirken, düşük konsantrasyon verimliliği azaltabilir. H. saltator embriyo enjeksiyonu için 0.2 μg/μL Cas9 proteinleri ve 0.2 μg/μL sgRNA'lar kullanıyoruz. SgRNA'larımızın tasarımı daha önce kurulmuş bir protokololan 18'i takip etti. DNA veri tabanlarından gen dizileri elde edildi. H. saltator'un genom dizisi de daha önce19,20 olarak bildirilmişti. - H. tuzlayıcı embriyoları için enjeksiyon parametrelerini ayarlayın: 140 hektopaskal (hPa) enjeksiyon basıncı, 70 hPa'lık sabit bir basınç ve 0.4 saniyelik bir süre. Sabit basıncı, malzemenin yalnızca bir yönde akacağı şekilde ayarlayın. Enjeksiyon basıncını ve süresini yalnızca iğneden embriyoya hiçbir malzeme akmıyorsa ayarlayın.
NOT: Farklı bir embriyo türü enjekte edilirse, değişebilecek birincil parametre, embriyodaki sıvının iğneye geri akmamasını sağlamaktan sorumlu olan sabit basınçtır. Bu protokolde ses seviyesi denetlenmez. Mikroenjektörün parametrelerinin ayarlanması, tutarlı enjeksiyonlar elde etmek için yeterlidir. - Mikroyükleyici pipet uçlarını kullanarak karışımın 2 μL'si olan bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Karışımda kabarcık oluşmadığından emin olmak için bunu yavaşça yapın.
NOT: Kabarcıklar oluşursa, tutarlı mikroenjeksiyonları sürdürmek zor olabilir. - Bandın kenarı boyunca kırarak iğnenin sadece ucunu kırın, böylece dar bir konik hala korunur. İğnenin, ucun açılacağı kadar kırıldığından emin olun, ancak konikliğin kırıldığı kadar değil.
NOT: Önemli olarak, iğnenin açıklığı kırıldıktan sonra çok genişse, kullanıcı enjeksiyon basıncı uygulanmadan önce basınçlı mikroenjektöre monte edildiğinde iğneden sıvı aktığını görecektir. Bazı mikroenjeksiyon protokolleri, ucu makasla keserek iğnelerin kırılmasını önerir. Makas, iğnenin ucunun parçalanmasına neden olabileceğinden bu yöntem önerilmez. Embriyoları parçalanmış bir iğne ile enjekte etmek oldukça zararlı olacaktır. - İğneyi mikromanipülatöre monte edin
4. Embriyo enjeksiyonu
- Sinsityal aşamadan mikroenjeksiyon için embriyoları seçin: çekirdeklerin sitokinezi olmadan bölündüğü gelişim sırasında geçen süre.
NOT: Bu, daha önce Drosophila21'de keşfedildiği gibi, mikroenjeksiyonla genom düzenleme için geliştirme sırasında ideal bir zamandır. H. tuzlayıcı embriyoları sinsitial aşamayı geçer ve yumurta birikimi10'dan yaklaşık 36 saat sonra selülariizasyona ulaşır. Enjeksiyonlar için daha genç embriyolar kullanılırsa daha yüksek verimlilik elde edilir. - Bir cam mikroskop slaytına yapışmış çift taraflı bir bant parçası üzerindeki çizgi embriyoları. Enjeksiyon sırasında hareketi önlemek için embriyoların banda iyi sabitlendiğinden emin olun. Embriyoları, embriyonun yanal tarafı bandın kenarında olacak şekilde dikey yönde yerleştirin (Şekil 3). Slaytı ve sıralanmış embriyoları, belirlenmiş bir mikroenjeksiyon iş istasyonunda mikroskop sahnesine yerleştirin.
NOT: Embriyoların, her enjeksiyonda iğne pozisyonunu ayarlamak yerine, slaytı sahnede hareket ettirerek ardışık enjeksiyonlar yapılabilecek şekilde düzenlenmesi önerilir. Bu, ardışık enjeksiyonların daha verimli bir şekilde yapılmasını sağlar. - İğneyi mikromanipülatör kullanılarak enjekte edilecek ilk embriyo ile hizalayın (Şekil 4a).
