Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

Thais Bascuas; Martina Kropp; Nina Harmening; Mohammed Asrih; Zsuzsanna Izsvák; Gabriele Thumann

doi:10.3791/61957

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Artículo de método

Inducción y análisis del estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias de la retina humana transfectadas por transposones de la bella durmiente

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DOI:

10.3791/61957

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11 de diciembre de 2020

Thais Bascuas¹^,² , Martina Kropp¹^,² , Nina Harmening¹^,² , Mohammed Asrih¹ , Zsuzsanna Izsvák³ , Gabriele Thumann¹^,²

¹Experimental Ophthalmology, University of Geneva, ²Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, ³Max Delbrück Center for Molecular Medicine

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para el desarrollo y uso de un modelo de estrés oxidativo mediante el tratamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina con H₂O_2,analizando la morfología celular, la viabilidad, la densidad, el glutatión y el nivel de UCP-2. Es un modelo útil para investigar el efecto antioxidante de las proteínas secretadas por las células transfectadas por transposones para tratar la degeneración neurorretiniana.

Resumen

El estrés oxidativo juega un papel crítico en varias enfermedades degenerativas, incluida la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), una patología que afecta a ~ 30 millones de pacientes en todo el mundo. Conduce a una disminución de los factores neuroprotectores sintetizados por el epitelio pigmentario de la retina (EPR), por ejemplo, el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), seguido de la pérdida de células RPE y, finalmente, la muerte de células fotorreceptoras y ganglionares retinianas (RGC). Planteamos la hipótesis de que la reconstitución del ambiente retiniano neuroprotector y neurogénico mediante el trasplante subretiniano de células RPE transfectadas que sobreexpresan PEDF y GM-CSF tiene el potencial de prevenir la degeneración retiniana al mitigar los efectos del estrés oxidativo, inhibir la inflamación y apoyar la supervivencia celular. Utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB100X),las células RPE humanas se han transfectado con los genes PEDF y GM-CSF y han demostrado una integración génica estable, expresión génica a largo plazo y secreción de proteínas utilizando qPCR, western blot, ELISA e inmunofluorescencia. Para confirmar la funcionalidad y la potencia del PEDF y GM-CSF secretados por las células RPE transfectadas, hemos desarrollado un ensayo in vitro para cuantificar la reducción del estrés oxidativo inducido por H₂O₂en células RPE en cultivo. La protección celular se evaluó mediante el análisis de la morfología celular, la densidad, el nivel intracelular de glutatión, la expresión del gen UCP2 y la viabilidad celular. Tanto las células RPE transfectadas que sobreexpresan PEDF y/o GM-CSF como las células no transfectadas pero pretratadas con PEDF y/o GM-CSF (disponibles comercialmente o purificadas a partir de células transfectadas) mostraron una protección celular antioxidante significativa en comparación con los controles no tratados. El presente modelo H₂O₂es un enfoque simple y efectivo para evaluar el efecto antioxidante de factores que pueden ser efectivos para tratar la DMAE o enfermedades neurodegenerativas similares.

Introducción

El modelo descrito aquí, ofrece un enfoque útil para evaluar la eficiencia de los agentes biofarmacéuticos para reducir el estrés oxidativo en las células. Hemos utilizado el modelo para investigar los efectos protectores del PEDF y GM-CSF sobre el estrés oxidativo mediado por H₂O₂sobre las células epiteliales pigmentarias de la retina, que están expuestas a altos niveles de O₂y luz visible, y la fagocitosis de las membranas del segmento externo fotorreceptor, generando niveles significativos de especies reactivas de oxígeno (ROS)¹^, ². Se consideran un importante contribuyente....