- İğneyi mikroskop altında dorsal / ventral ekseni boyunca ilk embriyoya lateral olarak delin.
- Mikroenjeksiyon karışımını enjekte edin. Embriyonun hafif hareketini arayın, enjekte edilen sıvı nedeniyle iç basınçta bir artış olduğunu gösterir. Ek olarak, embriyonun dış zarında gözle görülür doku ve / veya lipit izi içeren küçük bir damlacık oluşumunu izleyin (Şekil 4b).
NOT: Damlacıkta doku ve/veya lipit izi bulunması, iğnenin embriyonun hem koryonunu hem de vitelin zarını başarıyla deldiğini gösterir. Bu malzemelerin izleri mevcut değilse, enjeksiyon başarılı bir şekilde gerçekleştirilmemiştir ve tekrarlanmalıdır. Birkaç saniye sonra, damlacık embriyo tarafından yeniden emilecek ve artık görünmeyecektir. - İğneyi embriyodan derhal yavaşça çıkarın ve mikroskop slaytının konumunu ayarlayarak bir sonrakine geçin. Tüm embriyolar enjekte edilene kadar tekrarlayın.
- Slayttaki tüm embriyolar başarıyla enjekte edildikten sonra, slayttan çıkarılmadan önce embriyolara enjeksiyon işleminden iyileşmeleri için zaman tanımak için slaytı 1 saat boyunca nemli bir kutuya aktarın.
5. Enjekte edilen embriyoların yetiştirilmesi
- Nemli bir kutuda 1 saatlik inkübasyondan sonra, enjekte edilen embriyoları tüy ağırlıklı forseps kullanarak banttan yavaşça çıkarın ve az miktarda% 70 etanol ile doldurulmuş bir tüpe aktarın. Embriyoları tüpün dibine aktarmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın, ardından otoklavlanmış suyla üç yıkama yapın.
- Küçük ve yumuşak bir boya fırçası kullanarak, enjekte edilen tüm embriyoları% 2 Antibiyotik-Antimikotik ile% 1 agar plakalarına aktarın. Antibiyotik-Antimikotik'i döküldükten sonra uygulayın agar plakaları bir hücre dağıtıcı kullanılarak plakanın yüzeyine yayılarak soğutuldu. Agar kurumasını önlemek için agar plakasını parafilm ile kapatın.
NOT: Enjeksiyonlardan sonra enjekte edilen embriyoları bir koloniye geri göndermeye çalışmayın, çünkü işçiler enjekte edilen embriyoların çoğunu yok edebilir. Bu nedenle hayatta kalma, embriyoların normal koloni ortamının dışındaki agar plakalarında gelişmesine izin vererek optimize edilir. - Agar plakalarını yaklaşık 4 hafta boyunca 25 ° C'de inkübe edin. Kuluçka için düzenli olarak kontrol edin.
- İlk embriyo bir larvaya yumurtadan çıktıktan sonra, tüm embriyoları ve larvaları, yavrulara bakmak için birkaç genç hemşire işçisiyle birlikte bir yuva kutusuna geri döndürün. Daha büyük bir vahşi tip koloni tarafından önceden sokulmuş cırcır böceklerini kullanarak besleyin, atık ürünleri çıkarın ve Bölüm 1'de tartışılan aynı protokolü izleyerek su ekleyin.
NOT: Küçük kutular (9,5 x 9,5cm2) bu tür koloniler için idealdir. H. tuzlayıcı esaret altında iyi çoğalır. Bu nedenle, mutant embriyolar yetişkinliğe kadar yetiştirilebilir. Mutant yetişkinlerin izolasyonu, üreme gamergate aşamasına geçişi tetikler. Kontrollü haçlar, heterozigot veya homozigot bireylerle mutant koloniler oluşturmak için kullanılır (Şekil 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sağlanan protokol kullanılarak, Harpegnathos tuzlayıcı embriyolarında genom düzenlemesi başarıyla gerçekleştirildi. Bu sonuçlar, polimeraz zincir reaksiyonu ve enjekte edilen embriyolardan ekstrakte edilen DNA'nın pGEM klonlanması ve ardından DNA dizilimi ile doğrulandı. Bu protokolü kullanarak somatik mutagenezinin etkinliği yaklaşık% 40'a ulaştı. F1 mutant erkekleri, çiftleşmediği takdirde F3 erkekleri üreten heterozigot F2 dişileri üretmek için vahşi tip dişilerle çiftleştirildi. Mutant F3 erkekleri, F4 homozigot mutant dişileri üretmek için heterozigot dişilerle çiftleştirildi. Hedef peptidin yokluğu, bu F4 homozigot dişi bireylerin kütle spektrometrisi ile daha da doğrulandı. Kanatlar mikrodiseksiyon makası kullanılarak erkeklerden kırpıldı ve genotipleme amacıyla kullanıldı. İşçilerin kanatları olmadığı için, normalde deneylerden sonra kurban edilir ve genotiplendirilirler. Başarılı mutagenezin bir sonucu olarak, hedef genin kaybıyla ilişkili olağandışı davranışlar gözlendi. Orko kaybı , feromon algılama kaybı, avı tespit edememe, bozulmuş doğurganlık ve koloniden dolaşma ile ilgili anormal davranışlarla sonuçlandı. Ayrıca, orko mutant karıncaları, koku verici reseptör nöronlarının ve anten lob glomerüllerinin sayısının azaldığını ve karıncalarda nöroanatominin koku verici reseptör işlevselliğine bağlı olduğunu düşündürmektedir10.
Resim 1: Harpegnathos tuzlayıcı yuvaları. (A) H. tuzlayıcı kolonisi içeren 19 x 13,5cm2 yuva kutusunun dış özellikleri. (B) H. tuzlayıcı kolonisi içeren 19 x 13,5cm2'lik yuva kutusunun iç özellikleri. Kare bir cam parçasının altında daha düşük bir yuva bölgesinin varlığına dikkat edin. (C) Küçük bir H. tuzlayıcı kolonisi içeren 9,5 x 9,5cm2 yuva kutusunun dış özellikleri. Böyle bir yuva kutusu, izole işçiler ve mutant koloniler için de uygundur. (D) Küçük bir H. tuzlayıcı kolonisi içeren 9,5 x 9,5cm2'lik bir yuva kutusunun iç özellikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Harpegnathos tuzlayıcı embriyo mikroenjeksiyonu için iğne. İğnenin ince konikliğine dikkat edin (okla işaretlenmiş). İğne, ucu hafifçe kırılarak açılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Embriyoların çift taraflı bant üzerine hizalanması. Embriyolar, uzunlukları bandın uzun kenarı ile paralel olacak şekilde hizalanmalıdır. Bu, ardışık enjeksiyonların, slayt sahnede hareket ettirilerek kolaylıkla yapılmasını sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroenjeksiyon sırasında görüldüğü gibi embriyo ve iğne . (A) Enjeksiyondan önce iğnenin embriyo ile uygun şekilde hizalanması. İğne, embriyonun tarafının orta noktasına, tipik enjeksiyon bölgesine dik olarak durur. (B) Başarılı bir enjeksiyonu takiben embriyo ve iğne. Küçük bir damlacık embriyonun yanından çıkıntı yapar (bir okla işaretlenir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Temel mutant haçların diyagramı. CRISPR, F0 dişilerinde hedef gen üzerinde mutasyonlara neden olabilir, bunlar daha sonra gamergate geçişini indüklemek için yetişkinlikte izole edilir. Germline hücrelerinde mutasyonlar meydana gelirse, çiftleşmemiş oyuncu kapıları mutant erkek yumurtaları bırakabilir. F1 mutant yetişkin erkekler, heterozigot yavrular üretmek için vahşi tip dişilerle çiftleştirilebilir veya homozigot veya heterozigot yavrular üretmek için heterozigot dişilerle çiftleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karıncalar, arılar, yaban arıları ve termitler de dahil olmak üzere böcekler arasında ösosyalliğin evrimi, birçoğunun çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonundan etkilendiği anlaşılan yeni davranışsal ve morfolojik özelliklerin ortaya çıkmasına neden olmuştur 1,2,3,4. Ne yazık ki, genetik alanında araştırma modelleri olarak ösosyal böceklerin çekiciliği ve kullanışlılığı, bu gruptaki mutagenez ile ilişkili zorluklar tarafından engellenmiştir. Bu engel, bir koloninin sadece birkaç üyesinin çoğalabileceği ösosyal böceklerin önemli bir özelliği olan üreme işbölümünden kaynaklanmaktadır. Bu özellik, mutant yavruların sayısına sınırlamalar getirir ve genetik çizgilerin gelişimini5'e meydan okur. Ponerin karınca türü, Harpegnathos tuzlayıcısı, bu ikilem için bir çözüm sunar, çünkü tüm dişiler izole edildiğinde üreme oyuncu kapıları haline gelebilir5. Burada, embriyo mikroenjeksiyonu yoluyla verilen CRISPR / Cas9 sistemini kullanarak H. tuzlayıcıda mutagenez için yöntemler sunuyoruz.
Mikroenjeksiyon için uygun koloni bakımı ve embriyoların uygun gelişim aşamasında seçilmesi kritik öneme sahiptir. Önceki çalışmalar, böcek gelişimindeki sinsityal aşamanın genom düzenleme21 için ideal aşama olduğunu ortaya koymuştur, ancak H. saltator embriyonik gelişiminde bu aşamanın zamanlaması daha önce bilinmemektedir. Erken embriyo kesitlerinin nükleer boyanması yoluyla, H. saltator embriyolarındaki sinsitial aşamanın yumurta birikiminden 36 saat sonrasına kadar sürdüğünü belirleyebildik ve mikroenjeksiyon10 için yeni embriyoların ne zaman seçileceğini belirlememize izin verdik.
İğne çekme ve mikroenjeksiyon için parametrelerin seçilmesi zor olabilir. İğne çekme parametrelerini seçerken göz önünde bulundurulması gereken faktörler arasında (1) kullanılan camın tipi, (2) iğnenin istenen amacı, (3) istenen uç boyutu, (4) iğnenin enjeksiyon sırasında yaşayacağı direnç miktarı, (5) istenen konik uzunluk ve (6) enjekte edilecek hücre veya organizma tipi bulunur. Çeşitli iğne tiplerinin çekilmesi için öneriler ve yönergeler çeşitli kullanım kılavuzlarında bulunabilir17. Benzer şekilde, (1) kullanılan iğnenin boyutu ve (2) enjekte edilecek embriyolar22 dahil olmak üzere mikroenjeksiyon için parametreler seçerken göz önünde bulundurulması gereken faktörler vardır. Bu protokol H. saltator embriyolarında mikroenjeksiyona odaklanırken, teknikler bu parametrelere modifikasyonla diğer böceklerde değişebilir. Özellikle, iğne çekme ve enjeksiyon parametreleri, söz konusu embriyo yumuşak veya dekoriyonize ise farklılık gösterecektir. H. tuzlayıcı embriyoları sert bir koryona sahiptir ve enjeksiyon sonuçları kısa konikli bir iğne kullanıldığında (yaklaşık 2 mm) en iyisidir. Daha az sıkı koryona sahip embriyolara, daha uzun incelmeli (yaklaşık 10 mm) iğneler enjekte edilebilir.
H. saltator'da, enjekte edilen embriyolar hemen bir koloniye geri gönderilemez, çünkü bunu yapmak hemşirelik çalışanları tarafından yok edilme riski taşır. Bu protokolü diğer sosyal böcek türlerine uygularsanız, durum böyle olmayabilir. Diğer türlerde mikroenjeksiyon sonrası en iyi yetiştirme yöntemlerinin belirlenmesi bazı deneme yanılma gerektirebilir. H. saltator durumunda, embriyoların yumurtadan çıkana kadar agar plakaları üzerinde yetiştirilmesi gerekir. Yumurtadan çıktıktan sonra, enjekte edilen yavru10'a bakmak için birkaç işçiyle küçük bir koloniye güvenli bir şekilde geri gönderilebilirler. Benzer bir embriyo bakım yöntemi, enjekte edilen embriyoların hayatta kalma oranını artırmak için ateş karıncalarında (Solenopsis invicta) ve klonal akıncı karıncalarda (Ooceraea biroi) kullanılmaktadır 9,15. Yetişkin eklosyonu üzerine, olgun mutant dişiler üreme döngülerine başlamak için bireysel olarak veya küçük kolonilerde tutulabilir. H. saltator mutantlarının bakımı için talimatlar bu protokolde verilmiştir, ancak farklı bir tür kullanılıyorsa, enjekte edilen embriyoların ve mutant yetişkinlerin bakımı için talimatlar, türlerin ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilmelidir.
Burada sağlanan protokol, özellikle gerekli olmayan genlerin hedeflendiği mutagenez için optimize edilmiştir. Bu durumda, orco geni hedeflendi ve orco'daki mutasyonlar karınca sağkalımını yetişkinliğe kadar etkilemedi. Benzer şekilde, bu protokol, diğer duyusal reseptörlerle ilişkili olanlar da dahil olmak üzere diğer gerekli olmayan genleri hedeflemek için kullanılabilir. Hedef gen gerekliyse, transgenik karıncaların bunun yerine CRISPR veya transpozon yoluyla üretilmesi gerekecektir. Transpozon aracılı transgenez, bal arılarındakullanılmıştır 13 ve karıncalar için geçerli olabilir. İstenilen sonuç transgenik organizmalar ise, enjekte edilen materyallerin farklı olması gerekecektir. Bununla birlikte, enjeksiyon sonrası süreçler benzer olacaktır ve bu nedenle istenen sonuçtaki farklılığa rağmen bu protokolün bazı yönleri faydalı olacaktır.
Genel olarak, H. saltator , işçilerin izolasyondan sonra üremeye başladığı plastik üreme sistemi nedeniyle model bir organizma olarak kullanım ve genetik haçların performansı için idealdir10. Bu, bu karınca türünü, CRISPR / Cas9 teknolojisinin kurulduğu diğer karıncalardan, örneğin tüm dişilerin klonal olarak çoğaldığı bir tür olan O. biroi'den ayırır. H. saltator , genetik soylar kurulabildiği ve mutasyonlar bu türdeki nesiller boyunca korunabildiği için türünün organizmaları arasında benzersiz araştırma fırsatları sunar. Bu sistemin yeniliği, araştırmacıların sadece mutant karıncalar üretmelerini değil, aynı zamanda gelecekte transgenik çizgiler geliştirmelerini de sağlar. Bu, gelişmiş ösosyalliğin genetik kontrolünü incelemek için yeni araştırmalar için fırsatlar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Danny Reinberg ve Claude Desplan'ın New York Üniversitesi'ndeki laboratuvarlarına ve Jürgen Liebig'in Arizona Eyalet Üniversitesi'ndeki laboratuvarına karınca genetiği konusundaki destekleri için teşekkür ediyor. Hua Yan, Ulusal Bilim Vakfı I / UCRC'den, IIP-1821914 Hibe No. IIP-1821914 kapsamında Eklembacaklı Yönetim Teknolojileri Merkezi'nden ve endüstri ortaklarından destek aldığını kabul ediyor. Maya Saar, Amerika Birleşik Devletleri - İsrail İki Uluslu Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu, Vaadia-BARD Doktora Sonrası Burs No. FI-595-19 tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush - Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. Drosophila Cytogenetics Protocols. , Humana Press. (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
